Pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser para realizar análises estruturais de proteínas de ordem superior
Summary
Este protocolo apresenta um método para usar a dosimetria radical inline e uma fonte de luz plasmática para realizar a pegada de proteína de oxidação flash. Este método substitui o perigoso laser UV para simplificar e melhorar a reprodutibilidade da oxidação fotoquímica rápida de estudos proteicos.
Abstract
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) é uma técnica emergente e promissora de análise estrutural de ordem superior que fornece informações sobre mudanças na estrutura proteica, interações proteína-proteína ou interações proteína-ligand. O HRPF utiliza radicais hidroxil(▪OH) para rotular irreversivelmente a superfície acessível de solvente de uma proteína. A complexidade inerente, o custo e a natureza perigosa do desempenho do HRPF limitaram substancialmente a adoção ampla na biopharma. Esses fatores incluem: 1) o uso de lasers complicados, perigosos e caros que exigem precauções substanciais de segurança; e 2) a irreprodutibilidade do HRPF causada pela limpeza de fundo de ▪OH que limitam estudos comparativos. Esta publicação fornece um protocolo para o funcionamento de um sistema HRPF sem laser. Este sistema HRPF sem laser utiliza uma tecnologia de oxidação de flash de fonte de luz de plasma de alta energia e alta pressão com dosimetria radical em linha. A fonte de luz plasmática é mais segura, fácil de usar e mais eficiente na geração de radicais hidroxílicos do que os sistemas HRPF baseados em laser, e o dosímetro radical em linha aumenta a reprodutibilidade dos estudos. Combinado, o sistema HRPF sem laser aborda e supera as deficiências e limitações mencionadas das técnicas baseadas em laser.
Introduction
A conformação proteica e a estrutura de ordem superior associada (HOS) são os principais determinantes da função biológica adequada e do comportamento aberrante1. O mesmo se aplica aos biofarmacêuticos, cuja estrutura e atividade funcional dependem de vários aspectos de sua produção e ambiente. A mudança biofarmacêutica no HOS tem sido associada a reações adversas de medicamentos (ADR) atribuídas à farmacologia indesejável e à resposta imunológica do paciente2,3. O aparecimento de ADRs alertou a indústria biofarmacêutica para o papel crítico que o HOS proteico desempenha na segurança e eficácia da bioterapêutica, e eles estabeleceram a necessidade de novas e melhoradas análises hos4.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) é uma técnica promissora para acompanhar a mudança no HOS proteico. O HRPF envolve a rotulagem irreversível do exterior de uma proteína com ▪OH seguido de análise de espectrometria de massa (MS) para identificar a superfície acessível solvente da proteína5,6,7. O HRPF tem sido usado com sucesso para detectar defeitos na proteína HOS e sua função8,9, caracterizar o HOS de anticorpos monoclonais (mAb)10,11,12,13, determinar a vinculação Kd de um ligante14, e muito mais15,16,17,18,19. Um método comum para gerar o ▪OH para HRPF é a Oxidação Fotoquímica Rápida de Proteínas (FPOP), que emprega lasers UV rápidos e de alta energia para produzir ▪OH a partir da fotolise de H2O2. Em sua maioria, o FPOP usa lasers excimer caros que empregam gás perigoso (KrF) que exigem salvaguardas substanciais para evitar lesões respiratórias e oculares20. Para evitar riscos de inalação, outros usaram lasers de alumínio de neodímio quadruplicado (Nd:YAG)lasers 21, que elimina o uso de gás tóxico, mas ainda são caros, exigem uma experiência operacional significativa e exigem extensos controles de luz desviadas para proteger os usuários contra lesões oculares.
Embora informações amplas possam ser obtidas por meio do HRPF, a ampla adoção na biopharma não foi atendida. Duas barreiras para a adoção limitada do HRPF incluem: 1) o uso de lasers perigosos e caros que exigem precauções de segurança substanciais20; e 2) a irreprodutibilidade do HRPF causada pela limpeza de fundo de ▪OH que limitam estudos comparativos22. Para suplantar o uso de laser, uma unidade de fotolise flash de plasma de alta velocidade e alta energia foi desenvolvida para realizar o FPOP com segurança de forma fácil. Para melhorar a irreprodutividade dos experimentos do HRPF, a dosimetria radical em tempo real é implementada.
A prática do HRPF tem sido limitada pela irreprodutividade atribuída à limpeza de fundo de ▪OH22. Embora ▪OH sejam excelentes sondas de topografia proteica, elas também reagem com muitos constituintes encontrados nas preparações, tornando necessário medir a concentração efetiva de radicais disponíveis para oxidar uma proteína alvo. Variações na preparação de tampão, concentração de peróxido de hidrogênio, propriedades de ligante ou fotolise podem resultar em diferenças de oxidação entre o controle e grupos experimentais que criam ambiguidade em estudos diferenciais de HOS. A adição de dosimetria radical em tempo real permite o ajuste do efeito ▪carga OH e, portanto, aumenta a confiança e a reprodutibilidade durante um experimento de HRPF. O uso da dosimetria radical no FPOP foi descrito em outros lugares23,24,25, e é ainda discutido em detalhes em uma publicação recente26. Aqui, descrevemos o uso de um novo sistema de fotolise flash e dosimetria em tempo real para rotular apo-mioglobina equina (aMb), comparando níveis de oxidação de peptídeos em um experimento FPOP ao obtido ao usar um laser excimer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem várias etapas críticas para garantir a rotulagem adequada de proteínas durante qualquer experimento hrpf. Primeiro, uma taxa de fluxo apropriada e a taxa de flash de origem são selecionadas para garantir que cada bolus da amostra seja irradiado uma vez. Isso garante que a proteína seja exposta a um único bolus de recém-formado ▪OH. Uma vez que uma proteína é oxidada, a estrutura proteica de ordem mais alta pode ser alterada. Para ter certeza de que a estrutura proteica nativa é sondada, cad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (R43GM125420 e R44GM125420).
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
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