Empreinte de protéines de radicaux hydroxyles sans laser pour effectuer une analyse structurelle d’ordre supérieur des protéines
Summary
Ce protocole présente une méthode pour utiliser la dosimétrie radicale en ligne et une source de lumière plasma pour effectuer l’empreinte des protéines d’oxydation flash. Cette méthode remplace le laser UV dangereux pour simplifier et améliorer la reproductibilité de l’oxydation photochimique rapide des études de protéines.
Abstract
L’empreinte des protéines du radical hydroxyle (HRPF) est une technique d’analyse structurelle d’ordre supérieur émergente et prometteuse qui fournit des informations sur les changements dans la structure des protéines, les interactions protéine-protéine ou les interactions protéine-ligand. HRPF utilise des radicaux hydroxyles(▪OH) pour étiqueter de manière irréversible la surface accessible au solvant d’une protéine. La complexité inhérente, le coût et la nature dangereuse de l’exécution du FPRH ont considérablement limité l’adoption à grande échelle dans la biopharmaceutique. Ces facteurs comprennent : 1) l’utilisation de lasers compliqués, dangereux et coûteux qui exigent des précautions de sécurité importantes; et 2) l’irréprochabilité du HRPF causée par le nettoyage de fond de ▪l’OH qui limitent les études comparatives. Cette publication fournit un protocole pour le fonctionnement d’un système HRPF sans laser. Ce système HRPF sans laser utilise une technologie d’oxydation flash de source de lumière plasma à haute énergie et à haute pression avec dosimétrie radicale en ligne. La source de lumière plasmatique est plus sûre, plus facile à utiliser et plus efficace pour générer des radicaux hydroxyles que les systèmes HRPF à base de laser, et le dosimètre radicalaire en ligne augmente la reproductibilité des études. Combiné, le système HRPF sans laser résout et surmonte les lacunes et les limites mentionnées des techniques laser.
Introduction
La conformation des protéines et la structure d’ordre supérieur (HOS) associée sont les principaux déterminants de la bonne fonction biologique et du comportement aberrant1. Il en va de même pour les produits biopharmaceutiques, dont la structure et l’activité fonctionnelle dépendent de divers aspects de leur production et de leur environnement. Les changements biopharmaceutiques dans hos ont été liés aux réactions défavorables de drogue (ADR) attribuées à la pharmacologie indésirable et à la réponse immunologique patient2,3. L’apparition des ADR a alerté l’industrie biopharmaceutique sur le rôle essentiel que joue le HOS protéique dans la sécurité et l’efficacité des produits biothérapeutiques, et ils ont établi le besoin d’analyses HOS nouvelles et améliorées4.
L’empreinte des protéines radicales hydroxyles (HRPF) est une technique prometteuse pour suivre l’évolution de la protéine HOS. Hrpf implique le marquage irréversible de l’extérieur d’une protéine avec ▪OH suivi d’une analyse par spectrométrie de masse (MS) pour identifier la surface accessible au solvant de la protéine5,6,7. HRPF a été utilisé avec succès pour détecter des défauts dans la protéine HOS et sa fonction8,9,caractériser le HOS d’anticorps monoclonaux (mAb)10,11,12,13,déterminer la liaison Kd d’un ligand14,et bien plusencore 15,16,17,18,19. Une méthode courante pour générer l’OH ▪pour HRPF est l’oxydation photochimique rapide des protéines (FPOP), qui utilise des lasers UV rapides à haute énergie pour produire de l’▪OH à partir de la photolyse deH2O2. Pour la plupart, FPOP utilise des lasers excimer coûteux utilisant des gaz dangereux (KrF) qui exigent des garanties substantielles pour éviter les blessures respiratoires et oculaires20. Pour éviter les risques d’inhalation, d’autres ont utilisé des lasers grenat en aluminium à yttrium en néodyme quadruple de fréquence (Nd: YAG)21, qui éliminent l’utilisation de gaz toxiques mais sont toujours coûteux, nécessitent une expertise opérationnelle importante et exigent des contrôles de lumière parasite étendus pour protéger les utilisateurs contre les blessures oculaires.
Bien qu’il soit possible d’obtenir de nombreux renseignements à l’aide du HRPF, l’adoption à grande échelle dans le secteur biopharmaceutique n’a pas été respectée. Deux obstacles à l’adoption limitée du HRPF comprennent: 1) l’utilisation de lasers dangereux et coûteux qui exigent des précautions de sécurité substantielles20; et 2) l’irréprochabilité du HRPF causée par le nettoyage de fond des ▪OH qui limitent les études comparatives22. Pour supplanter l’utilisation du laser, une unité de photolyse flash plasma à haute vitesse et à haute énergie a été développée pour effectuer en toute sécurité le FPOP d’une manière facile. Pour améliorer l’irréprochabilité des expériences HRPF, une dosimétrie radicale en temps réel est mise en œuvre.
La pratique du HRPF a été limitée par l’irréprochabilité attribuée au nettoyage de fond de ▪OH22. Bien que les ▪OH soient d’excellentes sondes de la topographie des protéines, elles réagissent également avec de nombreux constituants présents dans les préparations, ce qui rend nécessaire de mesurer la concentration efficace de radical disponible pour oxyder une protéine cible. Les variations dans la préparation tampon, la concentration de peroxyde d’hydrogène, les propriétés de ligand, ou la photolyse peuvent avoir comme conséquence des différences d’oxydation entre le groupe témoin et le groupe expérimental qui créent l’ambiguïté dans des études différentielles hos. L’ajout de la dosimétrie radicale en temps réel permet l’ajustement de l’effet ▪charge OH et augmente donc la confiance et la reproductibilité lors d’une expérience HRPF. L’utilisation de la dosimétrie radicale dans le FPOP a été décrite ailleurs23,24,25,et est discutée plus en détail dans une publication récente26. Ici, nous décrivons l’utilisation d’un nouveau système de photolyse flash et dosimétrie en temps réel pour étiqueter l’apo-myoglobine équine (aMb), en comparant les niveaux d’oxydation peptidique dans une expérience FPOP à celle obtenue lors de l’utilisation d’un laser excimer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a plusieurs étapes critiques pour assurer le bon étiquetage des protéines pendant toute expérience HRPF. Tout d’abord, un débit et un débit d’éclair à la source appropriés sont choisis pour s’assurer que chaque bolus de l’échantillon est irradié une fois. Cela garantit que la protéine est exposée à un seul bolus de ▪OH nouvellement formé. Une fois qu’une protéine est oxydée, la structure protéique d’ordre supérieur peut être modifiée. Pour être sûr que la structure pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par l’Institut national des sciences médicales générales (R43GM125420 et R44GM125420).
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
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