レーザーフリーヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリントによるタンパク質の高次構造解析
Summary
このプロトコルは、インラインラジカル線測定とプラズマ光源を使用して、フラッシュ酸化タンパク質のフットプリントを実行する方法を提示する。この方法は、タンパク質研究の高速光化学酸化の再現性を簡素化し、改善するために、危険なUVレーザーを置き換えます。
Abstract
Hydroxylラジカルプロテインフットプリント(HRPF)は、タンパク質構造の変化、タンパク質とタンパク質の相互作用、またはタンパクリガンド相互作用に関する情報を提供する、新たな有望な高次構造解析技術です。HRPFは、ヒドロキシルラジカル(▪OH)を利用して、タンパク質の溶媒アクセス可能な表面を不可逆的に標識します。HRPFを実行する本質的な複雑さ、コスト、および危険な性質は、バイオ医薬品における広範な採用を実質的に制限しています。これらの要因には、1)実質的な安全対策を必要とする複雑で危険で高価なレーザーの使用が含まれます。2)比較研究を制限する ▪OHのバックグラウンド清掃によって引き起こされるHRPFの再現性。本書は、レーザーフリーHRPFシステムの動作プロトコルを提供します。このレーザーフリーHRPFシステムは、インラインラジカル線量測定を用いた高エネルギー、高圧プラズマ光源フラッシュ酸化技術を利用しています。プラズマ光源は、レーザーベースのHRPFシステムよりも安全で使いやすく、ヒドロキシルラジカルの生成効率が高く、インラインラジカル線量計は研究の再現性を高めます。レーザーフリーHRPFシステムを組み合わせることで、レーザーベースの技術の欠点と限界に対処し、克服します。
Introduction
タンパク質の立体構造および関連する高次構造(HOS)は、適切な生物学的機能および異常な挙動1の主要な決定因子である。同じことが、その構造と機能活性が生産と環境の様々な側面に依存しているバイオ医薬品にも当てはまります。HOSのバイオ医薬品の変化は、望ましくない薬理学的および患者免疫学的応答2、3に起因する有害薬物反応(ADR)に関連している。ADRの出現は、タンパク質HOSがバイオ医薬品の安全性と有効性において果たす重要な役割をバイオ医薬品業界に警告し、HOS分析4を新しく改良する必要性を確立しました。
ヒドロキシルラジカルプロテインフットプリント(HRPF)は、タンパク質HOSの変化を追跡する有望な技術です。HRPFは、OH▪を伴うタンパク質の外装の不可逆的な標識を伴い、続いて質量分析(MS)分析を行い、タンパク質5、6、7の溶媒アクセス可能表面を同定する。HRPFは、タンパク質HOSとその機能8、9の欠陥の検出に成功し、モノクローナル抗体(mAb)10、11、12、13のHOSを特徴付け、リガンド14の結合Kdを決定し、さらに多くの15、16、17、18、19を検出する。HRPF用の▪OHを生成する一般的な方法は、タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)であり、H2O2の光起こしから▪OHを生成するために高エネルギー、高速UVレーザーを採用している。ほとんどの場合、FPOPは、呼吸および眼の損傷を避けるために相当な保護手段を要求する危険ガス(KrF)を採用した高価なエキシマレーザーを使用する20。吸入の危険を避けるために、他の人は、有毒ガスの使用を排除するが、依然として高価であり、重要な運用上の専門知識を必要とし、目の怪我からユーザーを保護するために広範な迷子光制御を要求する周波数四足数ネオジムイットリウムアルミニウムガーネット(Nd:YAG)レーザー21を使用しています。
HRPFを用いて十分な情報を得ることができるが、バイオ医薬品の幅広い採用は満たされていない。限られたHRPFの採用のための2つの障壁は、1)実質的な安全対策20を必要とする危険で高価なレーザーの使用を含む;2)比較研究を制限する ▪OHのバックグラウンド清掃によって引き起こされるHRPFの再現性を22.レーザー使用に取って代わる高速、高エネルギープラズマフラッシュ光度ユニットは、FPOPを安全に簡単に行うために開発されました。HRPF実験の再現性を向上させるために、リアルタイムラジカルドジメトリーが実施される。
HRPFの実践は、▪OH22のバックグラウンド清掃に起因する再現性の不足によって制限されている。▪OHはタンパク質トポグラフィーの優れたプローブですが、調製物に見られる多くの成分と反応するため、標的タンパク質を酸化するために利用可能なラジカルの有効濃度を測定する必要があります。バッファー調製、過酸化水素濃度、リガンド特性、または光分解の変動は、HOS微分試験において曖昧さを生み出す対照群と実験群の間に酸化的な違いをもたらす可能性がある。リアルタイムラジカル・ドジメトリーの追加により、OH負荷▪効果の調整が可能になり、HRPF実験中の信頼性と再現性が向上します。FPOPにおけるラジカル・ドシメトリーの使用は、他の場所で説明されている23,24,25、最近の刊行26で詳しく論じられています。ここでは、新しいフラッシュ光反応系とリアルタイムの量体系を用いて、エキシマレーザーを用いた場合のFPOP実験におけるペプチド酸化のレベルを比較して、馬のアポミオグロビン(aMb)を標識する。
Protocol
Representative Results
Discussion
HRPF実験中にタンパク質の適切な標識を確実に行うためには、いくつかの重要なステップがあります。まず、適切な流量とソースフラッシュレートが、試料の各ボーラスが一度照射されるのを確実にするために選択される。これにより、タンパク質が新たに形成された ▪OHの単一のボーラスにさらされることが保証されます。タンパク質が酸化されると、より高次のタンパク質構造を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立一般医学研究所(R43GM125420およびR44GM125420)によって資金提供されました。
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
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