Laserfreies Hydroxylradikalprotein-Footprinting zur Durchführung einer Strukturanalyse höherer Ordnung von Proteinen
Summary
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Verwendung von Inline-Radikaldosimetrie und einer Plasmalichtquelle vor, um Flash-Oxidationsprotein-Footprinting durchzuführen. Diese Methode ersetzt den gefährlichen UV-Laser, um die Reproduzierbarkeit der schnellen photochemischen Oxidation von Proteinstudien zu vereinfachen und zu verbessern.
Abstract
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) ist eine aufstrebende und vielversprechende Strukturanalysetechnik höherer Ordnung, die Informationen über Veränderungen der Proteinstruktur, Protein-Protein-Interaktionen oder Protein-Liganden-Interaktionen liefert. HRPF verwendet Hydroxylradikale(▪OH), um die lösungsmittelzugängliche Oberfläche eines Proteins irreversibel zu kennzeichnen. Die inhärente Komplexität, die Kosten und die Gefährlichkeit der HrPF-Durchführung haben die breite Akzeptanz in der Biopharmazie erheblich eingeschränkt. Zu diesen Faktoren gehören: 1) die Verwendung komplizierter, gefährlicher und teurer Laser, die erhebliche Sicherheitsvorkehrungen erfordern; und 2) die Irreproduzierbarkeit von HRPF, die durch Hintergrundabfangen von ▪OH verursacht wird, die vergleichende Studien einschränken. Diese Veröffentlichung enthält ein Protokoll für den Betrieb eines laserfreien HRPF-Systems. Dieses laserfreie HRPF-System nutzt eine hochenergetische Hochdruck-Plasma-Lichtquellen-Blitzoxidationstechnologie mit Inline-Radikaldosimetrie. Die Plasmalichtquelle ist sicherer, einfacher zu bedienen und effizienter bei der Erzeugung von Hydroxylradikalen als laserbasierte HRPF-Systeme, und das Inline-Radikaldosimeter erhöht die Reproduzierbarkeit von Studien. In Kombination adressiert und überwindet das laserfreie HRPF-System die genannten Mängel und Grenzen laserbasierter Techniken.
Introduction
Proteinkonformation und die damit verbundene Struktur höherer Ordnung (HOS) sind die Hauptdeterminanten der richtigen biologischen Funktion und des abweichenden Verhaltens1. Gleiches gilt für Biopharmazeutika, deren Struktur und funktionelle Aktivität von verschiedenen Aspekten ihrer Produktion und Umgebung abhängt. Biopharmazeutische Veränderungen in HOS wurden mit unerwünschten Arzneimittelwirkungen (ADR) in Verbindung gebracht, die auf unerwünschte Pharmakologie und immunologisches Ansprechen des Patienten zurückzuführen sind2,3. Das Auftreten von ADRs hat die biopharmazeutische Industrie auf die entscheidende Rolle aufmerksam gemacht, die protein HOS für die Sicherheit und Wirksamkeit von Biotherapeutika spielt, und sie haben den Bedarf an neuen und verbesserten HOS-Analysen festgestellt4.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) ist eine vielversprechende Technik, um die Veränderung des Proteins HOS zu verfolgen. HRPF beinhaltet die irreversible Markierung der Außenseite eines Proteins mit ▪OH, gefolgt von einer Massenspektrometrie (MS) -Analyse, um die lösungsmittelzugängliche Oberfläche des Proteins5,6,7zu identifizieren . HRPF wurde erfolgreich eingesetzt, um Defekte im Protein HOS und seine Funktion8,9, charakterisieren die HOS von monoklonalen Antikörpern (mAb)10,11,12,13, bestimmen die Bindung Kd eines Liganden14und vieles mehr15,16,17,18,19. Eine gängige Methode zur Erzeugung der ▪OH für HRPF ist die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (FPOP), bei der hochenergetische, schnelle UV-Laser verwendet werden,um ▪ OH aus der Photolyse vonH2O2herzustellen. In den meisten Fällen verwendet FPOP teure Excimer-Laser mit gefährlichem Gas (KrF), die erhebliche Sicherheitsvorkehrungen erfordern, um Atem- und Augenverletzungen zu vermeiden20. Um Inhalationsgefahren zu vermeiden, haben andere Frequenzvervierfachte Neodym-Yttrium-Aluminium-Granat-Laser (Nd: YAG)21verwendet, die den Einsatz von giftigen Gasen eliminieren, aber immer noch teuer sind, erhebliche Betriebskenntnisse erfordern und umfangreiche Streulichtsteuerungen erfordern, um Benutzer vor Augenverletzungen zu schützen.
Obwohl mit HRPF umfangreiche Informationen gewonnen werden können, wurde eine breite Akzeptanz in der Biopharmazie nicht erreicht. Zwei Hindernisse für die begrenzte HRPF-Einführung sind: 1) die Verwendung gefährlicher und teurer Laser, die erhebliche Sicherheitsvorkehrungen erfordern20; und 2) die Unreproduzierbarkeit von HRPF, die durch Hintergrundabfangen von ▪OH verursacht wird, die vergleichende Studieneinschränken 22. Um den Lasereinsatz zu ersetzen, wurde eine Hochgeschwindigkeits-Plasmablitz-Photolyseeinheit mit hoher Energie entwickelt, um FPOP auf einfache Weise sicher durchzuführen. Um die Irreproduzierbarkeit von HRPF-Experimenten zu verbessern, wird eine Echtzeit-Radikaldosimetrie implementiert.
Die Praxis der HRPF wurde durch die Irreproduzierbarkeit eingeschränkt, die auf die Hintergrundabfängerung von ▪OH22zurückzuführen ist. Während ▪OH ausgezeichnete Sonden der Proteintopographie sind, reagieren sie auch mit vielen Bestandteilen, die in Präparaten gefunden werden, so dass es notwendig ist, die effektive Konzentration von Radikalen zu messen, die zur Oxidation eines Zielproteins zur Verfügung stehen. Variationen in der Puffervorbereitung, Wasserstoffperoxidkonzentration, Ligandeneigenschaften oder Photolyse können zu Oxidationsunterschieden zwischen Kontroll- und Experimentellengruppen führen, die in HOS-Differentialstudien zu Mehrdeutigkeiten führen. Die Hinzufügung der Echtzeit-Radikaldosimetrie ermöglicht die Anpassung des Effekts ▪OH-Last und erhöht somit die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit während eines HRPF-Experiments. Die Verwendung der Radikaldosimetrie in FPOP wurde an anderer Stelle23,24,25beschrieben und in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung26ausführlich diskutiert. Hier beschreiben wir die Verwendung eines neuartigen Flash-Photolysesystems und einer Echtzeitdosimetrie zur Markierung von Apo-Myoglobin (aMb) von Pferden und vergleichen die Niveaus der Peptidoxidation in einem FPOP-Experiment mit denen, die bei verwendung eines Excimer-Lasers erhalten wurden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere kritische Schritte, um die korrekte Markierung von Proteinen während eines HRPF-Experiments sicherzustellen. Zunächst werden eine geeignete Durchflussrate und eine geeignete Quellblitzrate ausgewählt, um sicherzustellen, dass jeder Bolus der Probe einmal bestrahlt wird. Dies stellt sicher, dass das Protein einem einzigen Bolus neu gebildeter ▪OH ausgesetzt wird. Sobald ein Protein oxidiert ist, kann die Proteinstruktur höherer Ordnung verändert werden. Um sicher zu sein, dass die native …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 und R44GM125420) finanziert.
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
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