Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Laservrije hydroxyl radicale eiwitvoetafdruk om structurele analyse van eiwitten in hogere orde uit te voeren

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/61861
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 2
1GenNext Technologies Inc., 2Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, University of Mississippi, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi

Summary

Dit protocol presenteert een methode om inline radicale dosimetrie en een plasma lichtbron te gebruiken om flash oxidatie eiwit footprinting uit te voeren. Deze methode vervangt de gevaarlijke UV-laser om de reproduceerbaarheid van snelle fotochemische oxidatie van eiwitstudies te vereenvoudigen en te verbeteren.

Abstract

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is een opkomende en veelbelovende hogere orde structurele analysetechniek die informatie biedt over veranderingen in eiwitstructuur, eiwit-eiwit interacties of eiwit-ligand interacties. HRPF maakt gebruik van hydroxylradicalen(▪OH) om het oplosmiddeltoegankelijke oppervlak van een eiwit onomkeerbaar te labelen. De inherente complexiteit, kosten en gevaarlijke aard van het uitvoeren van HRPF hebben een aanzienlijk beperkte brede acceptatie in biopharma. Deze factoren omvatten: 1) het gebruik van gecompliceerde, gevaarlijke en dure lasers die aanzienlijke veiligheidsmaatregelen vereisen; en 2) de onherproduceerbaarheid van HRPF veroorzaakt door achtergrondopruiming van ▪OH die vergelijkende studies beperken. Deze publicatie biedt een protocol voor de werking van een laservrij HRPF-systeem. Dit laservrije HRPF-systeem maakt gebruik van een hoge energie, hoge druk plasma lichtbron flash oxidatie technologie met in-line radicale dosimetrie. De plasmalichtbron is veiliger, gemakkelijker te gebruiken en efficiënter in het genereren van hydroxylradicalen dan lasergebaseerde HRPF-systemen, en de in-line radicale dosimeter verhoogt de reproduceerbaarheid van studies. Gecombineerd pakt het laservrije HRPF-systeem de genoemde tekortkomingen en beperkingen van lasergebaseerde technieken aan en overtreft het deze.

Introduction

Eiwitconformatie en bijbehorende hogere ordestructuur (HOS) zijn de belangrijkste determinanten van een goede biologische functie en afwijkend gedrag1. Hetzelfde geldt voor biofarmaceutica, waarvan de structuur en functionele activiteit afhankelijk zijn van verschillende aspecten van hun productie en omgeving. Biofarmaceutische veranderingen in HOS zijn gekoppeld aan bijwerkingen (ADR) toegeschreven aan ongewenste farmacologie en immunologische respons van de patiënt2,3. Het verschijnen van ADR's heeft de biofarmaceutische industrie gewaarschuwd voor de cruciale rol die eiwit-HOS speelt in de veiligheid en werkzaamheid van biotherapeutica, en ze hebben de behoefte aan nieuwe en verbeterde HOS-analyses vastgesteld4.

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is een veelbelovende techniek om de verandering in eiwit HOS te volgen. HRPF omvat de onomkeerbare etikettering van de buitenkant van een eiwit met ▪OH gevolgd door massaspectrometrie (MS) analyse om het oplosmiddel toegankelijke oppervlak van het eiwit5,6,7te identificeren . HRPF is met succes gebruikt om defecten in eiwit HOS en zijn functie te detecteren8,9, karakteriseren de HOS van monoklonale antilichamen (mAb)10,11,12,13, bepalen de binding Kd van een ligand14, en nog veel meer15,16,17,18,19. Een veel voorkomende methode om de ▪OH voor HRPF te genereren is Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP), die gebruik maakt van energierijke, snelle UV-lasers om ▪OH te produceren uit fotolyse van H2O2. FPOP maakt voor het grootste deel gebruik van dure excimerlasers die gevaarlijk gas (KrF) gebruiken en die aanzienlijke waarborgen vereisen om ademhalings- en oogletsel te voorkomen20. Om inhalatiegevaren te voorkomen, hebben anderen frequentie verviervoudigde neodymium yttrium aluminium granaat (Nd:YAG) lasers21gebruikt, die het gebruik van giftig gas elimineert, maar nog steeds duur is, aanzienlijke operationele expertise vereist en uitgebreide verdwaalde lichtcontroles vereist om gebruikers te beschermen tegen oogletsel.

Hoewel er voldoende informatie kan worden verkregen met behulp van HRPF, is niet voldaan aan een brede acceptatie in biofarma. Twee barrières voor de beperkte HRPF-goedkeuring zijn: 1) het gebruik van gevaarlijke en dure lasers die aanzienlijke veiligheidsmaatregelen vereisen20; en 2) de onherproduceerbaarheid van HRPF veroorzaakt door achtergrondopruiming van ▪OH die vergelijkende studies beperken22. Om lasergebruik te verdringen, werd een high-speed, high energy plasmaflitser fotolyse-eenheid ontwikkeld om FPOP veilig op een facile manier uit te voeren. Om de onherproductieve hrpf-experimenten te verbeteren, wordt real-time radicale dosimetrie geïmplementeerd.

De praktijk van HRPF is beperkt door onherkenbaarheid toegeschreven aan achtergrondopruiming van ▪OH22. Hoewel ▪OH uitstekende sondes van eiwittopografie zijn, reageren ze ook met veel bestanddelen die in preparaten worden aangetroffen, waardoor het noodzakelijk is om de effectieve concentratie van radicalen te meten die beschikbaar is om een doeleiwit te oxideren. Variaties in buffervoorbereiding, waterstofperoxideconcentratie, ligandeigenschappen of fotolyse kunnen leiden tot oxidatieverschillen tussen controle- en experimentele groepen die ambiguïteit creëren in HOS-differentiaalstudies. De toevoeging van real-time radicale dosimetrie maakt het mogelijk om het effect ▪ OH-belasting aan tepassen en verhoogt daardoor het vertrouwen en de reproduceerbaarheid tijdens een HRPF-experiment. Het gebruik van radicale dosimetrie in FPOP is elders beschreven23,24,25, en wordt verder in detail besproken in een recente publicatie26. Hier beschrijven we het gebruik van een nieuw flitsfotolysesysteem en real-time dosimetrie om equine apo-myoglobine (aMb) te labelen, waarbij we de niveaus van peptideoxidatie in een FPOP-experiment vergelijken met die van verkregen bij het gebruik van een excimerlaser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Installatie van de capillaire buis

  1. Met behulp van een silica kloven steen, splitsen 250 μm binnendiameter (ID) silica capillair tot 27 inch. Controleer de capillaire uiteinden op een schone, rechte snede.
  2. Maak twee ramen van ongeveer 15 mm lang door de polyimide coating weg te branden. Vanaf het "onderste uiteinde" maakt u het eerste fotolysevenster op 90 mm afstand van het "onderste uiteinde" en het tweede dosimetervenster op 225 mm afstand van het "onderste uiteinde".
    OPMERKING: Zodra de coating is weggebrand, is het capillair erg kwetsbaar.
  3. Schroef de moer en de ferrule los bij poort 5 en steek het "onderste uiteinde" van het capillair net voorbij het conische uiteinde van de ferrule (figuur 1A).
  4. Verwijder op de fotolysemodule de fotolyseceldop door deze er recht uit te trekken en verwijder vervolgens het magnetisch gemonteerde metalen masker dat het capillair op zijn plaats houdt.
    LET OP: In de fotolyseceldop bevindt zich een gebogen spiegel, laat niets de spiegel raken.
  5. Open op de dosimetermodule de dosimetercel door op het lipje aan de linkerkant te drukken en de dosimetercel naar rechts te zwaaien. Verwijder de magnetisch gemonteerde clips die het capillair op zijn plaats houden.
  6. Plaats het capillair in het gegroefde kanaal in de basis van de fotolysecel. Centreer het capillaire venster met het fotolysecelvenster. Terwijl u het capillair met één hand op zijn plaats houdt, voegt u het magnetische masker toe om het capillair op zijn plaats te houden. Plaats de fotolysedop weer op zijn plaats.
  7. Plaats het capillair in het gegroefde kanaal in de basis van de dosimetercel. Centreer het tweede capillaire venster op het kleine diafragma in het midden van de dosimetercelbasis. Terwijl u het capillair met één hand op zijn plaats houdt, plaatst u de twee magnetische clips in positie om het capillair op zijn plaats te houden. Sluit de dosimetercel totdat deze dichtklikt.
  8. Steek het capillair door de gekartelde moer bovenop de capillaire lift van de productcollector (afbeelding 1B). Verleng het capillair tot net boven de onderkant van de flacon.
    OPMERKING: Het is belangrijk dat het capillair de bodem van de flacon bereikt om ervoor te zorgen dat het capillair tijdens een experiment in de blusoplossing wordt ondergedompeld.

2. Een injectielus installeren

  1. Gebruik Teflon-buizen met een buitendiameter van 1/16" en een binnendiameter van 0,015" (381 μm). Volg vergelijking 1 om de lengte van de slang te berekenen die nodig is voor het gewenste volume met behulp van vergelijking 1.
    Equation 1
    Waarbij L de lengte van de slang in millimeters is, is V het gewenste volume in microliters en d de binnendiameter van de buis in millimeters. Voor een injectievolume van 25 μL en een binnendiameter van 381 μm moet de buislengte ongeveer 219,3 mm bedragen.
    OPMERKING: Gebruik PTFE-buizen met een binnendiameter van 0,01" voor volumes kleiner dan 20 μL.
  2. Snijd de Teflon-slang op de benodigde lengte met behulp van een buissnijder. Controleer de uiteinden van de buis op een schone, rechte snede.
  3. Steek het ene uiteinde van de nieuwe injectielus door een van de moeren en plaats een nieuwe ferrule op het uiteinde van de buis. Houd de ferrule en moer op hun plaats en steek de buis in poort 3 van de injectieklep totdat deze in de klep uitvalt. Houd de buis stevig vast en draai de moervinger strak. Draai de moer met een moersleutel 1/4 draai verder. Verwijder en inspecteer het montage.
    OPMERKING: Als de ferrule niet op zijn plaats is bevestigd, installeert u deze opnieuw en draait u deze 1/8 draai verder. Herhaal dit met het andere uiteinde van de lus.
  4. Zodra beide uiteinden een moer en een vaste ferrule hebben, schroeft u het ene uiteinde losjes aan poort 3 en het andere uiteinde aan poort 6 (figuur 1C). Eenmaal in positie beide zijden vastdraaien om de vinger strak te houden en vervolgens 1/4 draai voorbij vinger strak met een moersleutel.

3. Initialiseer het fotolysesysteem

  1. Schakel de fotolysemodules in de volgende volgorde in: (1) Fluidics Module (2) Fotolysemodule (3) Dosimetriemodule (4) Productverzamelaar, en ten slotte (5) de systeemcomputer en start de besturingssoftware
    OPMERKING: Laat de Dosimeter Module minstens een half uur opwarmen vanaf een koude start.
  2. Dompel de slang volledig onder vanuit de stand "Klep" op de spuitpomp (figuur 1D) in 10 ml buffer. Plaats de slang vanuit de stand "Afval" (figuur 1D) en de slang van poort 2 op de spuitpoort (figuur 1C) in een lege container om afval op te halen.
    OPMERKING: Gebruik de buffer waarin uw eiwit wordt gesuspendeerd. Een aanbevolen buffer is 10 mM NaPO4.
  3. Plaats op de carrousel productcollector 1,5 ml microcentrifugebuizen op de plaats met de aanduiding H en 6.
  4. Als u 250 μm ID capillair gebruikt, stelt u het belastingsdebiet in op 500 μL/min, het verwerkingsdebiet op 7,5 μL/min en het afvaldebiet op 500 μL/min.
  5. Bereken de flitsvertraging, producttijd en verspillingstijd om de semiautomatische modus te gebruiken met vergelijking 2.
    Equation 2
    Waarbij t de tijd in minuten is, s de capillaire afstand in millimeters, d de binnendiameter van het capillair in millimeters en f het debiet in μL/min.
    1. Voor de flitsvertraging is de afstand van het "onderste uiteinde" van het capillair tot het eerste venster, dat ongeveer 90 mm moet zijn. Met behulp van 250 μm ID capillair en een verwerkingsdebiet van 7,5 μL/min komt het monster in ongeveer 35 seconden in het fotolysevenster. Laat twee flitsen bij 1 Hz optreden voordat de monsters aankomen, dus stel de flitsvertraging in op 33 seconden.
    2. Voer voor de producttijd de hoeveelheid tijd in die de geïnjecteerde oplossing nodig heeft om van de injectieklep naar het einde van het capillair te stromen. Stel voor een 27" lange 250 μm ID capillair de producttijd in op 4,5 minuten.
    3. Voer voor de afvaltijd de hoeveelheid tijd in die het totale volume geïnjecteerde oplossing nodig heeft om te worden verzameld. Op dit moment zal de productinzamelaar van de productpositie naar de afvalflacon gaan. Stel voor een injectievolume van 25 μL en een debiet van 7,5 μL/min de afvaltijd in op 7,8 minuten.
  6. Spoel de injectielus vijf keer uit door 25 μL HPLC-water in de injectiepoort te injecteren terwijl de injectieklep in de belastingsstand is ingesteld.
  7. Draai de injectieklep handmatig omhoog om de rest van het systeem in 'injecteerpositie' te zetten. Selecteer Proces (Uit) op de besturingssoftware om stromend water te starten. Verhoog tijdens het stromen de capillaire lift van de productcollector door Omhoog onder de productverzamelaar te selecteren, zodat u het einde van het capillair kunt zien. Vloei water door het capillair totdat er een druppel ontstaat.
    OPMERKING: Als er geen druppel ontstaat, controleer dan de injectorklep op lekken. Als er een lek is, maakt u de moer los, sluit u het capillaire om en maakt u het weer vast.

4. Bepaal de werkelijke ▪OH-opbrengst om radicale opruimeffecten uit de buffer te testen.

  1. Start de stroom in de besturingssoftware door Proces (Uit)te selecteren. Stel op het tabblad Instellingen de flitsspanning in op 0 V. Selecteer onder het tabblad Handmatige bediening in de sectie dosimetergegevens de optie Gegevens starten + AutoZero.
  2. Selecteer de positie voor de productflacon (H) en de afvalflacon (6).
  3. Selecteer Gereed, draai de injectieklep handmatig naar beneden in de belastingspositie en injecteer 25 μL 1 mM Adenine met 100 mM H2O2 in de injectiepoort. Eenmaal geïnjecteerd, draait u de injectieklep handmatig in de injectiepositie.
    OPMERKING: Dit activeert automatisch het systeem om de stroom te starten, de plasmabron in te schakelen en de dosimetriegegevens te verkrijgen.
  4. Verhoog de spanning door naar het tabblad Instellingen te navigeren en de flitsspanning te wijzigen. Herhaal stap 4.2 en 4.3 met 500 V, 750 V, 1000 V en 1250 V. Voer de aflezing van adenineabsorpantie bij elke spanning in drievoud uit.
  5. Selecteer het tabblad Berekeningen om de gemiddelde absorptie van elk monster te bepalen. Klik eerst op Selecterenen selecteer vervolgens handmatig het begin en einde van de piekabsorpance. Schrijf in de beschikbare ruimte een beschrijving van het voorbeeld. Herhaal dit voor alle verkregen gegevens.
    OPMERKING: Er kunnen bellen ontstaan die een piek in de dosimetermeting veroorzaken. Wanneer u gegevens selecteert om de gemiddelde absorptie te bepalen, laat u gebieden met bellen weg.
  6. Kopieer en plak gegevens in Excel om de gemiddelde verandering in adenineabsorpiteit voor elke spanning te berekenen, waardoor de effectieve ▪OH-opbrengst wordt bepaald.
  7. Herhaal stap 4.1-4.6 als meerdere monstercondities (verschillende buffer/additieven) worden gebruikt om de effectieve ▪OH-opbrengst voor elke aandoening te normaliseren.

5. Wijziging van eiwitten om veranderingen in de hogere ordestructuur te detecteren.

  1. Meng 4 mM adenine met 20 μM eiwit in een één-op-één verhouding om een oplossing te maken die 2 mM adenine en 10 μM eiwit bevat.
  2. Maak de quench-oplossing met 0,3 mg/ml catalase om overtollig waterstofperoxide en 35 mM methionineamide af te breken om eventuele resterende radicalen te doven. Aliquot 25 μL blusoplossing in een microbuis van 200 μL, zodat een gelijk volume blusmiddel en het gelabelde product worden gemengd.
  3. Verdun H2O2 tot 200 mM en houd op ijs.
  4. Start op de besturingssoftware op het tabblad Instellingen de flitsspanning op 0 V om eventuele achtergrondoxidatie te bepalen.
  5. Selecteer op het tabblad handmatige bediening de optie Gegevens + AutoZero starten, gevolgd door Proces (Uit),vervolgens Gereeden draai ten slotte de injectieklep naar beneden in de belastingspositie.
  6. Plaats een blusoplossing in stand 1 op de productopvangcarrousel. Wijzig op de System Control Software de productflacon in 1.
  7. Meng vlak voor injectie 12,5 μL van het adenine- en eiwitmengsel met 12,5 μL H2O2 om een eindconcentratie van 1 mM Adenine, 5 μM-eiwit en 100 mM H2O2te maken. Pipetteer voorzichtig op en neer om te mengen, draai snel naar beneden en injecteer 25 μL met behulp van de injectiepoort binnen 10 seconden na het mengen.
  8. Zet de injectieklep in de injectiestand en wacht terwijl het monster wordt verwerkt.
  9. Herhaal acquisitie met 500 V, 750 V, 1000 V en 1250 V. Voer elke spanningsmeting in drievoud uit.
  10. Bereken de gemiddelde absorptie zoals beschreven in stap 4.5. Kopieer en plak alle gegevens in Excel.

6. Sluit het systeem af

  1. Nadat alle monsters zijn verzameld, spoelt u de spuitpoort en de monsterlus weg door de injectieklep in de belastingsstand te zetten en injecteert u vijf keer 25 μL HPLC-water.
  2. Draai de injectieklep in de injectiepositie om de rest van het systeem met HPLC-water te spoelen.
  3. Stop de stroom, sluit de systeembesturingssoftware en schakel de modules uit die beginnen met de productcollector, dosimetermodule, fotolysemodule en ten slotte de fluidics-module.

7. Monstervoorbereiding en vloeibare chromatografie-massaspectrometrie

  1. Denature het eiwit door incubatiemonsters bij 80 °C gedurende 20 minuten in aanwezigheid van 50 mM Tris en 1 mM CaCl2. Koel monsters op kamertemperatuur en voeg 1:20 trypsine toe aan eiwitten. Verteer het eiwit 's nachts bij 37 °C met monstermenging. Beëindig de volgende ochtend de trypsinevertering door monsters gedurende 10 minuten op 95 °C te verhitten.
  2. Detecteer peptiden met behulp van een LC-MS/MS-systeem met hoge resolutie dat is aangesloten op een UPLC-systeem.
  3. Plaats het monster eerst op de valkolom (300 μm ID X 5 mm 100 Å poriegrootte, deeltjesgrootte van 5 μm) en was gedurende 3 minuten op 5,0 μL/ml met water dat 2% oplosmiddel B (acetonitril en 0,1% mierenzuur) bevat.
  4. Scheid de peptiden op een C18 nanocolumn (0,75 mm x 150 mm, 2 μm deeltjesgrootte, 100 Å poriegrootte) met een debiet van 300 nL/min met een gradiënt tussen oplosmiddel A (water dat 0,1% mierenzuur bevat) en oplosmiddel B. De gradiënt voor peptide-elutie bestaat uit een lineaire toename van 2 tot 35% B over 22 minuten, verhoogd tot 95% B gedurende 5 minuten en 3 minuten vastgehouden om de kolom te wassen, en vervolgens teruggebracht naar 2% B gedurende 3 minuten en 9 minuten vastgehouden om de kolom opnieuw te equilibreren.
  5. Verzamel de gegevens in de positieve ionenmodus. Stel de spuitspanning in op 2400 V en de temperatuur van de ionenoverdrachtsbuis op 300 °C.
  6. Verkrijg de volledige MS-scans van 250-2000 m/z, gevolgd door acht daaropvolgende gegevensafhankelijke MS/MS-scans op de top acht meest voorkomende peptide-ionen. Gebruik botsing-geïnduceerde dissociatie bij 35% genormaliseerde energie om de peptiden te fragmenteren.
  7. Identificeer alle ongewijzigde peptiden die zijn gedetecteerd uit MS/MS-analyse met behulp van een beschikbare eiwitanalysesoftware aan de hand van het benodigde FASTA-bestand met de eiwitsequentie en het relevante proteolytische enzym.
  8. Zoek en kwantificeer gemodificeerde peptiden met behulp van een HRPF Data Processing Software. De mate van oxidatie voor elk geïdentificeerd peptide wordt berekend door het opgetelde chromatografische piekgebied van een gemodificeerd peptide te delen door het totale chromatografische piekgebied van dat peptide gewijzigd en ongewijzigd met behulp van vergelijking 3.
    P = [I(singly geoxideerd) X 1 + I (dubbel geoxideerd) X 2 + I(triply geoxideerd) X 3 + .../[Iunoxidized + I(singly oxidized) + I(dubbel geoxideerd) + I(triply geoxideerd) ...]
    waarbij P het gemiddelde aantal oxidatiegebeurtenissen per peptidemolecuul aangeeft, en ik het piekgebied van het niet-geoxideerde peptide (Iunoxidized) en het peptide met n oxidatiegebeurtenissen vertegenwoordigt.

8. Herhaal voor een differentieelonderzoek stap 5-7 op de tweede voorwaarde.

OPMERKING: Om de reproduceerbaarheid te bevestigen, worden twee biologische replica's naast technische triplicaten voor elke aandoening aanbevolen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De hogedrukplasmabron in combinatie met real-time dosimetrie maakt een betere controle van ▪OH-opbrengst mogelijk om veranderingen in de eiwitstructuur van hogere orde nauwkeuriger te observeren. De toevoeging van adenine zorgt voor een effectieve real-time radicale dosimeter. Bij oxidatie verliest adenine uv-absorptie bij 265 nm (figuur 2A). De verandering in adenineabsorpties houdt rechtstreeks verband met de concentratie radicalen die beschikbaar is voor HRPF en biedt zo een middel om veranderingen in radicale concentratie in aanwezigheid van radicale aaseters zoals buffers, hulpstoffen en liganden effectief te monitoren (figuur 2B).

Apomyoglobine (aMb) werd gewijzigd in aanwezigheid van 100 mM H2O2 en 1 mM adenine bij vier toenemende plasmaspanningen (Figuur 3). Zes peptiden werden gedetecteerd met een lineaire toename van oxidatie met de verandering van adenine UV 265 nm absorptie. Adenine UV-absorptie is een surrogaat voor effectieve ▪OH-concentratie. De lineaire verandering in oxidatie versus de verandering in radicale concentratie bevestigt de afwezigheid van artefactuele verandering in de hogere ordestructuur van het eiwit tijdens het labelen. Bovendien was de mate van oxidatie die werd gedetecteerd met de hogedrukplasmabron veel hoger dan de lasergebaseerde methode. Deze toename is het gevolg van het brede UV-emissiespectrum van de hogedrukplasmabron (figuur 4). Door een breed UV-spectrum te produceren, overlapt de plasmabron het absorptiedomein van H2O2 beter, wat zorgt voor een efficiëntere productie van ▪OH door de fotolyse van H2O2 (figuur 5). Dit is in directe vergelijking met de KrF Excimer laser en Nd:YAG laser, die veel voorkomende bronnen zijn die H2O2 fotolyseren in HRPF studies21,27,28. Deze lasers hebben een zeer smalle bandbreedte aan de onderkant vanhetfotometrische absorptiebereik van H 2 O2. In vergelijking met de KrF excimerlaser verhoogt de hogedrukplasmabron de productie van ▪OH's aanzienlijk, terwijl tegelijkertijd de vraag naar vereiste optische fluence aanzienlijk afneemt (figuur 6).

Figure 1
Figuur 1: Onderdelen van het flitsfotolyseplatform. (A) Geassembleerde capillaire buis, union tube, moer en ferrule. De punt van het "onderste uiteinde" van het capillair reikt nauwelijks verder dan de union tube. (B) Gekartelde moer op de productcollector om het uiteinde van het capillair in te brengen. (C) Gelabelde zespoorts injectieklep. (D) Spuitpomp met de spuit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Verandering in adenine absorptie gebruikt voor dosimetrie. (A) Bij oxidatie neemt de UV-absorptie van adenine af bij 265 nm. (B) Verandering in adenineabsorpantie bij 265 nm bij verschillende flitsspanningen voor twee buffers. Buffer 2 bevat een radicale aaseter die de verandering in adenineabsorpantie zal verminderen in vergelijking met buffer 1. Om de radicale opruimeffecten van buffer 2 te overwinnen, is een verhoogde flitsspanning vereist. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Apomyoglobin dosis responscurve. (A) Gemiddelde oxidatie van zes peptiden versus adenine verandering in absorptie wordt getoond. FPOP-oxidatieniveaus worden weergegeven in de onderbroken lijnen. (B) De zes geoxideerde peptiden zijn gelabeld op een kristalstructuur van myoglobine (PDB: 3RGK). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Spectrale bestraling van de plasmalamp. De hogedruk Xe gaslamp zendt breedspectrum UV-straling uit van 200-300 nm samen met zichtbaar licht. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: H2O2 fotometrische absorptiespectra. Het zwarte spoor is het UV-absorptiespectrum van H2O229. In paars gemarkeerd zijn de smalle golflengten van de KrF excimer laser (248 nm) en Nd:YAG laser (265 nm) produceert terwijl de blauwe pijl de breedspectrum plasmabron vertegenwoordigt die het bereik van nuttige H2O2 absorptie uitbreidt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Werkzaamheid van de plasmabron om H 2 O2te fotolyseren . De verandering in adenineabsorptie ten opzichte van verhoogde plasmafluentie toont de concentratie van ▪OH's die worden gegenereerd. Gemarkeerd in paars is een typische maximale verandering in absorptie geproduceerd door een KrF excimer laser25. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er zijn verschillende kritieke stappen om een goede etikettering van eiwitten tijdens elk HRPF-experiment te garanderen. Ten eerste worden een geschikt debiet en de bronflitssnelheid geselecteerd om ervoor te zorgen dat elke bolus van het monster eenmaal wordt bestraald. Dit zorgt ervoor dat het eiwit wordt blootgesteld aan een enkele bolus van nieuw gevormde ▪OH. Zodra een eiwit is geoxideerd, kan de eiwitstructuur van een hogere orde worden gewijzigd. Om er zeker van te zijn dat de inheemse eiwitstructuur wordt onderzocht, moet elk eiwitmolecuul in één oogwenk worden gewijzigd. Dosimetrie kan worden gebruikt om te testen of de inheemse eiwitstructuur wordt onderzocht. Naarmate de concentratie van hydroxylradicalen toeneemt, neemt de mate van oxidatie lineair toe als de inheemse eiwitstructuur wordt onderzocht. Als een grote concentratie hydroxylradicalen er echter voor zorgt dat het eiwit zich gedeeltelijk ontvouwt tijdens het etiketteren, zal de mate van oxidatie aanzienlijk toenemen, waardoor een effectief middel wordt geboden om ervoor te zorgen dat de inheemse eiwitstructuur wordt onderzocht.

Het is ook van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de reactie op de juiste manier wordt gedoofd. Dit omvat het opnemen van een goede radicale aaseter gemengd met het eiwit tijdens het etiketteringsproces. Voor deze methode wordt adenine niet alleen gebruikt voor dosimetrie, maar ook voor aaseters ▪OH die de levensduur van de radicaal beperken omdat het het eiwit labelt. Door de levensduur van de radicale te beperken, wordt het vertrouwen gewonnen dat de inheemse eiwitstructuur wordt gewijzigd. Na het etiketteerproces is het belangrijk om het monster te verzamelen in een quench-oplossing die catalase en methionineamide bevat, waardoor overtollig H2O2 wordt afgebroken en ▪OH wordt opgegraven. Het beperken van de blootstelling van het eiwit aan H2O2 zorgt ervoor dat H2O2 geïnduceerde oxidatie wordt geminimaliseerd.

Het is ook van cruciaal belang om op de juiste manier een protease voor peptidevertering te selecteren. Veel enzymen splitsen het eiwit op specifieke locaties. Trypsine kleeft bijvoorbeeld aan de carboxylzijde van arginine- en lysineresten. Dit maakt eenvoudige gegevensanalyse mogelijk, maar als het eiwit van belang een beperkt aantal arginines en lysines heeft, kan een alternatief protease of een mengsel van proteasen nodig zijn voor een acceptabele peptidedekking tijdens bottom-up proteomics. Het wordt ook geadviseerd om het gemodificeerde eiwit te verteren vóór langdurige opslag om verlies van geoxideerd eiwit als gevolg van aggregatie- en / of oplosbaarheidsproblemen te voorkomen.

Het gebruik van HRPF om veranderingen in eiwitstructuur en eiwitinteracties te bestuderen is zeer succesvol geweest11,30,31,32,33, maar er zijn extra complicaties bij het labelen van heembindende eiwitten of glycoproteïnen. Hoewel zowel heembinding34 alsglycoproteïnen 35 met succes zijn onderzocht met behulp van HRPF, moeten grondige probleemoplossing in de concentratie van H2O2,radicale aaseter en het tijdsbestek van H2O2 blootstelling in evenwicht zijn. Bovendien doven sommige buffers ▪ UCH'suitgebreid. Daarom is het van vitaal belang om een geschikte buffer te selecteren en hulpstoffen zoals DTT en DMSO te beperken. Typische buffers die tijdens een HRPF-experiment worden gebruikt, zijn acetaat, natriumfosfaat, fosfaatgebufferde zoutoplossing of lage concentraties Tris-buffer. Interessant is dat Tris een aantal ▪OH opruimt, maar na oxidatie neemt de fotometrische absorptie toe bij 265 nm en kan het worden gebruikt in plaats van adenine voor dosimetrie36. Hoewel sommige buffers de effectieve concentratie van ▪OH kunnen verminderen, kunnen deze uitdagingen worden overwonnen door een in-line radicale dosimeter op te nemen.

HRPF maakt gebruik van niet-specifieke onomkeerbare etikettering door ▪OH om de toegankelijkheid van oplosmiddelen te onderzoeken. Het niet-specifieke karakter van het etiket biedt een grotere totale dekking in vergelijking met andere meer gerichte footprintingmethoden, waaronder N-ethylmaleimide37 en glycine ethylester38. Aangezien de modificatie onomkeerbaar is, is er voldoende tijd beschikbaar tijdens de monsterbehandeling. Dit zorgt voor een volledige eiwitvertering en een lange LC-gradiënt voor een verbeterde MS/MS-analyse. Voor HRPF zijn er verschillende methoden om ▪OH te genereren. Een populaire methode maakt gebruik van een laser om H2O2 in ▪OH te fotolyseren. Lasergebaseerde platforms zijn zeer succesvol geweest in het onderzoeken van de inheemse eiwitstructuur, maar ze vereisen uitgebreide veiligheidsmaatregelen, rigoureus onderhoud en een aanzienlijke hoeveelheid ruimte.

Met het gebruik van een hier beschreven hogedrukplasmabron is er geen behoefte aan schadelijke gassen en geen angst voor verdwaalde UV-straling. De levensduur van elke hogedrukplasmabron is voldoende om tussen de 180-200 monsters te labelen, en naast het monitoren van de dosimeterrespons is er geen extra onderhoud nodig. De plasmabron staat onder hoge druk, dus draag tijdens het hanteren van de plasmabron een veiligheidsbril. De plasmabron fotolyseert ook H2O2 efficiënter, waardoor verhoogde eiwitmodificatie mogelijk is. Als onvoldoende etikettering wordt waargenomen, kan de H2O2-concentratie worden verhoogd, samen met het verhogen van de lampenergie voor extra radicale productie. Bovendien, met de integratie van real-time dosimetrie, kan men de reproduceerbaarheid van experimenten verhogen. Al met al biedt het gebruik van een plasmabron in combinatie met realtime dosimetrie en software voor geautomatiseerde FPOP-gegevensberekening een voordelig pakket om HRPF-experimenten uit te voeren in een veilige, gemakkelijker te bedienen en met verbeterde reproduceerbaarheid, in vergelijking met standaard lasergebaseerde methoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

E.E.C., J.S.S., en S.R.W. onthullen een aanzienlijk financieel belang in GenNext Technologies, Inc., een bedrijf in een vroeg stadium dat technologieën wil commercialiseren voor analyse van eiwitstructuur van hogere orde. De verstrekte representatieve gegevens zijn beoordeeld door S.K.M., die geen financieel belangenconflict heeft.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 en R44GM125420).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A any brand is sufficient
50 µL SGE Gastight Syringes Fisher Scientific SG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) Thermo Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS120-500
Apomyoglobin Sigma-Aldrich
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Centrifuge Eppendorf 022625501
Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-100 any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Methionine amide Chem-Impex 03109
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Scientific 90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” Molex 1068680064 any capillary tubing cutter is sufficient
UPLC Thermo Scientific
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS118-500
Water, LC/MS Grade Fisher Scientific W6-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
  2. Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
  3. Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
  4. Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
  5. Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
  6. Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structure and dynamics of the actin filament. Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).
  7. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
  8. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  9. Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
  10. Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
  11. Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
  12. Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  13. Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).
  14. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  15. Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
  16. Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
  17. Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  18. Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
  19. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
  20. Linde. Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
  21. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
  22. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  23. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).
  24. Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).
  25. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  26. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
  27. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  28. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).
  29. Ultraviolet Absorption Spectrum of Hydrogen Peroxide. , Available from: http://www.h2o2.com/technical-library/physical-chemical-properties/radiation-properties/default.aspx?pid=65&name=Ultraviolet-Absorption-Spectrum (2016).
  30. Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
  31. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
  32. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  33. Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
  34. Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
  35. Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
  36. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  37. Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
  38. Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).

Tags

Biochemie Biofarmaceutisch Biosimilar Hogere Orde Structuur Snelle Fotochemische Oxidatie van Eiwitten (FPOP) Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) Epitoop Mapping Receptor-Drug Interaction Protein-Protein Interaction
Laservrije hydroxyl radicale eiwitvoetafdruk om structurele analyse van eiwitten in hogere orde uit te voeren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weinberger, S. R., Chea, E. E.,… More

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins. J. Vis. Exp. (172), e61861, doi:10.3791/61861 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter