레이저가 없는 하이드록실 라디칼 단백질 발자국은 단백질의 고주 구조 분석을 수행합니다.
Summary
이 프로토콜은 플래시 산화 단백질 발자국을 수행하기 위해 인라인 라디칼 도시메트리와 플라즈마 광원을 사용하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 단백질 연구의 빠른 광화학 산화의 재현성을 단순화하고 개선하기 위해 위험한 UV 레이저를 대체합니다.
Abstract
하이드록실 라디칼 단백질 발자국(HRPF)은 단백질 구조, 단백질 단백질 상호 작용 또는 단백질 리간드 상호 작용의 변화에 대한 정보를 제공하는 신흥 및 유망한 고주 구조 분석 기술입니다. HRPF는 하이드록실 라디칼(▪ OH)을 사용하여 단백질의 용매 접근 표면을 돌이킬 수 없이 라벨을 붙입니다. HRPF 수행의 내재된 복잡성, 비용 및 위험성은 바이오 제약분야에서 광범위하게 채택되는 것을 실질적으로 제한했습니다. 이러한 요인은 다음과 같습니다 : 1) 상당한 안전 예방 조치를 요구하는 복잡하고 위험하며 비싼 레이저의 사용; 및 2) 비교 연구를 제한하는 ▪OH의 배경 청소에 의한 HRPF의 불경한. 이 간행물은 레이저가 없는 HRPF 시스템의 작동을 위한 프로토콜을 제공합니다. 이 레이저 없는 HRPF 시스템은 라인 라디칼 도시트라이를 갖춘 고에너지 고압 플라즈마 광원 플래시 산화 기술을 활용합니다. 플라즈마 광원은 레이저 기반 HRPF 시스템보다 하이드록실 라디칼을 생성하는 데 더 안전하고 사용하기 쉬우며 효율적이며, 인라인 라디칼 도지미터는 연구의 재현성을 증가시킵니다. 레이저가 없는 HRPF 시스템은 레이저 기반 기술의 언급된 단점과 한계를 해결하고 극복합니다.
Introduction
단백질 형태 및 관련 고차 구조(HOS)는 적절한 생물학적 기능 및 비정상적인 동작 1의 주요결정요인이다. 구조와 기능 활동이 생산 및 환경의 다양한 측면에 의존하는 바이오 의약품도 마찬가지입니다. HOS의 바이오 의약품 변화는 바람직하지 않은 약리학 및 환자 면역 학적 반응2,3에기인하는 불리한 약물 반응 (ADR)에 연결되었습니다. ADRs의 출현은 바이오 제약 업계에 단백질 HOS가 생물 치료제의 안전성과 효능에서 중요한 역할을 하고 있으며, 새롭고 향상된 HOS 분석4의필요성을 확립했습니다.
하이드록실 라디칼 단백질 발자국(HRPF)은 단백질 HOS의 변화를 추적하는 유망한 기술입니다. HRPF는 단백질5,6,7의용매 접근 표면을 확인하기 위해 질량 분석법 (MS) 분석을 따르는 ▪OH를 가진 단백질의 외관의 돌이킬 수없는 라벨링을 포함한다. HRPF는 단백질 HOS 및 그 기능8,9에서결함을 검출하는 데 성공적으로 사용되었으며, 단일 클론 항체 (mAb)10,11,12,13의HOS를 특성화하고 리간드14의결합 Kd를 결정하고15,16,17,18,19. HRPF에 대한 ▪OH를 생성하는 일반적인 방법은 H 2O2의사진 에서 ▪OH를 생산하기 위해 고에너지, 빠른 UV 레이저를 사용하는 단백질 (FPOP)의 빠른 광화학 산화입니다. 대부분의 경우, FPOP는 호흡기 및 눈 손상을 피하기 위해 상당한 안전 장치를 요구하는 유해 가스 (KrF)를 사용하는 고가의 엑시머 레이저를사용합니다(20). 흡입 위험을 피하기 위해 다른 사람들은 독성 가스사용을 없애고 상당한 운영 전문 지식을 필요로 하며 눈 손상으로부터 사용자를 보호하기 위해 광범위한 길잃은 광 제어를 요구하는 주파수 네이드뮴 이트리움 알루미늄 가넷(Nd:YAG)레이저(21)를사용했습니다.
충분한 정보는 HRPF를 사용하여 얻을 수 있지만, 바이오 제약에서 광범위한 채택은 충족되지 않았습니다. 제한된 HRPF 채택을위한 두 가지 장벽은 다음과 같습니다 : 1) 상당한 안전 예방 조치를 요구하는 위험하고 비싼 레이저의 사용20; 및 2) 비교연구(22)를제한하는 ▪OH의 배경 청소에 의한 HRPF의 불경성. 레이저 사용을 대체하기 위해 고속, 고에너지 플라즈마 플래시 사진 용해 장치가 개발되어 FPOP를 용이하게 하는 방식으로 안전하게 수행했습니다. HRPF 실험의 불가능성을 개선하기 위해 실시간 라디칼 도시메트리가 구현됩니다.
HRPF의 관행은 ▪OH22의배경 청소에 기인하는 불경한 성에 의해 제한되었습니다. ▪OH는 단백질 지형의 우수한 프로브이지만, 그들은 또한 준비에서 발견 된 많은 성분과 반응하여 표적 단백질을 산화할 수있는 급진적 인 활성농도를 측정할 필요가 있습니다. 완충 제제, 과산화수소 농도, 리간드 특성 또는 광석의 변화는 HOS 차동 연구에서 모호성을 생성하는 대조군과 실험 군 간의 산화 차이를 초래할 수 있다. 실시간 라디칼 도시메트리를 첨가하면 OH 하중▪효과를 조정할 수 있으므로 HRPF 실험 중 신뢰와 재현성을 증가시킵니다. FPOP에서 급진적 인 dosimetry의 사용은 다른 곳에서 설명되었다23,24,25,그리고 최근 간행물 에서 자세히논의된다 26. 여기서, 우리는 새로운 플래시 사진 분석 시스템과 실시간 dosimetry의 사용을 설명하여 말 아포-묘글로빈(aMb)을 라벨링하여, FPOP 실험에서 펩티드 산화 수준을 엑시머 레이저를 사용할 때 얻은 것과 비교합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
HRPF 실험 중에 단백질의 적절한 라벨링을 보장하기 위한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 적절한 유량 및 소스 플래시 레이트가 선택되어 시료의 각 볼러스가 한 번 조사되도록 합니다. 이것은 단백질이 새로 형성된 ▪OH의 단 하나 bolus에 드러나는 것을 보장합니다. 단백질이 산화되면, 더 높은 차순 단백질 구조를 변경할 수 있습니다. 네이티브 단백질 구조가 조사되고 있다고 확신…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 일반 의학의 국립 연구소에 의해 투자되었다 (R43GM125420 및 R44GM125420).
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
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