Summary
Detta protokoll presenterar en metod för att använda inline radikal dosimetri och en plasma ljuskälla för att utföra flash oxidation protein fotavtryck. Denna metod ersätter den farliga UV-lasern för att förenkla och förbättra reproducerbarheten av snabb fotokemisk oxidation av proteinstudier.
Abstract
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) är en framväxande och lovande strukturanalysteknik med högre ordning som ger information om förändringar i proteinstruktur, proteinproteininteraktioner eller protein-ligand interaktioner. HRPF använder hydroxylradikaler(▪OH) för att oåterkalleligen märka ett proteins lösningsmedelskomgängliga yta. Den inneboende komplexiteten, kostnaden och den farliga karaktären hos att utföra HRPF har avsevärt begränsat bredbaserad användning i biopharma. Dessa faktorer inkluderar: 1) användning av komplicerade, farliga och dyra lasrar som kräver betydande säkerhetsåtgärder; och 2) hrpf:s omöjlighet till följd av bakgrundsrensning av ▪OH som begränsar jämförande studier. Denna publikation ger ett protokoll för drift av ett laserfritt HRPF-system. Detta laserfria HRPF-system använder en högenergi, högtrycks plasma ljuskälla flash oxidation teknik med in-line radikal dosimetri. Plasmaljuskällan är säkrare, lättare att använda och effektivare när det gäller att generera hydroxylradikaler än laserbaserade HRPF-system, och den in-line radikala dosimetern ökar reproducerbarheten av studier. Tillsammans adresserar och övervinner det laserfria HRPF-systemet de nämnda bristerna och begränsningarna i laserbaserade tekniker.
Introduction
Proteinkonformation och tillhörande högre orderstruktur (HOS) är de viktigaste bestämningsfaktorerna för korrekt biologisk funktion och avvikande beteende1. Detsamma gäller biofarmaceutiska läkemedel, vars struktur och funktionella aktivitet är beroende av olika aspekter av deras produktion och miljö. Biofarmaceutiska förändringar i HOS har kopplats till biverkningar (ADR) som tillskrivs oönskad farmakologi och patientens immunologiskasvar 2,3. Utseendet på ADR har varnat den biofarmaceutiska industrin för den kritiska roll som protein HOS spelar för säkerheten och effektiviteten hos bioterapeuter, och de har fastställt behovet av ny och förbättrad HOS-analys4.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) är en lovande teknik för att spåra förändringen i protein HOS. HRPF innebär irreversibel märkning av ett proteins exteriör med ▪OH följt av masspektrometri (MS) analys för att identifiera proteinets lösningsmedelsåliga yta5,6,7. HRPF har framgångsrikt använts för att upptäcka defekter i protein HOS och dessfunktion 8,9, karakterisera HOS av monoklonala antikroppar (mAb)10,11,12,13, bestämma bindningen Kd av en ligand14, och mycket mer15,16,17,18,19. En vanlig metod för att generera ▪OH för HRPF är Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP), som använder högenergiska, snabba UV-lasrar för att producera ▪OH från fotolys av H2O2. För det mesta använder FPOP dyra excimerlasrar som använder farlig gas (KrF) som kräver betydande skyddsåtgärder för att undvika andnings- och ögonskada20. För att undvika inandningsrisker har andra använt frekvensdubbelt neodym yttrium aluminium granat (Nd:YAG) lasrar21, vilket eliminerar användningen av giftig gas men fortfarande är kostsamma, kräver betydande operativ expertis och kräver omfattande herrelösa ljuskontroller för att skydda användare från ögonskada.
Även om riklig information kan erhållas med HRPF, har bred adoption i biopharma inte uppfyllts. Två hinder för det begränsade antagandet av hrpf omfattar: 1) användning av farliga och dyra lasrar som kräver betydande säkerhetsåtgärder20; och 2) Hrpf:s omöjlighet till följd av bakgrundsrensning av ▪OH som begränsar jämförande studier22. För att ersätta laseranvändning utvecklades en höghastighets, högenergi plasma flash fotolysenhet för att säkert utföra FPOP på ett enkelt sätt. För att förbättra okrmotståndligheten hos HRPF-experiment implementeras radikal dosimetri i realtid.
Hrpf-metoden har begränsats av irreproduktivitet som tillskrivs bakgrundsrensning av ▪OH22. Medan ▪OH är utmärkta sonder av proteintopografi, reagerar de också med många beståndsdelar som finns i preparat, vilket gör det nödvändigt att mäta den effektiva koncentrationen av radikaler som finns tillgängliga för att oxidera ett målprotein. Variationer i buffertberedning, väteperoxidkoncentration, ligandegenskaper eller fotolys kan resultera i oxidationsskillnader mellan kontroll- och experimentgrupper som skapar tvetydighet i HOS-differentierade studier. Tillägget av radikal dosimetri i realtid möjliggör justering av effekten ▪OH-belastning och ökar därför förtroendet och reproducerbarheten under ett HRPF-experiment. Användningen av radikal dosimetri i FPOP har beskrivits någon annanstans23,24,25, och diskuteras vidare i detalj i en ny publikation26. Här beskriver vi användningen av ett nytt flash fotolyssystem och dosimetri i realtid för att märka hästapo-myoglobin (aMb), jämföra nivåer av peptidoxidation i ett FPOP-experiment med det som erhålls vid användning av en excimerlaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montering av kapillärröret
- Använd en kiseldioxidklyvningssten och klyv 250 μm innerdiameter (ID) kiselkapillary till 27 tum. Kontrollera kapillärändarna för ett rent, rakt snitt.
- Skapa två fönster som är ungefär 15 mm långa genom att bränna bort polyimidbeläggningen. Från den "nedre änden" gör det första fotolysfönstret 90 mm från "nedre änden" och det andra dosimetmeterfönstret 225 mm från den "nedre änden".
OBS: När beläggningen har bränts bort är kapillären mycket bräcklig. - Skruva loss muttern och järnet i port 5 och sätt i kapillärens "nedre ände" strax bortom ferrulens koniska ände (figur 1A).
- På fotolysmodulen tar du bort fotolyscelllocket genom att dra det rakt ut och sedan ta bort den magnetiskt monterade metallmasken som håller kapillären på plats.
VARNING: Inuti fotolyscelllocket finns en böjd spegel, låt inget vidröra spegeln. - Öppna dosimetercellen på dosimetercellen genom att trycka på fliken till vänster och sväng dosimetercellen öppen åt höger. Ta bort de magnetiskt monterade klämmorna som håller kapillären på plats.
- Placera kapillären i den räfflade kanalen i basen av fotolyscellen. Centrera kapillärfönstret med fotolyscellfönstret. När kapillären håller sig på plats med en hand lägger du till magnetmasken för att hålla kapillären på plats. Placera fotolyslocket på plats igen.
- Placera kapillären i den räfflade kanalen i dosimetercellens botten. Centrera det andra kapillärfönstret på den lilla bländaren i mitten av dosimetercellbasen. Placera de två magnetiska klämmorna på plats för att hålla kapillären på plats samtidigt som kapillären är på plats med en hand. Stäng dosimetercellen tills den klickar på stängd.
- För in kapillären genom den räfflade muttern ovanpå produktuppsamlarens kapillärlyft (figur 1B). Förläng kapillären till strax ovanför botten av injektionsflaskan.
OBS: Det är viktigt att kapillären når botten av injektionsflaskan för att säkerställa att kapillären är nedsänkt i släplösningen medan du kör ett experiment.
2. Installera en injektionsslinga
- Använd Teflon-slangar med ytterdiametern 1/16" och en innerdiameter på 0,015" (381 μm). Följ ekvation 1 för att beräkna längden på slangar som behövs för önskad volym med hjälp av ekvation 1.
Där L är slangens längd i millimeter är V önskad volym i mikroliter och d är rörets innerdiameter i millimeter. För en injektionsvolym på 25 μL och en innerdiameter på 381 μm måste slanglängden vara ungefär 219,3 mm.
OBS: För volymer under 20 μL, använd PTFE-slangar med en innerdiameter på 0,01". - Kapa Teflon-slangen till den nödvändiga längden med en rörskärare. Kontrollera rörens ändar för ett rent, rakt snitt.
- Sätt in ena änden av den nya injektionsslingan genom en av muttrarna och placera en ny ferrule på rörens ände. Håll hylsan och muttern på plats och sätt in röret i insprutningsventilens port 3 tills det bottnar ut i ventilen. Håll röret stadigt och dra åt mutterns finger ordentligt. Dra åt muttern 1/4 med en skiftnyckel. Ta bort och inspektera monteringen.
OBS: Om ferrule inte är fastsatt på plats, installera om och dra åt 1/8 sväng vidare. Upprepa med den andra änden av slingan. - När båda ändarna har en mutter och fast hylsa, skruva löst ena änden på port 3 och den andra änden till port 6 (Figur 1C). När du är på plats dra åt båda sidor till finger tätt och vrid sedan 1/4 förbi fingret tätt med en skiftnyckel.
3. Initiera fotolyssystemet
- Slå på fotolysmodulerna i följande ordning: (1) Fluidics Module (2) Photolysis Module (3) Dosimetry Module (4) Product Collector, och slutligen (5) systemdatorn och starta styrprogramvaran
OBS: Låt Dosimetermodulen värmas upp minst en halvtimme från kallstart. - Helt nedsänkt slang från läget "Ventil" på sprutpumpen (Figur 1D) till 10 ml buffert. Placera slangen från läget "Avfall"(figur 1D)och slangarna från port 2 på sprutporten (figur 1C) till en tom behållare för att samla in avfall.
OBS: Använd bufferten som proteinet kommer att suspenderas i. En rekommenderad buffert är 10 mM NaPO4. - Placera 1,5 ml mikrocentrifugrör på den plats som är märkt med H och 6 på produktfångarkarusellen.
- Om du använder 250 μm ID kapillär, ställ in belastningsflödet på 500 μL/min, bearbetningsflödet till 7,5 μL/min och avfallsflödet till 500 μL/min.
- Beräkna blixtfördröjning, produkttid och avfallshanteringstid för att använda halvautomatiskt läge med hjälp av ekvation 2.
Där t är tiden i minuter är s kapilläravståndet i millimeter, d är kapillärens innerdiameter i millimeter och f är flödeshastigheten i μL/min.- För blixtfördröjningen är avståndet från kapillärens "nedre ände" till det första fönstret, som ska vara ungefär 90 mm. Med hjälp av 250 μm ID kapillär och en bearbetningsflöde på 7,5 μL/min kommer provet fram till fotolysfönstret om cirka 35 sekunder. Låt två blinkningar vid 1 Hz uppstå innan proverna anländer, så ställ in blixtfördröjningen på 33 sekunder.
- För produkttiden, ange hur lång tid injicerad lösningen tar att flöda från insprutningsventilen till slutet av kapillären. För en 27" lång 250 μm ID kapillär, ställ in produkttiden på 4,5 minuter.
- För avfallstiden anger du hur lång tid den totala volymen injicerad lösning tar att samlas in. Vid denna tidpunkt kommer produktinsamlaren att flytta från produktpositionen till avfallsflaskan. För en injektionsvolym på 25 μL och en flödeshastighet på 7,5 μL/min, ställ in avfallstiden på 7,8 minuter.
- Skölj ut injektionsslingan fem gånger genom att injicera 25 μL HPLC-vatten i injektionsporten med insprutningsventilen inställd på lastläget.
- Vrid insprutningsventilen manuellt uppåt till "injiceringsläge" för att spola resten av systemet. Välj Process (Ut) på kontrollprogramvaran för att börja strömma vatten. Under flödet, lyft upp produktuppsamlaren kapillärlyften genom att välja Upp under produktsamlaren så att du kan se änden av kapillären. Flöda vatten genom kapillären tills en droppe bildas.
OBS: Om en droppe inte bildas, kontrollera injektorventilen för läckor. Om det finns en läcka, lossa muttern, sätt tillbaka kapillären och sätt tillbaka.
4. Bestäm ▪oh-utbyte för att testa radikala rensningseffekter från bufferten.
- Starta flödet i Kontrollprogramvaran genom att välja Process (Ut). Ställ in blixtspänningen på 0 V på inställningsfliken. Välj Startdata + AutoZero under fliken Manuell kontroll i dataavsnittet dosimeter.
- Välj position för produktflaskan (H) och avfallsflaskan (6).
- Välj Klar, vrid manuellt insprutningsventilen till lastläge och injicera 25 μL 1 mM Adenin med 100 mM H2O2 i injektionsporten. När injektionen har injicerats vrider du insprutningsventilen manuellt upp till injektionsläget.
OBS: Detta utlöser automatiskt systemet för att starta flödet, slå på plasmakällan och hämta dosimetridata. - Öka spänningen genom att navigera till inställningsfliken och ändra blixtspänningen. Upprepa steg 4.2 och 4.3 med 500 V, 750 V, 1000 V och 1250 V. Utför avläsningen av adeninabsorbans vid varje spänning i triplikater.
- Välj fliken beräkningar för att bestämma den genomsnittliga absorbansen för varje prov. Klicka först på Väljoch välj sedan manuellt början och slutet av toppabsorbansen. Skriv i en beskrivning av exemplet i det tillgängliga utrymmet. Upprepa för alla förvärvade data.
OBS: Bubblor kan bildas som orsakar en spik i dosimeteravläsningen. När du väljer data för att bestämma genomsnittlig absorbans utelämnar du områden med bubblor. - Kopiera och klistra in data i Excel för att beräkna den genomsnittliga förändringen i adeninabsorbans för varje spänning, vilket bestämmer den effektiva ▪OH-utbytet.
- Upprepa steg 4.1-4.6 om flera provförhållanden (olika buffertar/tillsatser) används för att normalisera den effektiva ▪OH-utbytet för varje tillstånd.
5. Modifiering av protein för att upptäcka förändringar i högre ordningsstruktur.
- Blanda 4 mM adenin med 20 μM protein i ett 1-till-1-förhållande för att göra en lösning som innehåller 2 mM adenin och 10 μM protein.
- Gör släckningslösningen med 0,3 mg/ml katalas för att bryta ner överskott av väteperoxid och 35 mM metionin mitt i för att släcka eventuella återstående radikaler. Alikvot 25 μL släcklösning till ett 200 μL mikrorör så att en lika stor mängd släpning och den märkta produkten blandas.
- Späd H2O2 till 200 mM och håll på is.
- På kontrollprogramvaran på inställningsfliken startar du blixtspänningen vid 0 V för att bestämma eventuell bakgrundsoxidation.
- På den manuella kontrollfliken väljer du Startdata + AutoZero, följt av Process (Out), sedan Ready, och vrid slutligen ner insprutningsventilen till lastläget.
- Placera en släckerlösning på plats 1 på produktens samlarkarusell. På systemkontrollprogramvaran ändrar du produktflaskan till 1.
- Blanda omedelbart före injektionen 12,5 μL av adenin- och proteinblandningen med 12,5 μL H2O2 för att göra en slutlig koncentration på 1 mM Adenin, 5 μM protein och 100 mM H2O2. Försiktigt pipett upp och ner för att blanda, snurra snabbt ner och injicera 25 μL med injektionsporten inom 10 sekunder efter blandningen.
- Ställ in insprutningsventilen i injektionsläge och vänta medan provet bearbetas.
- Upprepa förvärv med 500 V, 750 V, 1000 V och 1250 V. Utför varje spänningsmätning i tre exemplar.
- Beräkna den genomsnittliga absorbansen enligt beskrivningen i steg 4.5. Kopiera och klistra in alla data i Excel.
6. Stäng av systemet
- När alla prover har samlats in, spola ut sprutporten och provslingan genom att ställa in insprutningsventilen i lastläge och injicera 25 μL HPLC-vatten fem gånger.
- Vrid insprutningsventilen till injiceringsläget för att spola resten av systemet med HPLC-vatten.
- Stoppa flödet, stäng systemkontrollprogramvaran och stäng av modulerna från och med produktsamlaren, dosimetermodulen, fotolysmodulen och slutligen fluidikmodulen.
7. Provberedning och vätskekromatografi-masspektrometri
- Denature proteinet genom att inkubera prover vid 80 °C i 20 min i närvaro av 50 mM Tris och 1 mM CaCl2. Kyl prover till rumstemperatur och tillsätt 1:20 trypsin till protein. Smält proteinet över natten vid 37 °C med provblandning. Nästa morgon, avsluta trypsin matsmältningen genom att värma prover till 95 °C i 10 minuter.
- Detektera peptider med hjälp av ett högupplöst LC-MS/MS-system som är anslutet till ett UPLC-system.
- Ladda provet först på fällan (300 μm ID X 5 mm 100 Å porstorlek, 5 μm partikelstorlek) och tvätta vid 5,0 μL/ml i 3 min med vatten som innehåller 2% lösningsmedel B (acetonitril och 0,1% myrsyra).
- Separera peptiderna på en C18-nanokola (0,75 mm x 150 mm, 2 μm partikelstorlek, 100 Å porstorlek) med en flödeshastighet på 300 nL/min med en lutning mellan lösningsmedel A (vatten som innehåller 0,1% myrsyra) och lösningsmedel B. Lutningen för peptideutspädning består av en linjär ökning från 2 till 35% B över 22 min, rampad till 95% B över 5 min och höll i 3 min för att tvätta kolonnen och återvände sedan till 2% B över 3 min och höll i 9 min för att balansera kolumnen igen.
- Hämta data i positivt jonläge. Ställ in sprutspänningen på 2400 V och temperaturen på jonöverföringsröret till 300 °C.
- Införskaffa de fullständiga MS-skanningarna från 250-2000 m/z följt av åtta efterföljande databeroende MS/MS-skanningar på de åtta mest rikliga peptidjonerna. Använd kollisionsinducerad dissociation vid 35% normaliserad energi för att fragmentera peptiderna.
- Identifiera alla oförändrade peptider som detekteras från MS/MS-analys med hjälp av en tillgänglig proteinanalysprogramvara mot den nödvändiga FASTA-filen som innehåller proteinsekvensen och det relevanta proteolytiska enzymet.
- Sök och kvantifiera modifierade peptider med hjälp av en HRPF-databehandlingsprogramvara. Oxidationens omfattning för varje identifierad peptid beräknas genom att dividera det summerade kromatografiska toppområdet för en modifierad peptid med den totala kromatografiska topparealen för den peptiden modifierad och oförändrad med hjälp av ekvation 3.
P = [I(singly oxiderad) X 1 + I (dubbelt oxiderad) X 2 + I(triply oxiderad) X 3 + .../[Iunoxidized + I(singly oxiderad) + I(dubbelt oxiderad) + I(triply oxiderad) ...]
där P betecknar det genomsnittliga antalet oxidationshändelser per peptidmolekyl, och jag representerar toppområdet för den ooxiderade peptiden (Iunoxidized) och peptiden med n oxidationshändelser.
8. För en differentialstudie, upprepa steg 5-7 på det andra villkoret.
OBS: För att bekräfta reproducerbarhet rekommenderas två biologiska replikat utöver tekniska triplicater för varje tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Högtrycksplasmakällan i kombination med dosimetri i realtid möjliggör bättre kontroll av ▪OH-utbytet för att observera förändringar i högre proteinstruktur mer exakt. Tillsatsen av adenin möjliggör en effektiv radikal dosimeter i realtid. Vid oxidation förlorar adenin UV-absorbans vid 265 nm (figur 2A). Förändringen i adeninabsorbansen är direkt relaterad till koncentrationen av radikaler som är tillgängliga för HRPF och ger därmed ett sätt att effektivt övervaka förändringar i radikal koncentration i närvaro av radikala asätare som buffertar, hjälpämnen och ligander (figur 2B).
Apomyoglobin (aMb) modifierades i närvaro av 100 mM H2O2 och 1 mM adenin vid fyra ökande plasmaspänningar (Figur 3). Sex peptider upptäcktes med en linjär ökning av oxidation med förändringen av adenin UV 265 nm absorbans. Adenin UV-absorbans är en surrogat för effektiv ▪OH-koncentration. Den linjära förändringen i oxidation kontra förändringen i radikal koncentration bekräftar frånvaron av artefaktiska förändringar i proteinets högre ordning struktur under märkning. Dessutom var omfattningen av oxidation som upptäcktes med högtrycksplasmakällan mycket högre än den laserbaserade metoden. Denna ökning beror på högtrycksplasmakällans breda UV-utsläppsspektrum (figur 4). Genom att producera ett brett UV-spektrum överlappar plasmakällan bättre absorbansdomänen H2O2 och ger effektivare produktion av ▪OH genom fotolysen av H2O2 (Figur 5). Detta är i direkt jämförelse med KrF Excimer laser och Nd:YAG laser, som är vanliga källor som fotolyserar H2O2 i HRPF studier21,27,28. Dessa lasrar har en mycket smal bandbredd i den nedre änden av H2O2:s fotometriska absorbansområde. I jämförelse med KrF-excimerlasern ökar högtrycksplasmakällan avsevärt produktionen av ▪OH samtidigt som efterfrågan på erforderlig optisk fluens ( figur6) minskar samtidigt avsevärt.
Bild 1: Komponenter i flashfotolysplattformen. A)Monterat kapillärrör, unionsrör, mutter och järn. Spetsen på kapillärens "nedre ände" sträcker sig knappt utanför unionsröret. B)Knyt mutter på produktuppsamlaren för att föra in änden av kapillären. C)Märkt insprutningsventil med sex portar. D)Sprutpump med sprutan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Förändring i adeninabsorbans som används för dosimetri. A)Vid oxidation minskar adenin i UV-absorbans vid 265 nm. B)Förändring av adeninabsorbans vid 265 nm vid olika blixtspänningar för två buffertar. Buffert 2 innehåller en radikal asätare som minskar förändringen i adeninabsorbans jämfört med buffert 1. För att övervinna de radikala rensningseffekterna från buffert 2 krävs ökad blixtspänning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Svarskurvan för apomyoglobindosen. (A) Genomsnittlig oxidation av sex peptider vs adeninförändring i absorbans visas. FPOP-oxidationsnivåer visas i de streckade linjerna. (B) De sex oxiderade peptiderna är märkta på en kristallstruktur av myoglobin (PDB: 3RGK). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Plasmalampans spektralstrålning. Högtrycksgaslampan Xe avger bredspektrum UV-strålning från 200-300 nm tillsammans med synligt ljus. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: H2O2 fotometriskt absorbansspektra. Det svarta spåret är UV-absorbansspektrumet I H2O229. Markerad i lila är de smala våglängderna hos KrF excimerlaser (248 nm) och Nd:YAG laser (265 nm) producerar medan den blå pilen representerar den breda spektrumplasmakällan som utökar intervallet för användbar H2O2-absorbans. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Plasmakällans effekt för att fotolysera H2O2. Förändringen i adeninabsorbans över ökad plasmafluens visar koncentrationen av ▪OHs genereras. Markerad i lila är en typisk maximal förändring i absorbans producerad från en KrF excimer laser25. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera kritiska steg för att säkerställa korrekt märkning av proteiner under alla HRPF-experiment. För det första väljs ett lämpligt flöde och källblixthastighet för att säkerställa att varje bolus i provet bestrålas en gång. Detta säkerställer att proteinet utsätts för en enda bolus av nybildad ▪OH. När ett protein oxideras kan proteinstrukturen i högre ordning ändras. För att vara säker på att den inhemska proteinstrukturen undersöks måste varje proteinmolekyl modifieras på ett enda ögonblick. Dosimetri kan användas för att testa om den inhemska proteinstrukturen undersöks. Eftersom koncentrationen av hydroxylradikal ökar oxidationsens omfattning linjärt om den inhemska proteinstrukturen undersöks. Men om en stor koncentration av hydroxylradikaler gör att proteinet delvis utvecklas under märkningen, kommer oxidationens omfattning att öka avsevärt, vilket ger ett effektivt sätt att säkerställa att den inhemska proteinstrukturen undersöks.
Det är också viktigt att se till att reaktionen släcks på lämpligt sätt. Detta inkluderar att införliva en korrekt radikal asätare blandad med proteinet under märkningsprocessen. För denna metod används adenin inte bara för dosimetri utan också rensar ▪OH som begränsar radikalens livslängd eftersom den märker proteinet. Genom att begränsa radikalens livslängd uppnås förtroendet för att den inhemska proteinstrukturen ändras. Efter märkningsprocessen är det viktigt att samla provet i en släcklösning som innehåller katalas och metionin amid som kommer att bryta ner överskott H2O2 och ▪OH. Att begränsa proteints exponering för H2O2 säkerställer att H2O2-inducerad oxidation minimeras.
Det är också viktigt att på lämpligt sätt välja ett proteas för peptid matsmältning. Många enzymer klyver proteinet på specifika platser. Till exempel klyver trypsin på karboxylsidan av arginin och lysinrester. Detta möjliggör enkel dataanalys, men om proteinet av intresse har ett begränsat antal argininer och lysiner, kan en alternativ proteas eller en blandning av proteaser krävas för acceptabel peptidtäckning under bottom-up proteomics. Det rekommenderas också att smälta det modifierade proteinet före långtidslagring för att undvika förlust av oxiderat protein på grund av aggregering och/ eller löslighetsproblem.
Att använda HRPF för att studera förändringar i proteinstruktur och proteininteraktioner har varitmycket framgångsrikt 11,30,31,32,33, men det finns extra komplikationer samtidigt som man märker heme-bindande proteiner eller glykoproteiner. Medan både hemebindande 34 och glykoproteiner35 har framgångsrikt sonderats med HRPF, noggrann felsökning i koncentrationen av H2O2, radikal scavenger, och tidsramen för H2O2 exponering måste balanseras. Dessutom släcker vissa buffertar ▪ OHs. Därför är det viktigt att välja en lämplig buffert och begränsa hjälpämnen som DTT och DMSO. Typiska buffertar som används under ett HRPF-experiment inkluderar acetat, natriumfosfat, fosfatbuffrad saltlösning eller låga koncentrationer av Tris-buffert. Intressant nog rensar Tris lite ▪OH, men efter oxidation ökar den i fotometrisk absorbans vid 265 nm och kan användas i stället för adenin för dosimetri36. Även om vissa buffertar kan minska den effektiva koncentrationen ▪OH, genom att införliva en in-line radikal dosimeter kan dessa utmaningar övervinnas.
HRPF använder icke-specifik irreversibl märkning genom att ▪ OHför att undersöka lösningsmedelstillgänglighet. Etikettens icke-specifika karaktär ger ökad total täckning jämfört med andra mer riktade fotavtrycksmetoder, inklusive N-etylmaleimid37 och glycinetylester38. Eftersom ändringen är oåterkallelig finns det gott om tid under provhanteringen. Detta möjliggör fullständig proteinsammanfattning och en lång LC-gradient för förbättrad MS/MS-analys. För HRPF finns det flera metoder för att generera ▪OH. En populär metod använder en laser för att fotolysera H2O2 till ▪OH. Laserbaserade plattformar har varit mycket framgångsrika när det gäller att sondera inhemsk proteinstruktur, men de kräver omfattande säkerhetsåtgärder, rigoröst underhåll och en betydande mängd utrymme.
Med hjälp av en högtrycksplasmakälla som beskrivs här finns det inget behov av skadliga gaser och ingen rädsla för herrelös UV-strålning. Livslängden för varje högtrycksplasmakälla är tillräcklig för att märka mellan 180-200 prover, och förutom att övervaka dosimetrarsvaret krävs inget ytterligare underhåll. Plasmakällan är under högt tryck, så när du hanterar plasmakällan, bär skyddsglasögon. Plasmakällan fotolyserar också H2O2 mer effektivt, vilket möjliggör ökad proteinmodifiering. Om otillräcklig märkning observeras kan H2O2-koncentrationen ökas tillsammans med ökad lampenergi för tillsatsradikal produktion. Dessutom, med införlivandet av dosimetri i realtid, kan man öka reproducerbarheten av experiment. Sammantaget, med användning av en plasmakälla i kombination med dosimetri i realtid och programvara för automatiserad FPOP-databeräkning, ger ett fördelaktigt paket för att utföra HRPF-experiment på ett säkert, lättare att använda och med förbättrad reproducerbarhet jämfört med vanliga laserbaserade metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
E.E.C., J.S.S., och S.R.W. avslöjar ett betydande finansiellt intresse i GenNext Technologies, Inc., ett företag i ett tidigt skede som försöker kommersialisera teknik för analys av proteinstruktur med högre order. De representativa uppgifter som lämnats har granskats av S.K.M., som inte har någon finansiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 och R44GM125420).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
- Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
- Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
- Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
- Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
- Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R.
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
- Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
- Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
- Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
- Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
- Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
- Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
- Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
- Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
- Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
- Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
- Linde. Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
- Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
- Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
- Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).
- Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).
- Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
- Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).
- Ultraviolet Absorption Spectrum of Hydrogen Peroxide. , Available from: http://www.h2o2.com/technical-library/physical-chemical-properties/radiation-properties/default.aspx?pid=65&name=Ultraviolet-Absorption-Spectrum (2016).
- Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
- Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
- Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
- Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
- Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
- Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
- Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).
