Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Laserfri Hydroxyl Radical Protein Footprinting til at udføre højere orden strukturel analyse af proteiner

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/61861
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 2
1GenNext Technologies Inc., 2Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, University of Mississippi, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi

Summary

Denne protokol præsenterer en metode til at bruge inline radikal dosimetri og en plasmalyskilde til at udføre flash oxidationsproteinfodaftryk. Denne metode erstatter den farlige UV-laser for at forenkle og forbedre reproducerbarheden af hurtig fotokemisk oxidation af proteinundersøgelser.

Abstract

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) er en ny og lovende strukturanalyseteknik med højere orden, der giver information om ændringer i proteinstruktur, proteinproteininteraktioner eller protein-ligand-interaktioner. HRPF udnytter hydroxylradikaler (▪OH) til uigenkaldeligt at mærke et proteins opløsningsmiddeltilgængelige overflade. Den iboende kompleksitet, omkostninger og farlige karakter af at udføre HRPF har i væsentlig grad begrænset bredt funderet anvendelse i biopharma. Disse faktorer omfatter: 1) brugen af komplicerede, farlige og dyre lasere, der kræver betydelige sikkerhedsforanstaltninger; og 2) den irreproducibility af HRPF forårsaget af baggrund scavenging af ▪OH, der begrænser sammenlignende undersøgelser. Denne publikation indeholder en protokol til drift af et laserfrit HRPF-system. Dette laserfri HRPF-system anvender en højenergi, højtryksplasmalyskilde flash oxidationsteknologi med in-line radikal dosimetri. Plasmalyskilden er sikrere, lettere at bruge og mere effektiv til at generere hydroxylradikaler end laserbaserede HRPF-systemer, og det in-line radikale dosimeter øger reproducerbarheden af undersøgelser. Tilsammen adresserer og overvinder det laserfri HRPF-system de nævnte mangler og begrænsninger ved laserbaserede teknikker.

Introduction

Proteinformation og tilhørende højere ordensstruktur (HOS) er de vigtigste determinanter for korrekt biologisk funktion og afvigende adfærd1. Det samme gælder for biofarmaceutiske lægemidler, hvis struktur og funktionelle aktivitet er afhængig af forskellige aspekter af deres produktion og miljø. Biofarmaceutiske ændringer i HOS har været forbundet med bivirkninger (ADR), der tilskrives uønsket farmakologi og patientens immunologiskerespons 2,3. Udseendet af BIVIRKNINGER har advaret den biofarmaceutiske industri om den kritiske rolle, som protein HOS spiller i sikkerheden og effekten af bioterapeutiske lægemidler, og de har fastslået behovet for nye og forbedrede HOS-analyser4.

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) er en lovende teknik til at spore ændringen i protein HOS. HRPF indebærer uoprettelig mærkning af et proteins ydre med ▪OH efterfulgt af ms-analyse (mass spektrometri) til identifikation af proteinets opløsningsmiddeltilgængelige overflade5,6,7. HRPF er med succes blevet brugt til at opdage defekter i protein HOS og dets funktion8,9, karakteriserer HOS af monoklonale antistoffer (mAb)10,11,12,13, bestemme binding Kd af en ligand14, og meget mere15,16,17,18,19. En almindelig metode til at generere ▪OH for HRPF er Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP), som anvender højenergi, hurtige UV-lasere til at producere ▪OH fra fotolyse af H2O2. FPOP anvender for det meste dyre excimerlasere, der anvender farlig gas (KrF), som kræver betydelige sikkerhedsforanstaltninger for at undgå åndedræts- og øjenskader20. For at undgå indånding farer, andre har brugt frekvens firedoblet neodymium yttrium aluminium granat (Nd:YAG) lasere21, som eliminerer brugen af giftige gas, men er stadig dyrt, kræver betydelig operationel ekspertise, og kræver omfattende omstrejfende lys kontrol for at beskytte brugerne mod øjenskader.

Selv om der kan indhentes rigelige oplysninger ved hjælp af HRPF, er bred anvendelse i biopharma ikke blevet opfyldt. To hindringer for den begrænsede HRPF-vedtagelse omfatter: 1) anvendelse af farlige og dyre lasere, der kræver betydelige sikkerhedsforanstaltninger20; og 2) hrpf's irreproducibilitet som følge af baggrundsudledning af ▪OH, der begrænser sammenlignende undersøgelser22. Til supplant laser brug, en høj hastighed, høj energi plasma flash fotolyse enhed blev udviklet til sikkert at udføre FPOP på en letkøbt måde. For at forbedre irreproducibility af HRPF eksperimenter, real-time radikal dosimetri er gennemført.

Hrpf's praksis har været begrænset af irreproducibility, der tilskrives baggrundsudledning af ▪OH22. Mens ▪OH er fremragende sonder af proteintopografi, reagerer de også med mange bestanddele, der findes i præparater, hvilket gør det nødvendigt at måle den effektive koncentration af radikal, der er tilgængelig for at oxidere et målprotein. Variationer i bufferpræparat, hydrogenperoxidkoncentration, ligandegenskaber eller fotolyse kan resultere i oxidationsforskelle mellem kontrol- og eksperimentelle grupper, der skaber tvetydighed i HOS-differentialundersøgelser. Tilføjelsen af radikal dosimetri i realtid gør det muligt at justere effekten ▪OH-belastning og øger derfor tilliden og reproducerbarheden under et HRPF-eksperiment. Brugen af radikal dosimetri i FPOP er beskrevet andetsteds23,24,25og diskuteres yderligere i detaljer i en nylig publikation26. Her beskriver vi brugen af en ny flash fotolyse system og real-time dosimetri til mærkning heste apo-myoglobin (aMb), sammenligne niveauer af peptid oxidation i en FPOP eksperiment til den opnåede, når du bruger en excimer laser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Installation af kapillærrøret

  1. Ved hjælp af en silica kløvning sten, kløve 250 μm indre diameter (ID) silica kapillær til 27 inches. Kontroller kapillærenderne for et rent, lige snit.
  2. Opret to vinduer ca. 15 mm i længden ved at brænde polyimidbelægningen væk. Fra den "nederste ende" laves det første fotolysevindue 90 mm væk fra den "nedre ende" og det andet dosimetervindue 225 mm væk fra den "nedre ende".
    BEMÆRK: Når belægningen er brændt væk kapillæren er meget skrøbelig.
  3. Møtrikken og ferrulen i port 5 fjernes, og kapillærens "nedre ende" indsættes lige uden for ferrulens koniske ende(figur 1A).
  4. På fotolysemodulet skal du fjerne fotolysecellehætten ved at trække den lige ud og derefter fjerne den magnetisk monterede metalmaske, som holder kapillæren på plads.
    ADVARSEL: Inde i fotolyse cellehætten er et buet spejl, lad ikke noget røre spejlet.
  5. Åbn dosimetercellen på dosimetermodulet ved at trykke på fanen til venstre og svinge dosimetercellen åben til højre. Fjern de magnetisk monterede klip, som holder kapillæren på plads.
  6. Placer kapillæren i den rillede kanal i bunden af fotolyscellen. Centrer kapillærvinduet med fotolysecellevinduet. Mens du holder kapillæren på plads med den ene hånd, tilsæt den magnetiske maske for at holde kapillæren på plads. Placer fotolysehætten tilbage på plads.
  7. Placer kapillæren i den rillede kanal i bunden af dosimetercellen. Centrer det andet kapillærvindue på den lille blænde i midten af dosimetercellebasen. Mens du holder kapillæren på plads med den ene hånd, skal du placere de to magnetiske klip på plads for at holde kapillæren på plads. Luk dosimetercellen, indtil den klikker lukket.
  8. Kapillæren indsættes gennem den strikkede møtrik oven på produktopsamlerens kapillærløftning (Figur 1B). Udvid kapillæren til lige over bunden af hætteglasset.
    BEMÆRK: Det er vigtigt for kapillæren at nå bunden af hætteglasset for at sikre, at kapillæren er nedsænket i sænkopløsningen, mens der køres et eksperiment.

2. Installation af en injektionssløjfe

  1. Brug Teflon-slanger med en ydre diameter på 1/16" og en indvendig diameter på 0,015" (381 μm). Følg ligning 1 for at beregne længden af slangen er nødvendig for det ønskede volumen ved hjælp af ligning 1.
    Equation 1
    Hvor L er længden af slangen i millimeter, V er det ønskede volumen i mikroliter og d er røret indre diameter i millimeter. For et injektionsvolumen på 25 μL og en indvendig diameter på 381 μm skal slangelængden være ca. 219,3 mm.
    BEMÆRK: For mængder under 20 μL anvendes PTFE-slanger med en indvendig diameter på 0,01".
  2. Skær Teflon-slangen til den nødvendige længde ved hjælp af en rørskærer. Kontroller enderne af røret for et rent, lige snit.
  3. Sæt den ene ende af den nye injektionssløjfe gennem en af møtrikkerne, og placer en ny ferrule på enden af røret. Hold ferrule og møtrik på plads og indsæt røret i port 3 af injektionsventilen, indtil den bunder ud i ventilen. Hold røret fast og stram møtrikfingeren stramt. Brug en skruenøgle, stramme møtrik 1 / 4 vende yderligere. Fjern og undersøg samlingen.
    BEMÆRK: Hvis ferrule ikke er fastgjort på plads, geninstallere og stramme 1 / 8 vende yderligere. Gentag med den anden ende af løkken.
  4. Når begge ender har en møtrik og fast ferrule, skrues den ene ende løst til port 3 og den anden ende til port 6(Figur 1C). Når du er i position stramme begge sider til finger stramt derefter 1 / 4 vende forbi finger stramt med en skruenøgle.

3. Initialiser fotolysesystemet

  1. Tænd fotolysemodulerne i følgende rækkefølge: (1) Fluidics Module (2) Photolysis Module (3) DosimetriModul (4) Product Collector, og til sidst (5) systemcomputeren og start kontrolsoftwaren
    BEMÆRK: Lad Dosimeter-modulet varme op mindst en halv time fra en kold start.
  2. Helt nedsænkes slanger fra "Valve" position på sprøjte pumpen(Figur 1D)i 10 mL buffer. Placer slangen fra "Affaldspositionen" (figur 1D) og slangen fra port 2 på sprøjteporten (Figur 1C) til en tom beholder til indsamling af affald.
    BEMÆRK: Brug bufferen dit protein vil blive suspenderet i. En anbefalet buffer er 10 mM NaPO4.
  3. På product collector-karrusellen anbringes 1,5 mL mikrocentrifugerør på positionen H og 6.
  4. Hvis der bruges 250 μm ID-kapillær, indstilles belastningshastigheden til 500 μL/min., der skal behandles strømningshastighed til 7,5 μL/min. og affaldsstrømningshastigheden til 500 μL/min.
  5. Beregn flashforsinkelsen, produkttiden og spild tid på at bruge semiautomatisk tilstand ved hjælp af ligning 2.
    Equation 2
    Hvor t er tiden i minutter, s er kapillærafstanden i millimeter, d er kapillærens indre diameter i millimeter, og f er strømningshastigheden i μL/min.
    1. For flashforsinkelsen er afstanden fra kapillærens "nederste ende" til det første vindue, som skal være ca. 90 mm. Ved hjælp af 250 μm ID kapillær og en behandlingsstrøm på 7,5 μL/min ankommer prøven til fotolysevinduet om ca. 35 sekunder. Tillad, at der opstår to blink ved 1 Hz, før prøverne ankommer, så indstil flashforsinkelsen til 33 sekunder.
    2. For produkttiden skal du indtaste den mængde tid, det vil tage at strømme fra injektionsventilen til slutningen af kapillæren. I en 27" lang 250 μm ID kapillær skal du indstille produkttiden til 4,5 minutter.
    3. For spildtiden skal du indtaste den tid, det samlede volumen af injiceret opløsning vil tage at blive indsamlet. På nuværende tidspunkt vil produktindsamleren flytte fra produktpositionen til affaldsglasset. For en injektionsvolumen på 25 μL og en strømningshastighed på 7,5 μL/min skal spildtiden indstilles til 7,8 minutter.
  6. Injektionssløjfen skylles fem gange ved at indsprøjte 25 μL HPLC-vand i injektionsporten, mens injektionsventilen er indstillet til lastpositionen.
  7. Vend manuelt injektionsventilen op til 'injektionsposition' for at skylle resten af systemet. Vælg Proces (Ud) på kontrolsoftwaren for at begynde at flyde vand. Mens du flyder, skal du hæve produktets opsamlerkapillarløft ved at vælge Op under produktopsamleren, så du kan se enden af kapillæren. Flow vand gennem kapillæren, indtil der dannes en dråbe.
    BEMÆRK: Hvis der ikke dannes en dråbe, skal du kontrollere injektorventilen for lækager. Hvis der er en lækage, skal du løsne møtrikken, forsegle kapillæren igen og retighten igen.

4. Bestem det faktiske ▪OH-udbytte for at teste radikale skyllevirkninger fra bufferen.

  1. Start flowet i kontrolsoftwaren ved at vælge Proces (ud). Indstil flashspændingen til 0 V under fanen Indstillinger. Vælg Start data + Autozerounder fanen Manuel kontrol i afsnittet dosimeterdata .
  2. Vælg positionen for produktglasset (H) og affaldsglasset (6).
  3. Vælg Klar, vend manuelt injektionsventilen ned til lastpositionen, og indsprøjt 25 μL 1 mM Adenin med 100 mM H2O2 i injektionsporten. Når injektionen er injiceret, skal injektionsventilen drejes op til injektionspositionen manuelt.
    BEMÆRK: Dette udløser automatisk systemet til at starte flowet, tænde plasmakilden og hente dosimetridataene.
  4. Ramp spændingen op ved at navigere til indstillingsfanen og ændre flashspændingen. Gentag trin 4.2 og 4.3 ved hjælp af 500 V, 750 V, 1000 V og 1250 V. Udfør aflæsning af adeninabsorpion ved hver spænding i tre eksemplarer.
  5. Vælg fanen Beregninger for at bestemme den gennemsnitlige absorbans for hver prøve. Klik først på Vælg, og vælg derefter manuelt begyndelsen og slutningen af topabsorpmentet. Skriv i en beskrivelse af eksemplet på den tilgængelige plads. Gentag dette for alle erhvervede data.
    BEMÆRK: Bobler kan danne forårsager en stigning i dosimeter læsning. Når du vælger data for at bestemme den gennemsnitlige absorbans, skal du udelade områder med bobler.
  6. Kopier og indsæt data i Excel for at beregne den gennemsnitlige ændring i adeninabsorptance for hver spænding, hvilket bestemmer den effektive ▪OH-udbytte.
  7. Gentag trin 4.1-4.6, hvis der anvendes flere prøvebetingelser (forskellige buffere/tilsætningsstoffer) til at normalisere det effektive ▪OH-udbytte for hver tilstand.

5. Ændring af protein til påvisning af ændringer i højere orden struktur.

  1. Der blandes 4 mM adenin med 20 μM protein i et en-til-en-forhold for at fremstille en opløsning, der indeholder 2 mM adenin og 10 μM protein.
  2. Lav stødopløsningen ved hjælp af 0,3 mg/ml katalase for at nedbryde overskydende hydrogenperoxid og 35 mM methionin midt for at slukke eventuelle resterende radikaler. Aliquot 25 μL stødopløsning i et 200 μL mikrorør, således at der blandes en tilsvarende mængde stød og det mærkede produkt.
  3. H 2 O2til200 mM fortyndes, og isen skal opbevares.
  4. Start flashspændingen ved 0 V under fanen Indstillinger for at bestemme baggrundsoxidationen.
  5. Vælg Start data + AutoZerounder fanen Manuel styring efterfulgt af Proces (Ud), Derefter Klar, og drej til sidst injektionsventilen ned til belastningspositionen.
  6. Placer en syrlig opløsning på plads 1 på produktets opsamlingskarrusel. På System Control Software ændre produktets hætteglas til 1.
  7. Umiddelbart før injektion blandes 12,5 μL af adenin- og proteinblandingen med 12,5 μL H2O2 for at foretage en endelig koncentration på 1 mM Adenin, 5 μM protein og 100 mM H2O2. Rør forsigtigt op og ned for at blande, drej hurtigt ned, og injicere 25 μL ved hjælp af injektionsporten inden for 10 sekunder efter blanding.
  8. Skift injektionsventilen til injektionspositionen, og vent, mens prøven behandles.
  9. Gentag anskaffelse med 500 V, 750 V, 1000 V og 1250 V. Udfør hver spændingsmåling i tre eksemplarer.
  10. Den gennemsnitlige absorbans beregnes som beskrevet i trin 4.5. Kopier og indsæt alle data i Excel.

6. Luk systemet ned

  1. Når alle prøver er indsamlet, skylles sprøjteporten og prøvesløjfen ud ved at indstille injektionsventilen til lastpositionen og injicere 25 μL HPLC-vand fem gange.
  2. Drej injektionsventilen op til injektionspositionen for at skylle resten af systemet med HPLC-vand.
  3. Stop flowet, luk systemstyringssoftwaren, og sluk modulerne startende med produktindsamleren, dosimetermodulet, fotolysemodulet og til sidst fluidikmodulet.

7. Prøveforberedelse og væskekromatografi-massespektrometri

  1. Proteinet denatureres ved inkubation af prøver ved 80 °C i 20min. Afkøl prøver til stuetemperatur og tilsæt 1:20 trypsin til protein. Proteinet fordøjes natten over ved 37 °C med prøveblanding. Næste morgen afsluttes trypsin fordøjelsen ved at opvarme prøver til 95 °C i 10 minutter.
  2. Registrer peptider ved hjælp af et LC-MS/MS-system med høj opløsning, der er forbundet med et UPLC-system.
  3. Prøven indlæses først på trapkolonnen (300 μm ID X 5 mm 100 Å porestørrelse, 5 μm partikelstørrelse) og vaskes ved 5,0 μL/ml i 3 minutter med vand, der indeholder 2% opløsningsmiddel B (acetonitril og 0,1% myresyre).
  4. Peptider adskilles på en C18 nanocolumn (0,75 mm x 150 mm, 2 μm partikelstørrelse, 100 Å porestørrelse) med en strømningshastighed på 300 nL/min. med en hældning mellem opløsningsmiddel A (vand indeholdende 0,1% myresyre) og opløsningsmiddel B. Gradienten for peptide elution består af en lineær stigning fra 2 til 35% B over 22 min, ramped til 95% B over 5 min og holdt i 3 min for at vaske kolonnen, og derefter vendte tilbage til 2% B over 3 min og holdt i 9 min for at re-ligevægt kolonnen.
  5. Indhent dataene i positiv iontilstand. Sprayspændingen indstilles til 2400 V, og ionoverførselsrørets temperatur indstilles til 300 °C.
  6. Få de fulde MS-scanninger fra 250-2000 m/z efterfulgt af otte efterfølgende dataafhængige MS/MS-scanninger på de otte mest rigelige peptidioner. Brug kollisionsinduceret dissociation ved 35% normaliseret energi for at fragmentere peptider.
  7. Identificer alle de uændrede peptider, der er påvist fra MS/MS-analyse, ved hjælp af en tilgængelig proteinanalysesoftware i forhold til den nødvendige FASTA-fil, der indeholder proteinsekvensen og det relevante proteolytiske enzym.
  8. Søg efter og kvantificer modificerede peptider ved hjælp af en HRPF-databehandlingssoftware. Omfanget af oxidation for hver identificeret peptid beregnes ved at dividere det opsummerede kromatografiske topareal for en modificeret peptid med det samlede kromatografiske topareal i den modificerede peptid og uændret ved hjælp af ligning 3.
    P = [I(enkelt oxideret) X 1 + I (dobbelt oxideret) X 2 + I(triply oxideret) X 3 + .../[Iunoxidized + I(enkelt oxideret) + I ( dobbelt oxideret ) + I(dobbelt oxideret) + I( tregange oxideret) ...]
    hvor P angiver det gennemsnitlige antal oxidationshændelser pr. peptidmolekyle, og jeg repræsenterer det højeste areal af den uoxiderede peptid (Iunoxidized) og peptid med n oxidationshændelser.

8. For en differentialundersøgelse skal du gentage trin 5-7 på den anden betingelse.

BEMÆRK: For at bekræfte reproducerbarhed anbefales to biologiske replikater ud over tekniske tre eksemplarer for hver tilstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Højtryksplasmakilden kombineret med dosimetri i realtid giver bedre kontrol over ▪OH-udbytte for at observere ændringer i proteinstrukturen i højere orden mere præcist. Tilføjelsen af adenin giver mulighed for et effektivt radikalt dosimeter i realtid. Ved oxidation mister adenin UV-absorbans ved 265 nm (Figur 2A). Ændringen i adeninabsorpturen er direkte relateret til koncentrationen af radikaler, der er til rådighed for HRPF, hvilket giver mulighed for effektivt at overvåge ændringer i radikal koncentration i nærværelse af radikale ådselædere som buffere, hjælpestoffer og ligands (Figur 2B).

Apomyoglobin (aMb) blev modificeret i nærværelse af 100 mM H2O2 og 1 mM adenin ved fire stigende plasmaspændinger (Figur 3). Seks peptider blev påvist med en lineær stigning i oxidation med ændringen af adenin UV 265 nm absorbans. Adenin UV-absorbans er et surrogat for effektiv ▪OH koncentration. Den lineære ændring i oxidation versus ændringen i radikal koncentration bekræfter fraværet af artefaktmæssige ændringer i proteinets højere orden struktur under mærkning. Desuden var omfanget af den oxidation, der blev påvist med højtryksplasmakilden, meget højere end den laserbaserede metode. Denne stigning skyldes højtryksplasmakildens bredspektrede UV-emissionsspektrum (figur 4). Ved at producere et bredt UV-spektrum overlapper plasmakilden bedre absorbansdomænet H2O2, hvilket giver en mere effektiv produktion af ▪OH gennem fotolysen af H2O2 (Figur 5). Dette er i direkte sammenligning med KrF Excimer laser og Nd:YAG laser, som er almindelige kilder, der photolyze H2O2 i HRPF undersøgelser21,27,28. Disse lasere har en meget smal båndbredde i den nederste ende af H2O2's fotometriske absorbansområde. I forhold til KrF-excimerlaseren øger højtryksplasmakilden produktionen af ▪OH'er betydeligt, samtidig med at efterspørgslen efter påkrævet optisk fluence (figur 6) mindskes betydeligt .

Figure 1
Figur 1: Komponenter i flash fotolyse platform. (A)Samlet kapillærrør, fagforeningsrør, møtrik og ferrule. Spidsen af den "nedre ende" af kapillæren strækker sig næppe ud over union tube. (B) Knurled møtrik på produktet opsamleren til at indsætte enden af kapillær. (C)Mærket seks-port injektion ventil. (D) Sprøjtepumpe med sprøjten. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Ændring i adeninabsorptance, der anvendes til dosimetri. (A) Ved oxidation falder adenin i UV-absorbans ved 265 nm. (B) Ændring i adeninabsorptance ved 265 nm ved forskellige flashspændinger for to buffere. Buffer 2 indeholder et radikalt ådselæder, som vil mindske ændringen i adeninabsorptance sammenlignet med buffer 1. For at overvinde de radikale skylleeffekter fra buffer 2 kræves øget flashspænding. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Apomyoglobin dosisresponskurve. (a)Der vises gennemsnitlig oxidation af seks peptider vs. adeninforandring i absorbansen. FPOP-oxidationsniveauer vises i de stiplede linjer. (B) De seks oxiderede peptider er mærket på en krystalstruktur af myoglobin (PDB: 3RGK). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Plasmalampens spektrale bestråling. Højtryks-Xe-gaslampen udsender bredspektret UV-stråling fra 200-300 nm sammen med synligt lys. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: H2O2 fotometriske absorbansspektre. Det sorte spor er UV-absorbansspektret på H2O229. Fremhævet i lilla er de smalle bølgelængder af KrF excimer laser (248 nm) og Nd:YAG laser (265 nm) producerer, mens den blå pil repræsenterer bredspektret plasma kilde, der udvider rækkevidden af nyttige H2O2 absorbans. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Plasmakildens virkning på fotolys H2O2. Ændringen i adeninabsorpionen over øget plasmainfluens viser koncentrationen af ▪OH'er, der genereres. Fremhævet i lilla er en typisk max ændring i absorbans produceret af en KrF excimer laser25. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er flere kritiske trin for at sikre korrekt mærkning af proteiner under ethvert HRPF-eksperiment. For det første vælges en passende strømningshastighed og kilde flash rate for at sikre, at hver bolus af prøven bestråles én gang. Dette sikrer, at proteinet udsættes for en enkelt bolus af nydannede ▪OH. Når et protein er oxideret, kan den højere orden proteinstruktur ændres. For at være sikker på, at den oprindelige proteinstruktur undersøges, skal hvert proteinmolekyle ændres på et enkelt øjeblik. Dosimetri kan bruges til at teste, om den oprindelige proteinstruktur undersøges. Da koncentrationen af hydroxylradikale øger omfanget af oxidation lineært stiger, hvis den oprindelige proteinstruktur undersøges. Men hvis en stor koncentration af hydroxylradikaler får proteinet til delvist at udfolde sig under mærkningen, vil omfanget af oxidation øges betydeligt, hvilket giver et effektivt middel til at sikre, at den indfødte proteinstruktur undersøges.

Det er også afgørende at sikre, at reaktionen slukkes korrekt. Dette omfatter indarbejdelse af en ordentlig radikal ådselæder blandet med proteinet under mærkningsprocessen. Til denne metode anvendes adenin ikke kun til dosimetri, men også skyllevæsker ▪OH, der begrænser levetiden for den radikale, da den mærker proteinet. Ved at begrænse levetiden for den radikale, tillid til, at den indfødte protein struktur er ved at blive ændret er ved at blive opnået. Efter mærkningsprocessen er det vigtigt at samle prøven i en siveopløsning, der indeholder katalase og methionin amide, som nedbryder overskydende H2O2 og skyller ▪OH. Begrænsning af proteinets eksponering for H2O2 sikrer, at H2O2-induceret oxidation minimeres.

Det er også afgørende at passende vælge en protease til peptid fordøjelsen. Mange enzymer kløver proteinet på bestemte steder. For eksempel, trypsin kløver på carboxyl side af arginin og lysin rester. Dette giver mulighed for simpel dataanalyse, men hvis det protein af interesse har et begrænset antal argininer og lysiner, en alternativ protease eller en blanding af proteaser kan være påkrævet for acceptabel peptid dækning under bottom-up proteomics. Det anbefales også at fordøje det modificerede protein før langtidsopbevaring for at undgå tab af oxideret protein på grund af aggregering og / eller opløselighedsproblemer.

Brug HRPF til at studere ændringer i protein struktur og protein interaktioner har været meget vellykket11,30,31,32,33, men der er tilføjet komplikationer, mens mærkning heme-bindende proteiner eller glycoproteiner. Mens både heme bindende34 og glycoproteiner35 er blevet undersøgt med succes ved hjælp af HRPF, grundig fejlfinding i koncentrationen af H2O2, radikal scavenger, og tidsrammen for H2O2 eksponering skal afbalanceres. Derudover slukker nogle buffere grundigt ▪OH'er. Derfor er det vigtigt at vælge en passende buffer og begrænse hjælpestoffer som DTT og DMSO. Typiske buffere, der anvendes under et HRPF-eksperiment, omfatter acetat, natriumphosphat, fosfatbufferet saltvand eller lave koncentrationer af Tris-buffer. Interessant nok skyller Tris nogle ▪OH, men efter oxidation øges det i fotometrisk absorbans ved 265 nm og kan bruges i stedet for adenin til dosimetri36. Selv om nogle buffere kan mindske den effektive koncentration af ▪OH, ved at indarbejde en in-line radikale dosimeter disse udfordringer kan overvindes.

HRPF anvender ikke-specifik irreversibel mærkning ved at ▪OH til at undersøge tilgængeligheden af opløsningsmidler. Etikettens ikke-specifikke karakter giver øget samlet dækning sammenlignet med andre mere målrettede fodaftryksmetoder , herunder N-ethylmaleimid37 og glycinethylster38. Da ændringen er irreversibel, er der rigelig tid til rådighed under prøvehåndtering. Dette giver mulighed for fuldstændig protein fordøjelse og en lang LC gradient for forbedret MS / MS analyse. For HRPF er der flere metoder til at generere ▪OH. En populær metode bruger en laser til at fotolysere H2O2 i ▪OH. Laserbaserede platforme har haft stor succes med at undersøge oprindelig proteinstruktur, men de kræver omfattende sikkerhedsforanstaltninger, streng vedligeholdelse og en betydelig mængde plads.

Med brugen af en højtryksplasmakilde beskrevet her er der ikke behov for skadelige gasser og ingen frygt for omstrejfende UV-stråling. Levetiden for hver højtryksplasmakilde er nok til at mærke mellem 180-200 prøver, og ud over at overvåge dosimeterresponsen kræves der ingen yderligere vedligeholdelse. Plasmakilden er under højt tryk, så mens du håndterer plasmakilden, skal du bære sikkerhedsbriller. Plasmakilden fotolyserer også H2O2 mere effektivt, hvilket giver mulighed for øget proteinmodifikation. Hvis der ikke observeres tilstrækkelig mærkning, kan H2O2-koncentrationen øges sammen med en forøgelse af lampeenergien til yderligere radikal produktion. Derudover kan man med inkorporeringen af realtids dosimetri øge reproducerbarheden af eksperimenter. Alt i alt giver brugen af en plasmakilde kombineret med dosimetri og software i realtid til automatiseret FPOP-databeregning en fordelagtig pakke til at udføre HRPF-eksperimenter i en sikker, lettere at betjene og med forbedret reproducerbarhed sammenlignet med standardlaserbaserede metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

E.E.C., JSS og S.R.W. afslører en betydelig økonomisk interesse i GenNext Technologies, Inc., et tidligt stadium selskab, der søger at kommercialisere teknologier til højere orden proteinstruktur analyse. De repræsentative data er blevet gennemgået af S.K.M., som ikke har nogen økonomisk interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 og R44GM125420).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A any brand is sufficient
50 µL SGE Gastight Syringes Fisher Scientific SG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) Thermo Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS120-500
Apomyoglobin Sigma-Aldrich
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Centrifuge Eppendorf 022625501
Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-100 any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Methionine amide Chem-Impex 03109
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Scientific 90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” Molex 1068680064 any capillary tubing cutter is sufficient
UPLC Thermo Scientific
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS118-500
Water, LC/MS Grade Fisher Scientific W6-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
  2. Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
  3. Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
  4. Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
  5. Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
  6. Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structure and dynamics of the actin filament. Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).
  7. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
  8. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  9. Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
  10. Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
  11. Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
  12. Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  13. Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).
  14. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  15. Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
  16. Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
  17. Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  18. Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
  19. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
  20. Linde. Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
  21. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
  22. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  23. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).
  24. Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).
  25. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  26. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
  27. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  28. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).
  29. Ultraviolet Absorption Spectrum of Hydrogen Peroxide. , Available from: http://www.h2o2.com/technical-library/physical-chemical-properties/radiation-properties/default.aspx?pid=65&name=Ultraviolet-Absorption-Spectrum (2016).
  30. Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
  31. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
  32. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  33. Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
  34. Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
  35. Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
  36. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  37. Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
  38. Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).

Tags

Biokemi Problem 172 Biofarmaceutisk Biosimilær Højere Ordensstruktur Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) Epitopkortlægning Receptor-Drug Interaction Protein-Protein Interaction
Laserfri Hydroxyl Radical Protein Footprinting til at udføre højere orden strukturel analyse af proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weinberger, S. R., Chea, E. E.,… More

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins. J. Vis. Exp. (172), e61861, doi:10.3791/61861 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter