Summary
Kanser hücrelerini ve fibroblastları birlikte enjekte etmek ve zamanla tümör büyümesini izlemek için bir protokol sağlanır. Bu protokol, fibroblastların tümör büyümesinin düzenleyicileri olarak rolünün moleküler temelini anlamak için kullanılabilir.
Abstract
Kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler), tümörü teşvik eden bir mikro çevre oluşturarak tümör büyümesinde önemli bir rol oynayabilir. CAF'ların tümör mikroortamındaki rolünü inceleyen modeller, fibroblastların, farklı dokulardan fibroblastların ve fibroblastlardaki spesifik genetik faktörlerin fonksiyonel önemini anlamak için yararlı olabilir. Fare modelleri, in vivo bağlamda tümör büyümesine ve ilerlemesine katkıda bulunanları anlamak için gereklidir. Burada, kanser hücrelerinin fibroblastlarla karıştırıldığı ve tümör geliştirmek için farelere verildiği bir protokol sağlanır. Zaman içindeki tümör boyutları ve nihai tümör ağırlıkları belirlenir ve gruplar arasında karşılaştırılır. Açıklanan protokol, CAF'ların tümör büyümesi ve ilerlemesindeki fonksiyonel rolü hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir.
Introduction
Tümör mikroçevresinde, en belirgin hücre tiplerinden biri kanserle ilişkili fibroblasttır (CAF)1. Bu karsinomla ilişkili fibroblastlar tümör baskılayıcı bir rol oynayabilir 2,3. Örneğin, S100A eksprese eden fibroblastlar, kanserojenleri kapsülleyebilen ve karsinom oluşumuna karşı koruma sağlayabilen kollajenleri salgılar4. Ayrıca, pankreas kanserinde α-düz kas aktini (SMA) pozitif miyofibroblastların tükenmesi immünsüpresyona neden olur ve pankreas kanseri ilerlemesini hızlandırır2. CAF'lar ayrıca kanser hücreleri ile birlikte gelişebilir ve tümör ilerlemesini teşvik edebilir 5,6,7,8. Fibroblastlar, tümörü teşvik eden bir ortam yaratan hücre dışı matriks proteinlerini sentezleyebilir ve salgılayabilir8. Bu hücre dışı matriks proteinleri, tümör ilerlemesi ile ilişkili olan dokunun mekanik sertleşmesine neden olabilir 9,10. Biriken hücre dışı matriks, bağışıklık infiltrasyonunu inhibe eden fiziksel bir bariyer görevi görebilir11. CAF'lar tarafından matriks birikimi de tümör invazyonu ile ilişkilendirilmiştir, çünkü CAF'lar tarafından üretilen fibronektinin tümör invazyonunu teşvik ettiği gösterilmiştir12. CAF'lar anjiyogenezi teşvik eder ve dönüştürücü büyüme faktörü-β (TGF-β), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), interlökin-6 (IL-6) ve CXC-kemokin ligand 12 (CXCL12)13,14,15 salgılayarak immünosüpresif hücreleri tümör mikroçevresine alır. Tümör büyümesini teşvik etmedeki merkezi rolleri nedeniyle, kanserle ilişkili fibroblastlar anti-kanser tedavisi için ortaya çıkan bir hedeftir 6,16,17,18.
Aşağıdaki protokol, fibroblastların tümör büyümesinin iyi kurulmuş ve yaygın olarak kullanılan bir fare modelinde tümörlerin büyümesini nasıl etkilediğini test etmek için bir yöntem açıklamaktadır. Fibroblastların tümör mikroortamındaki önemini anlamak için, büyümelerini izlemek için kanser hücrelerini farelere sokmak için standart protokol, kanser hücresi girişi ile fibroblastları içerecek şekilde değiştirildi. Kanser hücreleri deri altından veya intradermal olarak sokulabilir. İntradermal giriş, cildin kendisinden kaynaklanan tümörlerle sonuçlanır. Kanser hücrelerinin ve fibroblastların farelere birlikte enjekte edildiği ksenogreftler, fibroblastların, fibroblastların alt popülasyonlarının ve protein faktörlerinin kanser büyümesini teşvik etme yeteneğindeki rolünü incelemek için önemli bir metodolojik araçtır 19,20,21. Kanser hücrelerinin ve fibroblastların farelere birlikte enjeksiyonu için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu yöntem, fibroblastların varlığını veya yokluğunu karşılaştırmak, farklı kaynaklardan fibroblastları karşılaştırmak içinkullanılabilir 20 veya fibroblastları spesifik proteinlerin ekspresyonu olan ve olmayan fibroblastları karşılaştırmakiçin 19. Kanser hücreleri ve fibroblastlar tanıtıldıktan sonra, zamanla tümör boyutu izlenebilir. Deneylerin sonunda, tümörler diseke edilebilir ve tartılabilir. Zaman içinde tümör büyümesi izlenerek, farklı faktörlerin önemi diseke edilebilir.
Fibroblastların tümör büyümesindeki rolünü incelemek için olası alternatif yaklaşımlar vardır. Örnek olarak, fibroblastlarda tercihen ifade edilen sürücülerle genlerin dokuya özgü nakavtını sağlayan Cre-loxed tabanlı modeller vardır. Bu tür yaklaşımlar ayrıca tümör progresyonu için fibroblastlarda spesifik genlerin ve yolakların rolünü araştırmak için fırsatlar sağlar. Cre-lox tabanlı yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, sağlanan protokol, fibroblastların rolünü izlemek için önemli ölçüde daha hızlı bir yaklaşımı temsil edecektir, çünkü tümör büyümesi sadece birkaç hafta içinde izlenecektir. Sağlanan yaklaşım aynı zamanda önemli ölçüde daha ucuzdur, çünkü genetiği değiştirilmiş farelerin kolonilerinin üretilmesini ve barındırılmasını gerektirmez. Sağlanan protokol, fare kolonileri geliştirmeye ihtiyaç duymak yerine shRNA'lar kullanarak farklı genlerin yıkılmasının etkisini hızlı bir şekilde test etmek için kullanılabilir. Sağlanan yaklaşım aynı zamanda daha esnektir, çünkü farklı sayıda fibroblastın, farklı kanser hücrelerinin ve fibroblastların farklı oranlarının, farklı genlerin yıkılmasına ve hatta farklı doku bölgelerinden veya türlerden fibroblastların karşılaştırılmasına izin verecektir. Bir Cre-lox yaklaşımı, fibroblastların farelerde daha fizyolojik bir bağlamda bulunması avantajına sahip olacaktır.
Burada bildirilen protokol, fibroblastların tümör büyümesi üzerindeki etkilerini hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde izlemek isteyen bilim adamları için değerli olacaktır. Bu protokol, tümör büyümesi üzerine tümör büyümesi üzerine farklı kaynaklardan fibroblastların veya fibroblastların farklı alt kümelerini araştıran bilim adamları için özellikle değerlidir. Tümör başlangıcının fizyolojik bir bağlamda gerçekleşmesi önemliyse, genetik olarak tasarlanmış fare modelleri düşünülmelidir.
Bu deneyleri gerçekleştirmek için birkaç olası yaklaşım vardır. Bağışıklık yetkin fareler, fibroblast-immün hücre etkileşimlerinin araştırılmasına izin verecek konakçı olarak kullanılabilir. Bağışıklık yetkin fare modelleri için, fare kanseri hücreleri ve fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) enjekte edilmelidir. MEF'lerin kullanımı ayrıca, araştırmacının, ilgilendiği bir genin varlığını veya yokluğunu test etmek için çok çeşitli nakavt fare suşlarından yararlanmasına izin verir. Alternatif olarak, bağışıklık yetersizliği olan fareler, insan kanser hücrelerinden türetilen farelerde tümörlerin büyümesini teşvik etmede insan fibroblastlarının rolünü test etmek için kullanılabilir. Kanser hücrelerinin tanıtımı deri altından veya ortotopik olarak yapılabilir. Melanom için, aşağıda tarif edildiği gibi, tümör-fibroblast karışımı, bir melanomun gelişeceği cilt içindeki yeri daha yakından simüle eden ortotopik enjeksiyon için intradermal olarak enjekte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm deneyler, Los Angeles'taki Kaliforniya Üniversitesi'ndeki Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.
NOT: Fare suşu için konakçı farelerle eşleşen kanser hücrelerini ve fibroblastları seçin. Konakçı farenin cinsiyetiyle eşleşen kanser hücrelerini ve fibroblastları seçin. Fareleri üreme kolonilerinden alın veya saygın satıcılardan satın alın. Tümörleri ~ 8-10 haftalık farelere tanıtın. Kürklü fareler, saç folikülü döngüsünün telojen veya dinlenme aşamasında olacaktır. Kanser hücresine 0.5 ila 3 fibroblast oranı için plan yapın.
1. Deney için kullanılacak uygun fare sayısını belirleyin
- Çalışmaları gerçekleştirmeden önce, çalışmalar için kullanılacak uygun fare sayısını belirlemek için bir güç analizi yapın. Belirtilen güce sahip bir denemenin örnek boyutunu belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:
n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2
Seçilen anlamlılık düzeyi α ise (genellikle 0,05), 1-α/2 = 0,975 ve Z=1,960.
β güçtür ve eğer %80 güç isteniyorsa, o zaman Z=0.84.
ES, etki boyutu = \μ1-μ 0\/σ
burada μ 0, H0 hipotezi altındaki ortalamadır, μ 1, H1 hipotezi altındaki ortalamadır ve σ, faiz22'nin sonucunun standart sapmasıdır.
NOT: Örneklem büyüklüğünün hesaplanması hakkında daha fazla bilgi22 bulunabilir.
2. Enjeksiyon için kanser hücreleri üretin
- Aşağıdaki denklemle ilgili büyüme oranını belirleyin:
Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t
NOT: 24 saat içinde iki katına çıkan hücreler için bir örnek gösterilmiştir
İki katına çıkma süresi = ln(2)/büyüme oranı
24 saat = ln(2)/büyüme hızı
24*büyüme oranı = .693
Büyüme hızı = .693/24= .028875 - Plakalanacak kanser hücrelerinin sayısını ve enjeksiyondan önce hücrelerin büyümesi gereken süreyi belirleyin.
NOT: Oluşan her tümör için 0.25-1 milyon kanser hücresi enjekte edilir. - Denkleme göre yeterli sayıda hücre oluşturmak için gereken gün sayısını hesaplayın
N(t)=N(0)egr*t
burada N(t) t zamanındaki hücre sayısıdır, N(0) 0 zamanındaki hücre sayısıdır, gr büyüme hızıdır ve t zamandır.
NOT: 12 tümörün her birine 106 hücre üretmek için 500.000 hücreyi büyütmek için bu hesaplamalara bir örnek. Bu hesaplamalara dayanarak, gerekli sayıda hücreyi büyütmek için 5 gün yeterlidir:
N(t)=N(0)egr*t
12 x 106 = 500.000e(gr*t)
12 x 106 = 500.000e (.028875 * t)
24=e(.028875*x)
ln(24)=0,028875x
3,178=0,028875x
X=110 saat= 4,59 gün
Hücrelerin plakaya yapışması ve toplama sırasında kaybolan hücreler için fazladan zaman tanıyın. - Plaka kanseri hücreleri.
NOT: Kültürlü hücrelerle çalışırken eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.
NOT: Mikropların havadan numunelere girmesini en aza indirmek için laminer akış başlığında hücre manipülasyonları gerçekleştirin. Doku kültürü başlığını kullanmadan önce ultraviyole ışıkla tedavi edin. Steril teknik ve sadece steril hücre kültürü plastik eşyaları ve doku kültürü ile işlenmiş plakalar, pipetler ve konik tüpler gibi sarf malzemeleri kullanın.- Şişedeki hücre sayısına ve kaplandıktan sonra istenen hücre konsantrasyonuna bağlı olarak doku kültürü plakalarının doğru sayısını ve boyutunu hesaplayın.
- Doku kültürü plakalarını etiketleyin.
- 37 °C'de suyla bir su banyosu hazırlayın.
- Aliquot ortamını konik tüplere yerleştirin ve 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin. Birçok kanser hücresi, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenerek yetiştirilebilir.
- Gerekli sayıda dondurulmuş hücre şişesini sıvı azot dondurucudan çıkarın.
NOT: Sıvı nitrojen dondurucudaki hücreleri tutarken dondurucu eldivenleri kullanın. - Yavaşça sallarken su banyosundaki hücre şişelerini hızla çözün.
NOT: Steriliteyi korumak için şişeleri tutarken eldivenlere etanol ekleyin. - Bir doku kültürü başlığında steril teknik kullanarak, hücreleri 10 mL DMEM +% 10 FBS içeren 15 mL'lik bir konik tüpe pipetin.
- Hücre karışımını 180 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı steril emme veya steril 10 mL pipet ile yavaşça çıkarın.
- Peletteki hücreleri nazikçe 1 mL DMEM +% 10 FBS'ye yeniden askıya alın.
- Yeniden askıya alınan hücreleri steril bir p1000 ile etiketli bir doku kültürü plakasına pipetin.
- Steril 10 mL pipetler kullanılarak, serum ile doku kültürü plakalarına pipet ortamı.
- Doku kültürü plakalarını 37 °C'de %5 CO2 ile bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.
- Enjeksiyon için yeterli kanser hücresi üretmek için kanser hücrelerini genişletin.
NOT: Akıcılık için hücreleri ışık mikroskobu ile izleyin. Her iki ila üç günde bir veya hücrelerin% 100 birleşmeye ulaşmasını önlemek için gerektiğinde tripsinizi yapın. Çok sayıda hücre gerekiyorsa, çok sayıda hücreyi alan ve orta verimli bir şekilde büyütmek için hiperşişeler (Malzeme Tablosu) kullanın. Hücrelerin her geçirilmesi gerektiğinde, şu prosedürü izleyin:- Ortamı steril emme veya steril 10 mL pipet ile plakadan çıkarın.
- Sıcak fosfat tamponlu salin (PBS) üzerine pipetleyerek plakayı nazikçe yıkayın. Ardından PBS'yi steril emme veya pipet ile çıkarın.
- PBS'de 5 mL 1x Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 'yi 10 cm'lik bir plaka için hücrelere pipet edin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Hücreleri plakadan çıkarmak için nazik dokunuşlarla plakadan hücreleri çıkarın.
- Steril 10 mL pipet kullanarak, hücreleri konik tüplerde% 10 FBS serumu ile DMEM'e toplayın.
- Konik tüpleri 180 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı dökerek çıkarın. Hücre peleti görünür olmalıdır. Tüpün içinde kaldığından emin olmak için izleyin.
- Peletlenmiş hücreleri 1 mL DMEM + %10 FBS ekleyerek ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın.
- Aliquot hücreleri DMEM +% 10 FBS ile uygun boyuttaki yeni doku kültürü plakalarına yeniden askıya alır (10 mL'lik bir ortam, 10 cm'lik bir doku kültürü plakası için uygundur).
3. Enjeksiyon için fibroblastlar üretin
NOT: Primer fibroblastlar çok fazla iki katına çıktıktan / pasajdan sonra yaşlanacaktır. Primer fibroblastların sınırlı sayıda pasajdan veya iki katına çıkmadan sonra kullanılması önemlidir. Fibroblastların fare veya insan derisinden büyüdüğü geçiş veya iki katına çıkma sayısını takip edin. Primer insan dermal fibroblastları için 15'ten az pasajı olan fibroblastları kullanın. Fare embriyonik fibroblastları için 9'dan az pasajlı fibroblastlar kullanın. Fibroblastlar birleştiklerinde değişirler. Fibroblastları yaklaşık% 90 birleştiklerinde tripsizleştirin. Fibroblastlar, nasıl kültürlendiklerine bağlı olarak farklı özelliklere sahip olacaktır. Birçok bilim adamı, doku benzeri ortamları daha etkili bir şekilde yakalayan 3D kollajen matrisleri gibi doku kültürü plakalarından daha fizyolojik olarak ilgili substratlar üzerinde kültürlemeyi teşvik eder23,24,25.
- Fibroblast hücrelerinin büyüme hızını belirlemek için bölüm 2.1'deki denklemi kullanın.
- Fibroblastları genişletmek için gereken gün sayısını belirlemek için bölüm 2.2'deki denklemi kullanın.
- Fibroblastları, kanser hücrelerinin ve fibroblastların aynı gün enjeksiyona hazır olmasını sağlamak için uygun günde uygun ortamı kullanarak bölüm 2.3'te açıklandığı gibi plakalayın.
- Bölüm 2.4'te açıklanan prosedürleri takiben gerekli olan yeterli sayıda fibroblast üretmek için fibroblastları uygun ortamda genişletin.
4. Enjeksiyon için fareleri hazırlamak için fareleri tıraş edin
NOT: Farelerle çalışırken laboratuvar önlükleri, saç ağları, ayakkabı kılıfları ve eldivenler giyin.
- Enjeksiyondan bir ila iki gün önce, Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi kurallarına uygun olarak, fareleri uyuşturun. Anestezi için izofluran kullanıyorsanız, izofluran veO2 karışımı kullanın. Fareleri bir anestezi odasına yerleştirin ve anesteziyi indüklemek için bir izofluran (% 5) /O2 karışımı ekleyin. Daha sonra, anestezinin cerrahi düzlemini sabit bir izofluran (% 2) / O2 karışımı akışıyla korumak için burun konisini anestezi altındaki hayvanın üzerine yerleştirin.
- Farenin ayak parmağını sıkıştırarak ve farenin hareket etmediğini doğrulayarak uygun cerrahi anestezi düzleminde olduklarından emin olmak için hayvanları kontrol edin.
- Cerrahi bıçak # 40 ile bir hayvan kesme makinesi kullanarak, kürk çıkarılana kadar hayvan kesme makinesini cildin üzerinden birkaç kez geçirerek kürkü farelerin yanlarındaki uygun konumlardan yavaşça çıkarın.
- Anesteziden iyileşene kadar fareleri izleyin.
5. Kanser hücrelerini ve fibroblastları enjeksiyon için hazırlayın
NOT: Kanser hücreleri ve fibroblastlar toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede, tercihen 30 dakika içinde enjekte edilmelidir. Enjeksiyon sabahında, kanser hücrelerini ve fibroblastları doku kültürü plakalarından ayrı olarak toplayın. Her hücre türü için aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
- Ortamı doku kültürü plakasından nazik steril emme ile veya ortamdan pipetleyerek çıkarın.
- Hücreleri bozmadan 5 mL PBS üzerine nazikçe pipetin. PBS'yi döndürün. PBS'yi emme veya pipetle PBS'den nazikçe aspire edin.
- PBS'deki 5 mL Tripsin-EDTA'yı hücre tabakasına nazikçe pipetleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Hücreleri yerinden çıkarmak için hafif dokunuşlarla plakadan hücreleri çıkarın. Hücreleri 10 mL'lik bir pipet ile birkaç kez pipet edin ve hücreleri% 10 FBS ile DMEM içeren konik bir tüpe aktarın.
- Konik tüpleri 180 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı yavaşça dökerek çıkarın, hücre topağını koruyun. Hücre peletini PBS ile iki kez yıkayın. Her seferinde, hücrelere 10 mL PBS pipetleyin. Bir p1000 pipet ile yavaşça karıştırın.
- Hücreleri adım 5.5'teki gibi santrifüj edin. PBS'yi bir pipetle yavaşça çıkarın ve tekrarlayın.
- Yıkanmış, peletlenmiş hücreleri 1 mL PBS'de bir p1000 ile yeniden askıya alın.
- Bir hemositometre slaytını alkolle temizleyin ve kurutun.
- Hücre karışımının 100 μL'sini bir tüpe pipet edin ve% 0.32'lik nihai bir Tripan mavisi konsantrasyonu için 400 μL% 0.4 Tripan mavisi ekleyin.
- Hücre karışımını oda dolana kadar pipetleyerek kapak kapağının altındaki cam hemositometrenin odalarını nazikçe doldurun.
- Bir mikroskop kullanarak, 10x hedefin ızgara çizgilerine odaklanın.
- Canlı, lekesiz hücreleri ve mavi hücreleri 16 karelik bir kümede sayın.
- 16 karelik 4 setin tümünü sayın.
- 16 kareden oluşan 4 kümeden berrak ve mavi hücreler için hücre sayısının ortalamasını alın ve 10.000 ile çarpın. Tripan mavisinden 1:5 seyreltmeyi düzeltmek için 5 ile çarpın.
- Son sayımlar, canlı ve ölü hücreler için hücrelerdeki konsantrasyon / mL'dir. Toplam kanser hücresi ve fibroblast sayısını belirlemek için hacimle çarpın. Canlı olan hücrelerin fraksiyonunun% >80 olduğunu doğrulayın.
- Planlanan tüm enjeksiyonlar için yeterli sayıda melanom hücresi ve fibroblast olduğunu onaylayın, enjeksiyonlar sırasında en az% 20 örnek kaybı olduğunu varsayarsak.
- Gerekli sayıda hücreyi yeni bir konik tüpe aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile pelet edin (5 dakika boyunca 180 x g).
- Süpernatantı 10 mL'lik bir pipetle çıkarın.
- Peletin gerekli konsantrasyonda uygun miktarda Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi (USP) GRADE PBS (intradermal enjeksiyon için tümör başına 50 μL ve deri altı enjeksiyonu için tümör başına 100 μL) içinde tekrar askıya alınması.
6. Kanser hücrelerini ve fibroblastları farelere enjekte edin
NOT: Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanırsa, her fareye, her bir kanatta bir tane olmak üzere iki tümör enjekte edin. Hangi farenin sağ ve sol kanatlarda hangi enjeksiyonu alacağını rastgele belirleyin. Enjekte edilecek fare sayısına bağlı olarak, fareleri uyuşturun ve kanser hücrelerini ve fibroblastları farelere gruplar halinde enjekte edin.
- Kanser hücrelerinin deri altı enjeksiyonu için
- Fareleri bölüm 4.1'de açıklandığı gibi uyuşturun.
- Tıraş olmuş cildi alkollü çubuklarla silin.
- Steril bir şırıngayı istenen miktarda hücre veya hücre karışımı ile doldurun ve şırıngayı 27 gauge iğne ile kapatın.
NOT: Hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kabarcıkları çıkarmak için şırıngayı gerektiği gibi hareket ettirin. Hücreler şırıngaya sokulduktan sonra, kümelenmeyi önlemek için şırıngaları sürekli olarak ters çevirerek şırıngaların içindeki hücreleri iyi karıştırılmış halde tutun. - İğneyi farenin yan tarafındaki deri altı bölgesine yerleştirin ve hücreleri yavaşça fareye enjekte edin. Subkutan enjeksiyon için tümör başına 100 μL hücre süspansiyonu kullanın (enjeksiyon başına 100 μL'den fazla hacim kullanılması önerilmez).
- Anesteziden iyileşene kadar fareleri izleyin. Gerekirse, farelerin tamamen iyileşmesine yardımcı olmak için farelere kulübeler ve / veya ısıtma pedleri gibi ekstra yalıtım malzemeleri sağlayın.
- Kanser hücrelerinin intradermal enjeksiyonları için
- Fareleri bölüm 4.1'de açıklandığı gibi uyuşturun.
- Tıraş olmuş cildi alkollü çubuklarla silin.
- Steril bir şırıngayı istenen miktarda hücre veya hücre karışımı ile doldurun ve şırıngayı 27 gauge iğne ile kapatın.
NOT: Hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kabarcıkları çıkarmak için şırıngayı gerektiği gibi hareket ettirin. Hücreler şırıngaya sokulduktan sonra, kümelenmeyi önlemek için şırıngaları sürekli olarak ters çevirerek şırıngaların içindeki hücreleri iyi karıştırılmış halde tutun. - Farenin yan tarafındaki cildin intradermal bölgesine 27 gauge bir iğne yerleştirin ve hücreleri faredeki intradermal bölgeye yavaşça enjekte edin. İntradermal enjeksiyon için tümör başına 50μL hücre süspansiyonu kullanın (enjeksiyon başına 50 μL'den fazla hacim kullanılması önerilmez).
- Anesteziden iyileşene kadar fareleri izleyin. Farelerin sıkıntıda olduğuna dair işaretler varsa, bir veterinere danışın. Gerekirse, farelerin tamamen iyileşmesine yardımcı olmak için farelere kulübeler ve / veya ısıtma pedleri gibi ekstra yalıtım malzemeleri sağlayın.
7. Tümör büyümesi sırasında fareleri izleyin
- Fareleri herhangi bir ağrı veya sıkıntı belirtisi (kambur duruş, kıvranma, seslendirme, kafes boyunca uzanma, karınlarını kafes tabanının dibine bastırma veya kafesin etrafında hareket etme isteksizliği) veya apse oluşumu için günlük olarak izleyin. Farelerin sıkıntıda olduğuna dair işaretler varsa, bir veterinere danışın.
- Tümörler oluştuktan sonra, tümör hacmini yaklaşık iki ila üç günde bir ölçün. Kaliperlerle tümör uzunluğunu (en uzun taraf) ve genişliği (uzunluğa dikey) ölçün.
NOT: En iyi uygulamalar, verilerdeki değişkenliği azaltmak için aynı kişinin deney boyunca bu ölçümleri gerçekleştirmesidir. Ölçümler için, fareleri bölüm 4.1'de açıklandığı gibi uyuşturun - Tümör hacimlerini Hacim = 0.5 x (Uzunluk x Genişlik2) formülüyle hesaplayın.
8. Tümörleri toplayın ve tümör ağırlıklarını ölçün
- Tümör büyümesi kurum Hayvan Bakımı Komitesi tarafından kurulan deneysel bir son noktaya ulaştığında fareleri ötenazi yapın. Fareleri bir odaya yerleştirin ve solunumun kesilmesinden bir dakika sonra basınçlı CO2 ile oda havasının yavaş (dakikada% 20-30) yer değiştirmesiyle ötenazi yapın.
- Farelerde servikal çıkık gerçekleştirin. Kemirgenleri sert, düz bir yüzeyde tutun. Kafatasının tabanındaki boynun arkasına sağlam bir kalem veya başka bir nesne yerleştirin. Kuyruğun tabanını tutan el ile geriye doğru çekerken nesne kafayı kısıtlayarak hızlı bir şekilde ileri ve aşağı itin. Palpasyonla omuriliğin koptuğunu onaylayın.
NOT: Servikal çıkık deneyimli laboratuvar personeli tarafından yapılmalıdır. - Deneydeki her fare için, nefes alma, kalp atışı ve ayak parmağının sıkışmasına yanıt olmadığını kontrol ederek farenin artık hayatta olmadığını doğrulayın.
- Steril bir neşter ve cerrahi makas kullanarak, tüm tümörü fareden çıkarın. Cerrahi makas ile, tümör olmayan dokuyu tümörden kesin.
- Tümörü analitik bir terazide tartın ve tümör ağırlığını kaydedin.
9. Tümör hacimlerinin ve tümör ağırlıklarının istatistiksel analizi
- Her gruptaki tümör hacimlerini tekrarlanan ölçümlerle varyans analizi (ANOVA) ile karşılaştırın. Fare başına iki tümör enjekte edilmişse eşleştirilmiş analiz yapın.
- İki kuyruklu bir test kullanarak ANOVA ile gruplar arasındaki tümör ağırlıklarını karşılaştırın. Tukey'in post-hoc testi daha sonra hangi grupların birbirinden önemli ölçüde farklı olduğunu belirlemek için kullanılabilir. Fare başına iki tümör enjekte edilmişse eşleştirilmiş analiz yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A2058 insan melanom hücreleri ve primer insan dermal fibroblastları steril koşullar altında kültürlendi. Hücreler toplandı ve PBS ile üç kez yıkandı. İmmün yetmezlikli fareler (NU / J - Foxn1 çıplak suşu), yalnızca 0.25 milyon A2058 melanom hücresi ile bir kanatta deri altından enjekte edildi. Diğer kanatta, farelere 0.25 milyon A2058 melanom hücresi ve 0.75 milyon fibroblast karışımı enjekte edildi. Hücreler, bağışıklık yetmezliği olan 12 fareye enjekte edildi. Sol ve sağ kanatlara yapılan enjeksiyonlar randomize edildi. Tümör hacimleri enjeksiyondan 12, 14, 16, 19 ve 21. günlerde izlendi (Şekil 1A). Ötanazi üzerine, tümörler eksize edildi, görüntülendi (Şekil 1B) ve tartıldı (Şekil 1C). Fibroblastların varlığı önemli ölçüde daha büyük tümörlere neden olur.
Şekil 1: Ko-enjeksiyonlu fibroblastların varlığında ve yokluğunda melanom büyümesinin karşılaştırılması. Melanom hücreleri, birincil cilt fibroblastları olan veya olmayan çıplak farelere sokuldu. (A) Ko-enjeksiyonlu fibroblastlı ve enjeksiyonsuz melanomlar için zaman içinde tümör hacminin grafiği. Hacim 0,5*uzunluk*genişlik2 olarak hesaplandı. Ortalama hacimler ve ortalamanın standart hatası (SEM) çizilir. Anlamlılığı belirlemek için ANOVA yapıldı. (B) Eksize edilen tümörlerin görüntüleri. (C) 21. günde deneyin sonunda tümörlerin son ağırlıkları. Ortalama ağırlıklar ve SEM çizilir. Son ağırlıkları karşılaştırmak için eşleşmemiş, iki kuyruklu bir t-testi kullanıldı. * p < 0,05, *** p < 0,001 gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Şekil 1'deki deneyde, insan dermal fibroblastlarının insan A2058 melanom hücreleri ile birlikte tanıtılması, melanom hücrelerinin birlikte enjekte edilen fibroblastlar olmadan tanıtıldığından daha büyük tümörlerle sonuçlandı. Bu fark, tümör hacmine ve tümör ağırlığına bağlı olarak kolayca tespit edilebilir. Sonuçlar, kanserle ilişkili fibroblastların tümör büyümesini destekleyebileceğine dair birçok raporla tutarlıdır5,6,7,8. Tümör hacmi ve tümör ağırlığı gibi burada tartışılan son noktalara ek olarak, ek sonlanım noktaları da izlenebilir. Ek analizler de mümkündür. Örneğin, gelişen tümörler fiksasyon için formalin halinde toplanabilir, parafine gömülebilir ve histoloji için hematoksilin ve eozin ile analiz edilebilir. Alternatif olarak, geliştirilen tümörler, spesifik proteinler için immünofloresan ile daha fazla analiz için optimal kesme sıcaklığı bileşiğinde (OCT) toplanabilir.
Bu deneylerin önemli bir sınırlaması, kanser hücreleriyle birlikte enjekte edilen fibroblastların birkaç hücre bölünmesinden sonra yaşlanabileceği veya ölebileceğidir. Alternatif olarak, birlikte enjekte edilen fibroblastlar tümörden uzaklaşabilir, bu durumda tümör büyümesini etkilemeyebilirler. Fibroblastlar yaşlanırsa, ölürse veya tümörden uzaklaşırsa, zamanla daha az bol olurlar ve birlikte uygulanan fibroblastların etkisi tümör büyümesi için daha az önemli hale gelir. Gerçekten de, tanıtılan kanser hücrelerinin konakçıdan ek fibroblastlar alması beklenmektedir. Tanıtılan fibroblastlarda belirli bir genin yıkıldığı veya nakavt edildiği deneyler için, zamanla, kodlanmış proteini ifade eden konakçı fibroblastların işe alınmasının, gözlemlenebilecek herhangi bir fenotipi azaltması beklenir. Tanıtılan fibroblastların varlığını izlemek için, fibroblastlar GFP26,27 gibi bir floresan proteini ifade etmek için genetik olarak tasarlanabilir. Fibroblastlar GFP'yi eksprese ederse, akış sitometrisi, tanıtıldıktan sonra farklı günlerde tümör içinde bulunan fibroblastların sayısını izlemek için kullanılabilir. Alternatif olarak, lusiferaz enzimi fibroblastlara sokulabilir ve biyolüminesans görüntüleme, farelerdeki fibroblastların zaman içindeki miktarını izlemek için kullanılabilir. Fibroblastlar tümör mikroçevresinden hızla elimine edilirse, Cre-lox genetiği değiştirilmiş fare modelleri bu endişeyi giderecek ve açıklanan çalışmaları tamamlayacaktır.
Deneyler, insan kanser hücrelerini ve fibroblastları çıplak farelere sokarak gerçekleştirilirse, sınırlı bağışıklık sisteminin sonuçlar üzerinde önemli bir etkisi olması beklenir. Atimik çıplak fareler (NU / J) T hücrelerinden yoksundur ve bu nedenle hücre aracılı bağışıklıktan yoksundur. Ayrıca B hücresi gelişiminde kısmi bir kusura sahiptirler. Hücre aracılı bağışıklık, yani aktive CD8 + T hücreleri yoluyla hücrelerin öldürülmesi, tümör büyümesinin baskılanmasında önemli bir rol oynayabilir28,29. Son çalışmalarda, kanserle ilişkili fibroblastlar ve CD8 + T hücreleri arasındaki etkileşim30,31,32 bildirilmiştir. Fare kanseri hücrelerini ve fare fibroblastlarını bağışıklık sistemi olan farelere sokmak, bu konuyu ele alacak alternatif bir yaklaşım olarak düşünülebilir.
Diğer bir alternatif yaklaşım, konakçı fibroblastlardaki spesifik proteinlerin seviyelerini veya aktivitesini modüle etmek için Cre-lox sisteminin kullanıldığı genetiği değiştirilmiş fare modellerini kullanmaktır. Böyle bir yaklaşım, FSP1, Col1a1, Col1a2 veya PDGFRa33,34,35 gibi sürücülerle fibroblastla zenginleştirilmiş Cre-lox modellerini kullanmaktır. Bir Cre / lox rekombinaz modeli ile, enjekte edilen fibroblastların öleceği veya tümörden uzaklaşacağı endişesi olmayacaktır.
Protokolde, başarısı için kritik olan birkaç adım vardır. Fibroblastların büyümesi protokolün önemli bir parçasıdır ve sonuca önemli ölçüde katkıda bulunması muhtemeldir. Primer fibroblastlar kolayca yaşlanır ve fibroblastların üstel büyüme fazında olduğundan ve yaşlanmadığından emin olmak için geçiş veya iki katına çıkma dikkatlice izlenmelidir. Yaşlanan fibroblastların, tümör büyümesi üzerinde dramatik bir etkiye sahip olabilecek yüksek düzeyde sitokin salgılaması beklenmektedir36,37,38. Sonuç olarak, geçiş numarasının dikkatli bir şekilde belgelenmesi ve protokol yaşlanan fibroblastların analizini gerektirmediği sürece enjekte edilen fibroblastların yaşlanmaması büyük önem taşımaktadır.
Fibroblastlar birleştiğinde, çok sayıda değişikliğe uğramaları beklenebilir, bunlardan bazıları hücre döngüsüne tekrar girdiklerinde muhtemelen tersine çevrilecektir39,40,41,42,43,44. Fibroblastların proliferatif bir durumda tutulması ve% 90 birleşikken bölünmesi, çalışmaların mümkün olduğunca tutarlı olmasını sağlamak için önemlidir. Fibroblastların doku kültürü plakaları üzerinde kültürlenmesi de muhtemelen davranışlarını etkiler ve 3D kollajen matrisleri gibi alternatifler 23,24,25 olarak düşünülmelidir. 3D matrislerde kültürlenen fibroblastlar, 2D yüzeylerde yetiştirilen fibroblastlardan önemli ölçüde farklı göç paternleri gösterir 45,46,47,48,49, bu da fibroblastların tümör hücre dışı matriks mikroçevresinin oluşturulmasında aktif bir rol oynayacağı tümörlere sokulduğunda tümör teşvik kapasitelerini muhtemelen etkileyecektir50.
Melanom hücrelerinin intradermal enjeksiyon yoluyla fareye enjekte edilmesi, deri altı enjeksiyonlarından daha fazla tekrarlanabilir tümör büyümesi sağlayabilir. İntradermal bölgede çok az yer olduğu için bu zor bir adımdır. İğneyi dikkatlice konumlandırmak önemlidir. İntradermal enjeksiyonlar yapılırsa, sadece 50 μL çözelti enjekte edilir. Deneyimli araştırmacılar için bile, bu enjeksiyonlar sızabilir. Her enjeksiyonun sızıp sızmadığına dikkat etmek önemlidir, böylece tümör oluşmazsa, son analizden elimine edilebilir.
Şırıngaların enjeksiyon için hazırlanması bir başka kritik adımdır. Kabarcıkları ortadan kaldırmak için şırınganın hafifçe vurulmasını gerektirebilecek tüm kabarcıkları şırıngadan çıkarmak önemlidir. Hücrelerin kümelenmemesi de önemlidir. Topaklanmayı önlemek için şırıngaları tekrar tekrar ters çevirin.
Bu deneylerin bir başka zor yönü, tümör hacminin ölçülmesinin kişiden kişiye değişken olabileceğidir. Tümör hacmi ölçümlerindeki değişkenliği sınırlamak için, bir deney boyunca tüm farelerde ve tüm zaman noktalarında tüm tümör hacim ölçümlerini almak için tek bir laboratuvar üyesine sorumluluk vermek yararlıdır.
Farelere mümkün olduğunca konakçı fare ile aynı cinsiyetten kanser hücreleri enjekte etmek tercih edilir. Cinsiyetin zaman içinde tümör boyutunu etkileyip etkilemediğini belirlemek için her iki cinsiyeti de kullanmak ve cinsiyeti ANOVA modellerinde değişken olarak dahil etmek mümkündür.
Tümör mikroçevresini anlamak, tümörigenez hakkında fikir edinmek için gereklidir. Protokol, fibroblastların rolünü, farklı fibroblast türlerini ve fibroblastlar içinde tümör büyümesini etkileyebilecek farklı yolları anlamak için bir temel sağlayabilir. Bu deneylerden elde edilen bulgular, fibroblastların tümör büyümesini teşvik etmesini önleyecek yeni terapötik hedefler belirleyebilir18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Coller laboratuvarının tüm üyelerine yararlı girdiler için teşekkür eder. H.A.C., Rita Allen Vakfı'nın Milton E. Cassel bursiyeriydi. NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanom Araştırma İttifakı Takım Bilimi Ödülü, Kanser Araştırma Enstitüsü Klinik Laboratuvar Entegrasyon Programı Ödülü, Iris Cantor Kadın Sağlığı Merkezi / UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, California Üniversitesi Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi, David Geffen Tıp Fakültesi Metabolizma Tema Ödülü, Klinik Translasyonel Bilim Enstitüsü ve Jonsson Kapsamlı Kanser Merkezi'ni kabul ediyoruz. Geniş Kök Hücre Araştırma Merkezi'nden (Rose Hills ve Ha Gaba) İnovasyon Ödülleri, Prostat Kanserinde UCLA SPORE'den bir Ödül (P50CA092131 Ödül Numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü), Geniş Kök Hücre Merkezi'nden bir İnovasyon Ödülü, UCLA'daki Eli ve Edythe Geniş Rejeneratif Tıp ve Kök Hücre Araştırma Merkezi'nden bir İnovasyon Ödülü, Tümör Hücresi Biyolojisi Eğitim Programı (USHHS Ruth L. Kirschstein Kurumsal Ulusal Araştırma Hizmeti Ödülü # T32 CA009056), UCLA AR071307'deki Dermatoloji T32 Programı ve UCLA Kas Hücresi Biyolojisi, Patofizyolojisi ve Terapötikleri T32 Eğitim Programı 5 T32 AF 65972.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G Needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
| Alcohol swabs | Fisher Scientific | 326895 | |
| Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 | WAHL Professional | 8787-450A | |
| Athymic nude mice (NU/J) | The Jackson labs | 002019 | These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced. |
| Cancer cells | ATCC | ATCC® CRL-11147™ | This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used. |
| Cell Culture Multi Flasks | Fisher Scientific | 14-826-95 | |
| Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Countess Cell Counting Chamber | Fisher Scientific | C10228 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
| Fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used. |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-6776-2 | |
| PBS USP grade for injection into mice | Fisher Scientific | 50-751-7476 | |
| Sterile 10 ml serological pipet | Celltreat | 667210B | |
| Sterile 5 ml serological pipet | Celltreat | 229005B | |
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-108 | |
| Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns | Fisher Scientific | 09-740-61A | |
| Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 15400054 | |
| Sterile tissue-culture grade PBS | Fisher Scientific | 50-751-7476 | |
| Sterle 25 ml serological pipet | Celltreat | 667225B | |
| TC treated 100 x 20 mm dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| TC treated 150 x 20 mm dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| TC treated 60 x 15 mm dishes | Genesee Scientific | 25-260 | |
| Trypan blue | Fisher Scientific | C10228 |
References
- Liu, T., et al. Cancer-associated fibroblasts: an emerging target of anti-cancer immunotherapy. Journal of Hematology and Oncololgy. 12 (1), 86 (2019).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25 (6), 719-734 (2014).
- Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
- Zhang, J., et al. Fibroblast-specific protein 1/S100A4-positive cells prevent carcinoma through collagen production and encapsulation of carcinogens. Cancer Research. 73 (9), 2770-2781 (2013).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D.
- Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
- Wang, W., et al. Crosstalk to stromal fibroblasts induces resistance of lung cancer to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. Clinical Cancer Research. 15 (21), 6630-6638 (2009).
- Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Tsujino, T., et al. Stromal myofibroblasts predict disease recurrence for colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 13 (7), 2082-2090 (2007).
- Laklai, H., et al. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression. Nature Medicine. 22 (5), 497-505 (2016).
- Cukierman, E., Bassi, D. E. Physico-mechanical aspects of extracellular matrix influences on tumorigenic behaviors. Seminars in Cancer Biology. 20 (3), 139-145 (2010).
- Attieh, Y., et al. Cancer-associated fibroblasts lead tumor invasion through integrin-beta3-dependent fibronectin assembly. Journal of Cell Biology. 216 (11), 3509-3520 (2017).
- Ahmadzadeh, M., Rosenberg, S. A. TGF-beta 1 attenuates the acquisition and expression of effector function by tumor antigen-specific human memory CD8 T cells. Journal of Immunology. 174 (9), 5215-5223 (2005).
- Feig, C., et al. Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 110 (50), 20212-20217 (2013).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontiers in Immunology. 9, 414 (2018).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
- Grum-Schwensen, B., et al. Suppression of tumor development and metastasis formation in mice lacking the S100A4(mts1) gene. Cancer Research. 65 (9), 3772-3780 (2005).
- Kojima, M., et al. Human subperitoneal fibroblast and cancer cell interaction creates microenvironment that enhances tumor progression and metastasis. PLoS One. 9 (2), 88018 (2014).
- Noel, A., et al. Enhancement of tumorigenicity of human breast adenocarcinoma cells in nude mice by matrigel and fibroblasts. British Journal of Cancer. 68 (5), 909-915 (1993).
- Sullivan, L. M.
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Damianova, R., Stefanova, N., Cukierman, E., Momchilova, A., Pankov, R. Three-dimensional matrix induces sustained activation of ERK1/2 via Src/Ras/Raf signaling pathway. Cell Biology International. 32 (2), 229-234 (2008).
- Rhee, S. Fibroblasts in three dimensional matrices: cell migration and matrix remodeling. Experimental & Molecular Medicine. 41 (12), 858-865 (2009).
- Hoffman, R. M.
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
- Naito, Y., et al. CD8+ T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer. Cancer Research. 58 (16), 3491-3494 (1998).
- Fu, C., Jiang, A. Dendritic Cells and CD8 T Cell Immunity in Tumor Microenvironment. Frontiers Immunolofy. 9, 3059 (2018).
- Lakins, M. A., Ghorani, E., Munir, H., Martins, C. P., Shields, J. D. Cancer-associated fibroblasts induce antigen-specific deletion of CD8 (+) T Cells to protect tumour cells. Nature Communications. 9 (1), 948 (2018).
- Kato, T., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Affect Intratumoral CD8(+) and FoxP3(+) T Cells Via IL6 in the Tumor Microenvironment. Clinical Cancer Research. 24 (19), 4820-4833 (2018).
- Gorchs, L., et al. Human Pancreatic Carcinoma-Associated Fibroblasts Promote Expression of Co-inhibitory Markers on CD4(+) and CD8(+) T-Cells. Frontiers Immunology. 10, 847 (2019).
- Duscher, D., et al. Fibroblast-Specific Deletion of Hypoxia Inducible Factor-1 Critically Impairs Murine Cutaneous Neovascularization and Wound Healing. Plastic Reconstructive Surgery. 136 (5), 1004-1013 (2015).
- Zheng, B., Zhang, Z., Black, C. M., de Crombrugghe, B., Denton, C. P. Ligand-dependent genetic recombination in fibroblasts : a potentially powerful technique for investigating gene function in fibrosis. American Journal of Pathology. 160 (5), 1609-1617 (2002).
- Swonger, J. M., Liu, J. S., Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Genetic tools for identifying and manipulating fibroblasts in the mouse. Differentiation. 92 (3), 66-83 (2016).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
- Ortiz-Montero, P., Londono-Vallejo, A., Vernot, J. P. Senescence-associated IL-6 and IL-8 cytokines induce a self- and cross-reinforced senescence/inflammatory milieu strengthening tumorigenic capabilities in the MCF-7 breast cancer cell line. Cell Communication and Signaling. 15 (1), 17 (2017).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biolofy. 4 (3), 83 (2006).
- Mitra, M., et al. Alternative polyadenylation factors link cell cycle to migration. Genome Biolofy. 19 (1), 176 (2018).
- Lemons, J. M., et al. Quiescent fibroblasts exhibit high metabolic activity. PLoS Biology. 8 (10), 1000514 (2010).
- Suh, E. J., et al. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biology. 13 (12), 121 (2012).
- Legesse-Miller, A., et al. Quiescent fibroblasts are protected from proteasome inhibition-mediated toxicity. Molecular Biology of the Cell. 23 (18), 3566-3581 (2012).
- Evertts, A. G., et al. H4K20 methylation regulates quiescence and chromatin compaction. Molecular Biology of the Cell. 24 (19), 3025-3037 (2013).
- Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
- Marinkovic, A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Matrices of physiologic stiffness potently inactivate idiopathic pulmonary fibrosis fibroblasts. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 422-430 (2013).
- Tschumperlin, D. J. Fibroblasts and the ground they walk on. Physiology (Bethesda). 28 (6), 380-390 (2013).
- Tschumperlin, D. J., et al. Mechanotransduction through growth-factor shedding into the extracellular space. Nature. 429 (6987), 83-86 (2004).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
- Alexander, J., Cukierman, E. Stromal dynamic reciprocity in cancer: intricacies of fibroblastic-ECM interactions. Current Opinions in Cell Biology. 42, 80-93 (2016).
