Summary
Burada iki fotonlu mikroskopi kullanarak canlı farelerin kafatası kemiğinin iliğindeki megakaryositleri ve proplateletleri görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.
Abstract
Trombositler, kemik iliğinde bulunan özel hücreler olan megakaryositler tarafından üretilir. Megakaryositleri gerçek zamanlı olarak ve doğal ortamlarında görüntüleme imkanı 10 yıldan daha uzun bir süre önce tanımlanmış ve trombosit oluşum sürecine yeni bir ışık tutmaktadır. Megakaryositler, sinüzoid damarların endotel astarı yoluyla proplatlet adı verilen uzun çıkıntıları uzatır. Bu makale, kafatası kemik iliği ve sinüzoid damarlardaki gerçek zamanlı floresan etiketli megakaryositlerde aynı anda görüntü vermek için bir protokol sürmektedir. Bu teknik, enflamatuar reaksiyonları sınırlamak için kafatasını sağlam tutan küçük bir ameliyata dayanır. Fare kafası, hareketlerin nefes almasını önlemek için kafatasına yapıştırılmış bir halka ile hareketsiz hale getirilir.
İki fotonlu mikroskopi kullanılarak, megakaryositler birkaç saate kadar görselleştirilerek sinüzoid damarların içindeki uzama sürecinde hücre çıkıntılarının ve proplatletlerin gözlemlenmesi sağlanabilir. Bu, çıkıntıların morfolojisi (genişlik, uzunluk, daralma alanlarının varlığı) ve uzama davranışları (hız, düzenlilik veya duraklama veya geri çekme aşamalarının varlığı) ile ilgili çeşitli parametrelerin ölçülmesine izin verir. Bu teknik aynı zamanda trombosit hızını ve kan akışı yönünü belirlemek için sinüzoid damarlarda dolaşan trombositlerin eşzamanlı olarak kaydedilmesini sağlar. Bu yöntem özellikle genetiği değiştirilmiş fareler kullanarak trombosit oluşumunda ilgi çekici genlerin rolünü incelemek için yararlıdır ve farmakolojik testlere de açıktır (mekanizmaları inceleyin, trombosit üretim bozukluklarının tedavisinde ilaçları değerlendirin). In vivo ve in vitro proplatlet oluşumunun farklı mekanizmalara dayandığı bilindiği için özellikle in vitro çalışmaları tamamlamak için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Örneğin, proplatlet uzaması için in vitro mikrotübüllerin gerekli olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, in vivo, esas olarak kan akış kuvvetleri tarafından teşvik edilen bir iskele olarak hizmet ederler.
Introduction
Trombositler kemik iliğinde bulunan megakaryositlere özel hücreler tarafından üretilir. Megakaryositlerin dolaşımdaki trombositleri serbest bırakmasının kesin yolu, kemikten gerçek zamanlı olayları gözlemlemedeki teknik zorluk nedeniyle uzun süre belirsiz kalmıştır. İki fotonlu mikroskopi bu zorluğun üstesinden gelmeye yardımcı oldu ve trombosit oluşum sürecini anlamada büyük ilerlemelere yol açtı. İlk in vivo megakaryosit gözlemleri 2007 yılında von Andrian ve meslektaşları tarafından yapıldı, floresan megakaryositlerin kafatasından görselleştirilmesiile 1. Bu mümkündü, çünkü genç yetişkin farelerin frontoparietal kafatasındaki kemik tabakası birkaç on mikron kalınlığa sahiptir ve alttaki kemik iliğindeki floresan hücrelerin görselleştirilmesine izin vermek için yeterinceşeffaftır 2.
Daha sonra yapılan çalışmalarda proplatelet oluşumunun çeşitli koşullar altında değerlendirilmesi ve alttaki mekanizmaların deşifre edilmesi için 3 ,4,5,6. Bu çalışmalar, megakaryositlerin proplatlet adı verilen çıkıntıları sinüzoid damarların endotel bariyeri yoluyla dinamik olarak genişlettiklerine dair kesin kanıtlar sağlamıştır(Şekil 1). Bu proplateletler daha sonra hacim olarak birkaç yüz trombosit temsil eden uzun parçalar olarak serbest bırakılır. Trombositler, özellikle akciğerlerde olmak üzere aşağı akış organlarının mikrosirkülasyonunda proplateletlerin yeniden şekillendirilmesinden sonra oluşacaktır7. Ancak bugüne kadar kesin süreç ve moleküler mekanizmalar tartışılmaya devam etmektedir. Örneğin, sitoskeletal proteinlerin proplatletlerin uzamasındaki önerilen rolü in vitro ve in vivo koşullar arasında farklılık gösterir3ve proplatlet oluşumundaki farklılıklar enflamatuar koşullar altında gösterilmiştir6. İşleri daha da karmaşık hale getiren, yeni bir çalışma proplatelet güdümlü konsepte itiraz etti ve in vivo, trombositlerin esasen megakaryosit seviyesinde bir membran tomurcuklama mekanizması ile oluştur olduğunu önerdi8.
Bu makale, canlı farelerde kafatası kemiğinden kemik iliğindeki megakaryositlerin ve proplatletlerin minimal invaziv bir prosedür kullanılarak gözlemlenmesi için bir protokol sunun. Benzer yaklaşımlar daha önce hematopoetik kök ve progenitör hücreler başta olmak üzere diğer ilik hücrelerini görselleştirmek içintanımlanmıştır 9. Burada, özellikle proplatlet morfolojileri ve trombosit hızı olmak üzere ölçülebilen bazı parametreleri detaylandırmak için megakaryositlerin ve trombositlerin gözlemlenmesi üzerinde durulmaktadır. Bu protokol, floresan izleyiciler ve ilaçlar enjekte etmek ve kafatası kemiğinden gözlemlemek için şahdamarına bir kateterin nasıl yerleştirılacağını sunar. Kalvarial kemik küçük bir ameliyat kullanılarak maruz kalır, böylece kemiğe bir halka yapıştırılır. Bu halka, başı hareketsiz hale getirmek ve nefes almaya bağlı hareketleri önlemek ve lensin daldırma ortamı olarak tuzlu su dolu bir bardak oluşturmak için hizmet eder. Bu teknik i) sinüsoid geometrisini ve damar duvarı ile etkileşime giren megakaryositleri gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için çok uygundur; ii) proplatlet oluşumu, uzama ve salınım sürecinde megakaryositleri takip edin; ve iii) karmaşık sinüzoid kan akışını izlemek için trombosit hareketlerini ölçmek. Bu protokol kullanılarak elde edilen veriler yakın zamanda yayımlanmıştır3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Avrupa standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi 2010/63/EU ve CREMEAS Strazburg Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Hayvan Tesisi sözleşmesi N°: G67-482-10, proje anlaşması N°: 2018061211274514).
1. Farelerin hazırlanması ve şahdamarına kateter yerleştirilmesi
NOT: Burada, erkek veya dişi, 5-7 haftalık mTmG muhabir fareleri kullanıldı (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) Pf4-girit fareleri11ile geçti , megakaryositlerde ve trombositlerde yoğun yeşil floresan etiketlemesine izin verdi12. Deneye başlamadan önce, mikroskobun ısıtma odasını birkaç saat önceden ısıtın.
- Fareyi görüntüleme odasına taşıyın ve anesteziye devam edin.
- Fareyi ketamin (100 μg/g) ve ksilazin (10 μg/g) (5 μL/g) çözeltisinin intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile uyuşturun.
NOT: Ketamin/ksilazinin tekrarlanan yönetimi burada kullanılır ve iyi çalışır, ancak düzenli reenjeksiyon için kaydın kesilmesini gerektirir. Alternatif olarak, bir anestezi makinesi varsa, anestezi indüksiyonu ketamin/ ksilazin ile yapılabilir ve daha sonra gazların solunması altında tutulabilir (izofluran, hava ve oksijen karışımı). - Hayvanı derin anesteziye ulaşana kadar kafesinde değiştirin. Fareyi sonraki tüm manipülasyonlar için 37 °C'de ısıtılmış ısıtılmış bir tabağa yerleştirin.
NOT: Hayvan derin anesteziye ulaşırken, mikroskobu ve tüm ekipmanları çalıştırın (bölüm 4.1'e bakın) ve ameliyat yapıldıktan sonra deneye başlamak için gereken farklı parametreleri ayarlayın (bkz. bölüm 4.2). Burada, prosedür sadece 3 saat sürer ve terminaldir. Fare, deneyden sonra uyanmadan ötenaziye tabir edilir. Bu nedenle, cilt ve aletler için etanol dezenfeksiyonı yeterlidir. Bununla birlikte, kurumsal yönergelere bağlı olarak veya prosedür daha uzun sürecekse, betadin / povidone ve alkol içeren üç alternatif önlük gibi daha eksiksiz dezenfeksiyon yöntemleri kullanılmalıdır.
- Fareyi ketamin (100 μg/g) ve ksilazin (10 μg/g) (5 μL/g) çözeltisinin intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile uyuşturun.
- Şahdamarına bir kateter takın.
NOT: Ameliyat sırasında mikrobiyal kontaminasyondan mümkün olduğunca kaçınmak önemlidir. Ameliyata devam etmeden önce cildi % 70 etanol (EtOH) ile dikkatlice dezenfekte etmeye özen edin. Her zaman sterilize makas ve cımbız kullanın ve düzenli olarak% 70 EtOH'da durulayın. Temiz bir yerde çalışın ve yüz maskesi takın. İntravenöz enjeksiyon için plastik bir tüpün içindeki bir iğneden oluşan 22 G'lik "iğnenin üzerinde" kateter kullanılır (bkz. Malzeme Tablosu).- Fareyi sırtına yerleştirin ve ön bacakları boğazı germek için cerrahi bantla sabitleyin (Şekil 2A). Boğazı% 70 etanol ile dezenfekte edin.
NOT: Kolaylık sağlamak için ameliyattan önce boğaz tıraş edilebilir. İşlem daha uzun sürerse, uygun aseptik teknik için dikkatli tıraş yapılmalıdır. - Steril makas kullanarak sağ veya sol şahdamarı üzerinde 0,7-1 cm'lik bir kesi yapın. Dış şahdamarını ve pektoral kasın üst kısmını ortaya çıkarmak için bitişik bağ dokusunu uzatın (Şekil 2A).
- Kateteri ılık, steril fizyolojik salin ile doldurun. Göğüs kasına nüfuz ettikten sonra kateteri damara yerleştirin (Şekil 2B).
NOT: Kateterin içindeki hava kabarcıklarından kaçınmaya özen edin. Kas bir sıkıştırma noktası oluşturacağından kanamayı önlemek için kateterin kastan yerleştirilmesi önemlidir. Itgb3-/- fareler gibi hemostaz defektleri olan fareler bile bu yaklaşımla kateter takılması üzerine kanamaz. - İğneyi yavaşça çıkarın ve gerekirse kateteri damarın daha derinlerine dikkatlice hareket ettinin. Şırınnayı bağlayın ve bir damla cerrahi yapıştırıcı ( Malzeme Masası ) ekleyerek kateteri stabilizeetti.
NOT: Damar daha küçük bir kalibreye sahip olduğu için biraz pratik gerektirse de kuyruk damarına kateter takmak mümkündür. Bu, kuyruk damarı neredeyse hiç görünmeyen koyu saçlı fareleri kullanırken özellikle zordur. Daha büyük kalibresi nedeniyle, kateterin şahdamarı içinde konumlandırılması, daha büyük hacimlerde veya tekrarlanan tedavilerin daha güvenilir bir şekilde enjekte edilmesine izin verebilir. Şırındıcın ilk kez ılık salinle doldurduğunu lütfen unutmayın ve ilaç çözeltisini enjekte etmeden önce ölü hacmi enjekte etmeyi unutmayın. - Fareyi dikkatlice eğilimli bir konuma getirin (Şekil 2C). Kuruluğu önlemek için gözlere jel (Malzeme Tablosu) uygulayın.
- Fareyi sırtına yerleştirin ve ön bacakları boğazı germek için cerrahi bantla sabitleyin (Şekil 2A). Boğazı% 70 etanol ile dezenfekte edin.
2. Kranial halkanın ameliyatı ve montajı
NOT: Fare kurulumu için tam destek 4 adet, bir blok ve bir plaka, fare kafasını tutmak için halka ve halkayı bloğa sabitlemek için bir vidadan oluşur (Şekil 3A). Desteğin tüm unsurları 3D baskı ile i.materialise.com elde edilmiştir. Plaka akrilonitril bütadien stiren (ABS) polimer, paslanmaz çelik blok ve vida ve yüksek dereceli paslanmaz çelik halka (yüksek ayrıntılı paslanmaz çelik) yapılmıştır (Bkz. Boyutlar için Ek Şekil S1 ve 3D baskı dosyaları için Ek Malzemeler). Blok, vidalı veya yapıştırılmış olarak desteğe kalıcı olarak sabitlenir. Halka fare kafatasına sabitlendikten sonra, blok tutucuya vidalanmalıdır (Şekil 3A).
- Saç derisindeki saçları dezenfeksiyon için% 70 etanol ile ıslanmış bir kağıt havlu ile nemlendirin. Tüm gevşek saçları ıslak bir kağıt havlu ile çıkarın.
NOT: Kolaylık sağlamak için ameliyattan önce kafa derisi tıraş edilebilir. - Kalvarium'u steril ince makas ve cımbız kullanarak ortaya çıkarmak için orta çizgide 1 cm'ye kadar ve kulakların arasında bir T oluşturarak kafa derisini kuluçkaya yatırın.
NOT: Halka ön ve parietal kemikler üst üste gelecek şekilde konumlandırılacaktır (Şekil 3B). - Kafatasını ortaya çıkarmak için steril cımbız kullanın. Periosteumu makas ve cımbızla dikkatlice çıkarın. Görüntülemeyi değiştirebilecek tüm periosteumu ve herhangi bir döküntüyü veya saçı çıkarmak için fizyolojik salin ile ıslatılmış steril bir pamuklu çubuk kullanın.
NOT: enflamatuar reaksiyonları sınırlamak için kemiğe zarar vermemeye çok dikkat edin. - Salin ile durulayarak kan izlerini çıkarın ve kemiği kuru bir pamuklu çubukla hızla kurutun. Tutkal jelini halkaya uygulayın, açıkta kalan kemiğe yerleştirin ve halkanın kafatasına sıkıca tutturulması için birkaç saniye saklayın.
NOT: Gözlem alanına istenmeyen otofluoresansa yol açabileceği için tutkal girmemelidir. - Kafatasını fizyolojik saline batırılmış pamuklu çubukla hafifçe nemlendirin.
- 1:1 mavi ve sarı bileşenleri dikkatlice karıştırarak silikon diş macunu hazırlayın. Görüntüleme sırasında sızıntıyı önlemek için sızdırmazlık için halkanın etrafına diş macunu uygulayın. Halkaya girmiş olabilecek herhangi bir diş macunu veya yapıştırıcıyı dikkatlice çıkarın.
- Yüzüğü tuzlu suyla doldurun ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
NOT: Salin, mikroskop hedefi için daldırma aracı görevi görür. Hemostazla ilgili kusurları olan fareler kullanırken kanama daha kritik olabilir. Daha fazla görüntülemeyi bulanıklaştırabileceğinden kanın halkaya girmesini önlemek önemlidir. - Fareyi desteğin üzerine yerleştirin ve halkayı blok tutucuya vidala(Şekil 3C). Başı kaldırmak ve yüzüğün kafatasından kopmasını önlemek için hayvanın başının altına katlanmış kompres yerleştirin.
NOT: Kafa, nefes alma nedeniyle görüntü hareketlerini önleyecek şekilde doğrudan sabitlenir. - Destek ve fare tertibatını ısıtılmış mikroskop haznesindekonumlandırın (Şekil 3D).
NOT: Takılan kateteri herhangi bir zamanda yerinden çıkarmamaya dikkat edin.
3. Anestezi yapılan farelerin deney sonuna kadar takibi
NOT: Anestezi, 5 μL/g vücut ağırlığı hacminde ve ketamin.c (50 μg/g) ve kslazin (5 μg/g) (1,2 μL/g) karışımında ketin (25 μg/g) enjeksiyonlarının değiştirilmesiyle her 35 dakikada bir yeniden indüklendirilir. Isıtılmış mikroskop odasının edinim sırasında açılması mümkün olmadığı için anestezik izleme, anestezinin tekrar yapılmasından önce ve sonra parmak sıkışması ile gerçekleştirilir. Benzer şekilde, her yeni video kaydına başlamadan önce parmak sıkışması gerçekleştirilir.
- Gerekirse, s.c. enjeksiyonu ile alımı durdurun ve anesteziyi yeniden teşvik edin.
- Fare kafasını hareket ettirmemeye dikkat etmenin, sırtın derisini sol elin başparmağı ve işaret parmağı arasında kıstırın. Deri altı anesteziyi sağ eli kullanarak arka cildin kıvrımlarına enjekte edin (veya solaklar için tam tersi).
- Halkada salin olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse taze salinle doldurun. Sonraki 35 dakika boyunca kayda devam edin ve kayıt süresi boyunca benzer şekilde devam edin.
- Deneyin sonunda, fareyi uyanmadan önce servikal çıkık ile ötenazi yapın.
NOT: Fare, yerel etik ve hayvan refahı komitesi ile aynı fikirde olarak maksimum 3 saat boyunca uyuşturulur.
4. İki fotonlu görüntüleme
NOT: Mikroskop ve ilgili ekipman hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosuna bakın. Görüntüler rezonans tarayıcı (12 veya 8 kHz) ile kaydedildi. Pikseller her iki yönde de kaydedildikçe hız alımını artırmak için çift yönlü mod kuruldu; bu nedenle, fazdaki herhangi bir uyumsuzluk kontrol paneli "faz düzeltme" ile düzeltilmelidir. Son olarak, satın alma hızı ile sinyal-gürültü oranı arasında bir uzlaşma olarak uyarlanmış bir ortalama kuruldu.
- Lazer ve rezonans tarayıcı da dahil olmak üzere iki foton mikroskobu kapatın (çıkış lazer gücü genellikle lazere bağlı olarak ~1.8-2.5 W).
- Seçilen floroforlar için uygun lazer dalga boylarını ayarlayın. Yayılan ışıkların geri kazanımı için uygun dalga boylarını ayarlayın.
NOT: Burada, AlexaFluor-488 ve Qtracker-655'i aynı anda heyecanlandırmak ve tespit etmek için sırasıyla 913 nm dalga boyu ve hibrit dedektörler (500-550 nm ve 575-625 nm) kullanıldı. - İntrajuguler kateteri kullanarak, vaskülatları etiketlemek için floresan izleyiciyi enjekte edin (Qtracker-655; Malzeme Masası). Maksimum 150 μL/deney için saatte bir yenilenen 0,2 μM'de bir çözeltinin 50 μL/faresi enjekte edin.
NOT: Yüksek moleküler ağırlıklı dektran1gibi diğer izleyiciler kullanılabilir. Bu durumda, kan viskozitesi dekstran ile değiştirilebilir ve bazı hemoheolojik parametreleri değiştirebilirsiniz. - Mikroskop aşamasını destek ve fare ile mikroskop hedefinin altına yerleştirin. Yüzüğün her zaman tuzlu suyla dolu olup olmadığını kontrol edin ve hedefi daldırin. Sinüzoid damarlar boyunca hizalanmış kemik iliği damarlarını (kırmızı) ve megakaryositlerin (yeşil) varlığını bulmak için epifluoresans kullanın.
NOT: Kafatası kemiği 100 μm2'dendaha düşük bir kalınlığa sahiptir. İlik kemiğin altında bulunur ve floresan yeşil megakaryositler ve Qtracker-655 ile etiketlenmiş yoğun kırmızı anastomozlu sinüzoid damarlar tarafından kolayca tanınır. - Uzun satın almalar (megakaryositler, proplateletler)
- İlgi çekici bölgeyi arayın. Yukarıda belirtildiği gibi görüntü alma parametrelerini uygulayın.
- Uzun alımlar için (örneğin, proplatelet oluşumunun veya uzamasının görselleştirilmesi), 8 kHz rezonans tarayıcı kullanarak optimize edilmiş aralıklarla (genellikle 0,85 ila 1,34 μm arasında) z yığını görüntüler elde edin.
NOT: 12 kHz rezonans tarayıcı alım hızını artırabilir. - Tüm megakaryosit ve tekneyi görselleştirmek için 384 x 384 piksel görüntü alın. İyi çözünürlükte hızlı alım için istenildiği gibi hat ortalamasını kullanın. Proplatelet görselleştirme için genellikle 10 s veya 30 s olmak üzere görüntü yığını alımının zaman aralığını belirleyin.
NOT: Burada, 8 kHz rezonans tarayıcı ile 1 görüntü/10 sn elde etmeyi sağlayan daha yüksek bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için ortalama 8 hat kullanıldı. Canlı edinme sırasında hat ortalamasına izin verildiğine emin olun.
- Kısa ve hızlı alım (trombositler)
NOT: Trombosit hızı gibi hızlı olayların daha kısa sürede eldeılması için kare alma oranını en üst düzeye çıkarmak önemlidir. Uygun alım türünün seçilmesi, kare alım hızını (örneğin, "xyt" alan-zaman alım türü) optimize edecektir.- Simge durumuna küçültün (örneğin, 256 x 90 piksel) ve gerekirse görüntüleme alanını döndürerek görüntü boyutunu damara ayarlayın.
- Mevcut en yüksek tarama hızını kullanın.
- Çift yönlü tarama kullanın.
NOT: Çift yönlü tarama için fazın iyi ayarlandığından emin olun. - Görüntü tanımı ve edinmenin hızlılığı arasındaki en uygun uzlaşmayı bulmak için çizgi ortalamasını en aza indirin.
NOT: Trombosit hızı ölçümleri için, elde edinme hızını artırmaya yardımcı oluyorsa pikselleştirilmiş bir görüntü yeterli olabilir. - Edinme hızlılığını artırmak için z yığınını en aza indirin. Trombosit hızını ölçmek için yalnızca 1 z yığını elde etmek yeterlidir. Trombosit hızını ölçmek için 10-20 s'ye alın.
NOT: 12 kHz rezonans tarayıcı ile bu koşullar kullanılarak en fazla 133 kare/sn elde edilebilir. Parametreler koşullara uyarlanmalıdır. Bazı gemilerde trombosit hızı, trombosit hızını bu ayarlarla güvenilir bir şekilde ölçmek için çok yüksektir.
- Proplatelet genişliği ve uzunluğu ölçümü
NOT: Leica yazılımında elde edilen LIF dosyalarını ImageJ ile yüklemek için, önce Bio-Formats Importer'ı kullanmak üzere ImageJ'e LOCI eklentisini indirip yükleyin.- Proplatelet genişliği
- Filmi ImageJ ile açın. Genişlik ölçümü yapmak için, sadece proplateletlerin filmini kapsız kullanın. Farklı kanalları ayırmak için Görüntü'ye tıklayın| Kanalları renklendir ve Böl 'useçin.
- Z yığını filmi için Görüntü'ye tıklayarak her zaman noktası için ortalama bir z-projeksiyonu yapın| Yığınlar ve Z Projesi 'niseçin. Projeksiyon türü için, ortalama Yoğunlukgirin.
- Gürültüyü kaldırmak için görüntüyü tedavi edin. İşlem'e tıklayarak arka planı çıkarın| Arka planı çıkarın ve Yuvarlanan top yarıçapını uygulayın: 50,0 piksel. İşlem ve Düzgünleştir 'e tıklayarak görüntüyü pürüzsüzleştirin.
- Proplatetin tabanına yakın bir çizgiyi takip edin (megakaryosit yakınında, başka bir nesneden kaçınarak).
NOT: Analiz Et ve Ölçeği Ayarla 'ya tıklayarak istenen birimdeki değeri elde etmek için görüntünün ölçeğini ayarlamayıunutmayın. Varsayılan olarak, görüntünün birimi piksel cinsindendir. - Yoğunluk profilini çizin, gauss eğrisini takın ve Tam Genişliği Yarım Maksimum (FWHM) olarak hesaplayın. Bunun için, Eklentiler'e tıklayarak aşağıdaki komut dosyasını bir makroya yazın| Yeni'yi seçin ve Makro'yu tıklatarak çalıştırın| Makro çalıştır: y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit("Gaussian",x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * kare( 2 * log(2) ) * sigma; yazdır(FWHM).
NOT: Hat taramasında proplatelet yoğunluğuna karşılık gelen tek bir tepe noktası olduğundan emin olun. - Proplatetin ortalama genişliğini elde etmek için 1 dilim üzerinde 4.7.5 adımında açıklanan veya zaman içinde tekrarlanan eylemleri gerçekleştirin
- Proplatelet uzunluğu
- Proplatlet boyunca, megakaryosit'e yakın tabandan üste doğru bir çizgi takip edin. Proplatelet şeklini izlemek için parçalı bir çizgi kullanın. Her zaman noktası için tekrarlayın.
- Yatırım Getirisi Yöneticisi'ni kullanarak her satırı kaydetmeyi unutmayın: Analiz | tıklayın Araçlar'ı seçin ve Yatırım Getirisi Yöneticisi'ni seçin. Bir klasördeki tüm satırları kaydetmek için Seçimi Kaldır'daki Yatırım Getirisi Yöneticisi'ni | Daha fazla ve tıklayın Kaydet. Yatırım Getirisi Yöneticisi'nden, sonuçlar tablosundan her satırın uzunluk değerini (Ölçü) ayıklayın.
NOT: Analiz Et ve Ölçeği Ayarla'ya tıklayarak istenen birimlerdeki değeri elde etmek için görüntünün ölçeğini ayarlamayı unutmayın. Varsayılan olarak, görüntünün birimi piksel cinsindendir.
- Proplatelet genişliği
- Trombosit hızı ölçümü
NOT: Trombosit hızı, geminin içinde 10-20 sn'nin üzerinde akan floresan trombositlerin video kaydından hesaplanır. Döngüsel olarak tekrarlanan hat tarama verilerini elde etmek için ilk görüntü tedavisi gerçekleştirilir. Hareket, açısı hıza bağlı olan çizgilere yol açar ve hesaplanmasına izin verir. Burada hız, klasik Tekil Değer Ayrışması (SVD) yöntemi15'tendaha sağlam olan Radon dönüşümünü kullanan bir yöntemle hesaplanmıştır.- ImageJ ile görüntü muamelesi
- Filmi ImageJ ile açın. İşlem | tıklayarak Gauss Bulanıklaştırma filtresi uygulama Filtreler, Gauss Bulanıklığı'nın öğesini seçin ve Sigma (Yarıçapı): 2,00uygulayın. Akışı ölçmek için küçük bir bölge seçin ve akış yönünü izleyen 3 bitişik çizgiyi izleme.
NOT: Analiz | tıklayarak yatırım getirisi yöneticisini kullanarak her satırı kaydetmeyi unutmayın Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi. Her satırı eklemek ve kaydetmek için Yatırım Getirisi Yöneticisi penceresinde Ekle'yi tıklatın; Seçimi Kaldır | önce tıklayın daha fazla ve sonra Tıklayın Kaydet. - ImageJ hat tarama yazılımını kullanarak, Resim | tıklayarak her satır için bir kimograf oluşturun Yığınlar; Yeniden Kaydır'ı seçin ve aşağıdaki parametreleri uygulayın: Çıkış aralığı (mikronlar): 1.000 / Dilim sayısı: 1 / İnterpolasyondan kaçının. Elde eden uzay-zaman görüntülerini kaydedin.
NOT: Elde eden görüntü, zaman içinde kan akışındaki trombositlerin doğrusal hareketine karşılık gelen çizgileri gösterir. Bir çizginin açısı hızın bir işlevidir.
- Filmi ImageJ ile açın. İşlem | tıklayarak Gauss Bulanıklaştırma filtresi uygulama Filtreler, Gauss Bulanıklığı'nın öğesini seçin ve Sigma (Yarıçapı): 2,00uygulayın. Akışı ölçmek için küçük bir bölge seçin ve akış yönünü izleyen 3 bitişik çizgiyi izleme.
- Matlab veya GNU Octave yazılımı kullanarak hız ölçümü
NOT: Kan akışındaki trombositlerin hızı, Drew ve işbirlikçileri tarafından açıklanan Radon dönüşümüne dayanan bir hesaplama analizi yöntemi kullanılarak uzay-zaman görüntülerinden tahmin edilmektedir15. Bu matematiksel yöntemin açıklaması bu incelemenin kapsamı dışındadır ve okuyucu, hesaplama15ile ilgili ayrıntılar için Drew ve ark. Hem Matlab kodu hem de daha fazla bilgi https://www.drew-lab.org/code web sitelerinde mevcuttur.- Matlab veya GNU Octave yazılımını kullanarak kodu açın.
NOT: Kod, istenen çalışmaya göre adaptasyon gerektirebilir. - Değeri, aynı kap kısmında çizilen bitişik çizgilere karşılık gelen 3 uzay-zaman görüntüsünden çıkarın. Geminin bu kısmı için ortalama trombosit akış hızı değerini hesaplayın.
NOT: Sonucu doğru ölçü birimine (örneğin, μm/s) dönüştürmeyi unutmayın.
- Matlab veya GNU Octave yazılımını kullanarak kodu açın.
- ImageJ ile görüntü muamelesi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol kullanılarak, floresan izleyici Qtracker-655, kafatası kemik iliğindeki anastomoz ilik sinüzoid damarlarını ve okların tasvir ettiği akış yönünü görüntülemek için intravenöz olarak uygulandı (Şekil 4A, sol). mTmG fareleri kullanılarak, eGFP floresan trombositler her gemi dalında 20 sn'nin üzerinde kaydedildi ve hızları ImageJ ve GNU Octave yazılımı kullanılarak ölçüldü (Şekil 4A, sağ). Akış hızı ve yönündeki heterojenliğe dikkat edin. Sinüzoid damarlar, Video 1'dekaydedilen çatallanmada gösterildiği gibi, akış-yeniden akış ve hatta durağanlık varlığı ile anastomozlar nedeniyle karmaşık akışlar sunar. Aynı çatallanma Şekil 4B'de (solda), kırmızı ve mavi oklar zıt akışları vurgulayarak gösterilir. Bu çatallanmadaki trombosit hızı ölçüldü ve grafikte bildirildi (Şekil 4B, sağ). Kırmızı izleme, sol damar kolundaki hıza ve sağ damar kolundaki mavi iz sürmeye karşılık gelir. Bu, hızlanma, durağanlık ve yavaşlama aşamaları ile her gemi dalında zaman içinde düzensizlik gösterir. Bazı damarlarda, mevcut edinim koşullarında güvenilir analiz için kan akışının çok hızlı olduğunu belirtmek önemlidir.
Proplatelet uzama kaydı, zaman içinde çeşitli morfolojilerinin görselleştirilmesine izin verir (Şekil 5). Bazı proplateletler düzensiz morfolojilerle uymaktadır (Şekil 5Ai ve Video 2). Diğerleri, genellikle daha ince olanlar, uzatmalarını takip etmek için alım penceresinin hareketini gerektiren uzun mesafelere uzanabilir (Şekil 5Aii ve Ek Video 1). Diğerleri daha kısa ve kalındır ve genellikle yavaşça uzatır (Şekil 5Aiii ve Ek Video 2). Megakaryositler, Şekil 4B'degösterilen çatallanma gibi karmaşık akış alanlarında proplateletleri genişlettiğinde, proplateletler akış yönüne göre bir damar dalından diğerine atılır (Şekil 5B ve Video 3). Hemodinamik kuvvetlerin akış yönünde proplatelet uzaması için önemi, fare beklenmedik bir şekilde kalp durması geçirdiğinde kanıtlandı. Kan akışını durdurmak megakaryosit tarafından uzatılan proplateletleri gevşetti (Şekil 5C ve Video 4).
Edinme kalitesi/çözünürlüğü uygun olduğunda, deklamente kadar proplateletlerin uzunluğu, proplatetin tabanındaki genişlikleri veya tanımlanmış herhangi bir konum veya tomurcukların büyüklüğü gibi morfolojik parametreler ölçülebilir (Şekil 6A). ~185 μm ortalama maksimal proplatlet uzunluğu (aralık 41.5-518.5 μm) ve ortalama proplatelet genişliği 5.2 μm (aralık 2.8-8 μm) hesaplanmıştır (Şekil 6A). Proplatlet uzunluğunun zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmesi, uzama, durağanlık ve hatta geri çekme aşamalarında proplateletlerin davranışının görselleştirilmesine izin verir (Şekil 6B). Proplatlet uzama hızının ölçümü, proplatletlerin uzama, durağanlık veya geri çekme davranışını doğrudan yansıtan önemli bir parametredir3.
Proplatelet ana hücresine bağlı kalırsa proplatelet uzama hızı ölçülebilir; ayrıldıktan sonra, akış tarafından hemen taşınacak ve görselleştirme penceresinden kaybolacaktır. Vahşi tip (WT) farelerde, ortalama proplatlet uzama hızı ~ 10 μm / dk idi (Şekil 6C), önceki yayınlarla aynı fikirdeolarak 1. Son olarak, juguler damara yerleştirilen kateterden ilaç enjekte etmek mümkündür. Örneğin, mikrotübülleri depolimerize eden bir ilaç olan vincristine intravenöz uygulamanın, WT farelerinden proplateletlerin geri çekilmesine yol açtığı, ancak miyosin IIA eksikliği olan farelerden(Myh9-/-) ( Video 5 ve Video 6)3proplateletler üzerinde hiçbir etkisi olmadığı görülmüştür.
Şekil 1: Kemik iliğinde proplatlet oluşumunun şematik gösterimi. Hematopoetik kök hücrelerden farklılaştıktan sonra, büyük megakaryositler sinüzoid damarlar boyunca hizalanır ve proplatelet adı verilen sitoplazmik projeksiyonları endotel bariyerinden uzatır. Proplateletler, hemodinamik kuvvetlerin etkisiyle, aşağı akış mikrosirkülasyonunda trombositlere daha fazla yeniden şekillendirmek için uzatır ve ayrılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kateterin yerleştirilmesi. (A) Şahdamarını ve pektoral kasın üst kısmını ortaya çıkarmak için bir kesi yapılır. (B) Salin dolu kateter, kastan geçirilerek şahdamarına sokularak kompresyon noktası oluşturulur. (C) Fare dikkatlice döndürüldü, böylece kateter iyi konumlandırılmış ventral yüzeyi aşağı doğru uzanacak şekilde. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kafatası kemiğinden iki foton görüntüleme için kullanılan deneysel kurulum. (A) 3D baskılı paslanmaz çelik blok ABS polimer desteğine sabitlenmiştir (bkz. 3D tasarımlar için Ek Şekil S1 ve Ek Malzemeler). Blok ve kafatası halkası, halkanın bloğa vidalanabilmesi için tasarlanmıştır. Kullanım kolaylığı için vida kafasının Epon'a yerleştirildiğini unutmayın. (B) Halkanın açıkta kalan kafatası kemiği üzerindeki konumunu gösteren şematik. (C) Kafatasına yapışmış halka ile fareyi, bir doku yastığının üzerindeki başı ve (D) mikroskop hedefinin altındaki konumlandırmayı gösteren fotoğraflar. Kısaltmalar: 3D = üç boyutlu; ABS = akrilonitrile bütandien stiren. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kafatası kemik iliği anastomozlu sinüzoid damarlarda trombosit hızının ölçüsü. (A) Q-Dot enjeksiyonu ile etiketlenmiş sinüzoid damarların sol, iki fotonlu görüntülenmesi. Kafatası kemik iliğindeki sinüzoid damarların anastomozını gösteren z-projeksiyonu. Oklar, sinüzoidlerdeki akışların karmaşıklığını gösteren akış yönünü gösterir. Doğru, ortalama akış hızı her bir gemi dalındaki trombosit hızının ölçümü ile tahmin edilmektedir. X eksenindeki sayılar soldaki görüntüdeki ok numaralarına karşılık gelir. (B) Sol, noktalı çizgilerle tanımlanmış sinüzoid çatallanma, zıt yönlerde akan trombositleri gösterir (kırmızı ve mavi oklar) (Video 1'ekarşılık gelen). İki fotonlu tek düzlem görüntüsü. Sağ, geminin her bir bölümündeki akış hızını zamanın bir fonksiyonu olarak gösteren bir grafik (kırmızı çizgi, sol taraf; mavi çizgi, sağ taraf), durağanlık, hızlanma ve yavaşlama aşamalarını gösterir. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kafatası iliğinde iki fotonlu mikroskopi ile gözlenen çeşitli proplatelet morfolojileri. (A) Üç temsili in vivo proplateletler: zaman atlamalı deneylerden z-projeksiyon görüntüleri (Video 2, Ek Video 1ve Ek Video 2'degösterilmiştir) kemik iliği sinüzoidleri içinde uzanan proplatletlerin (okların) çeşitli morfolojilerini gösterir. Proplateletler ve megakaryositler yeşildir; sinüzoid damarlar kırmızı rens. (B) Şekil 4B'deolduğu gibi aynı çatallanmada bir proplatürün hızlandırılmış görüntüleri , akış yönüne göre salınım (Video 3'tede gösterilmiştir). (C) farenin kalp durması nedeniyle kan akışının kesilmesinden sonra 3 proplatürün gevşemesini gösteren z-projeksiyon zaman atlamalı görüntüler (Video 4'tegösterilmiştir), daha önce aynı akış çizgisinde hizalanmıştır (beyaz, sarı ve mavi oklarla gösterilir). Ölçek çubukları = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Proplatelet morfolojik analizler. (A) Proplatelet genişliğinin maksimum uzunlukla birlikte ölçüldüğü yeri gösteren üst, z-projeksiyon görüntüsü; aşağıda, 25 ayrı proplatletin maksimum uzunluğunu ve uzama boyunca aynı proplateletlerin (aynı gri kod) ortalama proplatelet genişliğini temsil eden grafikler verilmiştir. i) Proplatelet genişliği, proplatetin tabanına yakın sabit bir pozisyonda dik bir çizgi çekilerek ölçüldü ve profil yoğunluğu her dakika bu pozisyonda kaydedildi. Bu profile bir Gauss eğrisi takıldı ve FWHM'nin proplatetin genişliğini temsil etmesi düşünüldü. Ortalama genişlik daha sonra sabit konumdaki her zaman noktasında ölçülen proplatelet genişliklerinin ortalaması alınarak hesaplandı. Çubuklar, edinme sırasında her dakika ölçülen genişliğin ± ortalamasıdır; ii) maksimum proplatlet uzunluğu da proplatetin tabanından ucuna kadar belirlenmiştir. (B) WT proplateletlerinin uzama davranışını gösteren bireysel izlemeler, bazıları duraklama ve geri çekme aşamaları sunar. Proplatelet büyüme sürecindeki duraklamaları ve geri çekilmeleri daha iyi vurgulamak için, her 10 s'de bir ölçülen uzunluk, her proplatetin maksimum uzunluğunun bir yüzdesi olarak temsil edildi. (C) Proplatelet uzama hızını temsil eden saçılma arsası. Net ortalama proplatlet uzama hızı (duraklamalar ve geri çekmeler dahil), tüm zaman dizisi boyunca ortalama olarak 1 dakika aralıklarla proplatelet uzunluğundaki değişiklik olarak hesaplandı. Bireysel değerler ve ortalama ± sem. Kısaltmalar: FWHM = Yarım Maksimum Tam Genişlik; sem = ortalamanın standart hatası; WT = vahşi tip.
Video 1: Sinüzoid damarlar içinde ters akış. Sinüzoid damarlar içinde dolaşan trombositler (yeşil) (kırmızı, Qtracker) (tek konfokal z-düzlem). Anastomozlu sinüzoid bir damar, akışın kararsız olduğu ve durağanlık, hızlanma ve yavaşlama evrelerini gösteren çatallanmalar sunar. 12 kHz rezonans tarayıcı ve 0.95 (Leica) sayısal diyafram açıklığına sahip 25x su hedefi, bir düzlem, 256 x 90 piksel, çift yönlü alım, hat ortalaması 2.
Video 2: Uzatılan proplateletler çeşitli morfolojiler gösterir. Kemik iliği sinüzoidleri (kırmızı, Qtracker) içinde çeşitli morfolojilere (yeşil) sahip proplatletleri genişleten megakaryositlere sahip bir WT faresinde temsili zaman atlamalı video kaydı (z-projeksiyon). 12 kHz rezonans tarayıcı ve 0,95 (Leica) sayısal diyafram açıklığına sahip 25x su hedefi ile donatılmış bir Leica SP5 mikroskobu ile elde edilen z-stack 10 s aralıklarla alım, 4 μm z derinliği, x-y çözünürlük 384 x 384 piksel, ortalama 8 çizgi. Gerektiğinde, profiller ortalama bir z projeksiyonu elde etmek için ImageJ şablonu eşleştirme eklentisi kullanılarak hizalandı. Görüntü kalitesine bağlı olarak, arka plan çıkarılır, görüntü düzeltilir ve parlaklık ve kontrast ayarlanır. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 3: Proplateletler akış yönündeki değişikliklerle atılır. Video 1'degösterilen sinüzoid çatallanmada vahşi tip bir megakaryosit gösteren hızlandırılmış video , akış yönüne bağlı olarak bir damar dalında salınan bir proplatletin uzatılması sürecinde (z-projeksiyon). 12 kHz rezonans tarayıcı ve 0,95 (Leica) sayısal diyafram açıklığına sahip 25x su hedefi ile donatılmış bir Leica SP5 mikroskobu ile elde edilen z-stack 10 s aralıklarla alım, 4 μm z derinliği, x-y çözünürlük 384 x 384 piksel, ortalama 8 çizgi. Profiller ImageJ şablonu eşleştirme eklentisi kullanılarak hizalandı ve ortalama bir z projeksiyonu elde edildi. Arka plan çıkarılıp görüntü düzeltildi ve parlaklık ve kontrast ayarlandı. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 4: Akışın proplatelet hizalaması ve gerilimi üzerindeki etkisi. Kalp durmasından önce ve sonra bir proplatetin hızlandırılmış video kaydı. Videoda, kalp durmasından önce aynı akış hattında üç proplatlet (yeşil, AF-488 anti-GPIX antikor türevi ile etiketlenmiş), böylece iki fotonlu mikroskopinin çözünürlüğünde zayıf bir şekilde bireyselleştirilmiştir. Kalp durmasından sonra, üç proplatlet ayrılır ve kan akışının yokluğunda rahatlar. Video, 8 kHz rezonans tarayıcı ile donatılmış bir Leica SP8 konfokal mikroskop ile elde edildi, 0.95 (Leica) sayısal diyafram açıklığına sahip 25x su hedefine sahip görüntü. Profiller ImageJ şablonu eşleştirme eklentisi kullanılarak hizalandı ve ortalama bir z projeksiyonu elde edildi. Arka plan çıkarılıp görüntü düzeltildi ve parlaklık ve kontrast ayarlandı. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 5: Vincristine ilaç enjeksiyonunun WT farelerinin proplatelet davranışı üzerindeki etkisi. Vincristine (1 mg/kg) (z-projeksiyon) uygulamadan önce ve sonra bir proplatelet zaman atlamalı video kaydı. Sinüzoid damarlar (kırmızı) içindeki uzun proplatlet (yeşil), vincristine intravenöz uygulamadan sonra geri çekilmeye başlar. Video, 8 kHz rezonans tarayıcı ile donatılmış bir Leica SP8 konfokal mikroskop ile elde edildi, 0.95 (Leica) sayısal diyafram açıklığına sahip 25x su hedefine sahip bir görüntü. Profil, ImageJ şablonu eşleştirme eklentisi kullanılarak hizalandı ve ortalama bir z projeksiyonu elde edildi. Arka plan çıkarılıp görüntü düzeltildi ve parlaklık ve kontrast ayarlandı. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 6: Vincristine ilaç enjeksiyonunun miyozin eksikliği olan farelerin proplatelet davranışı üzerindeki etkisi. Vincristine (1 mg/kg) (z-projeksiyon) uygulamadan önce ve sonra bir proplatelet zaman atlamalı video kaydı. Sinüzoid kaplar (kırmızı) içindeki uzun proplatlet (yeşil) Myh9-/- farelerde uzamaya devam eder. Video, 8 kHz rezonans tarayıcı ile donatılmış bir Leica SP8 konfokal mikroskop ile elde edildi, 0.95 (Leica) sayısal diyafram açıklığına sahip 25x su hedefine sahip bir görüntü. Profil, ImageJ şablonu eşleştirme eklentisi kullanılarak hizalandı ve ortalama bir z projeksiyonu elde edildi. Arka plan çıkarılıp görüntü düzeltildi ve parlaklık ve kontrast ayarlandı. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S1: Kafatası halkasının 3D baskısı için tasarım ve destek. Bu tasarım, yüksek kaliteli paslanmaz çelikte kafatası halkasını (A), (B) vidayı, (C) paslanmaz çelik blok ve (D) ABS polimer desteğini yazdırmak için kullanılmıştır. Kısaltmalar: 3D = üç boyutlu; ABS = ABS = akrilonitrile bütan stiren. Bu Rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek videolar:
Ek Video 1: Kemik iliği sinüzoidleri (kırmızı, Qtracker) içinde proplatelet (yeşil) uzatan megakaryositli vahşi tip bir farede temsili zaman atlamalı video kaydı (z-projeksiyon). 12 kHz rezonans tarayıcı ve 0,95 (Leica) sayısal diyafram açıklığına sahip 25x su hedefi ile donatılmış bir Leica SP5 mikroskobu ile elde edilen z-stack 10 s aralıklarla alım, 1,34 μm z derinliği, x-y çözünürlük 384 x 384 piksel, ortalama 8 çizgi. Gerektiğinde, profil ortalama bir z projeksiyonu elde etmek için ImageJ şablonu eşleştirme eklentisi kullanılarak hizalandı. Görüntü kalitesine bağlı olarak, arka plan çıkarılır, görüntü düzeltilir ve parlaklık ve kontrast ayarlanır. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Video 2: Kemik iliği sinüzoidleri (kırmızı, Qtracker) içinde proplatelet (yeşil) uzatan megakaryositli vahşi tip bir farede temsili zaman atlamalı video kaydı (z-projeksiyon). 12 kHz rezonans tarayıcı ve 0,95 (Leica) sayısal diyafram açıklığına sahip 25x su hedefi ile donatılmış bir Leica SP5 mikroskobu ile elde edilen z-stack 10 s aralıklarla alım, 1,34 μm z derinliği, x-y çözünürlük 384 x 384 piksel, ortalama 8 çizgi. Gerektiğinde, profil ortalama bir z projeksiyonu elde etmek için ImageJ şablonu eşleştirme eklentisi kullanılarak hizalandı. Görüntü kalitesine bağlı olarak, arka plan çıkarılır, görüntü düzeltilir ve parlaklık ve kontrast ayarlanır. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Malzemeler:
Kodlama Dosyası 1: 3D baskı Bloğu. Bloğun yazdırılması için 3D nesne dosyası. Bu Kodlama Dosyasını indirmek için lütfen tıklayınız.
Kodlama Dosyası 2: 3D baskı-Kafatası halkası. Kafatası halkasının basımı için 3D nesne dosyası. Bu Kodlama Dosyasını indirmek için lütfen tıklayınız.
Kodlama Dosyası 3: 3D baskı desteği. Desteğin yazdırılması için 3D nesne dosyası. Bu Kodlama Dosyasını indirmek için lütfen tıklayınız.
Kodlama Dosyası 4: 3D baskı Vidalı halka. Vidanın basımı için 3D nesne dosyası. Bu Kodlama Dosyasını indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trombosit oluşum mekanizmaları kemik iliği ortamına oldukça bağlıdır. Bu nedenle intravital mikroskopi, süreci gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için sahada önemli bir araç haline gelmiştir. Floresan megakaryositli fareler, Cre rekombinazını megakaryositlerde ifade eden fareleri koşullu floresan gen ifade kaseti içeren herhangi bir floxed muhabir fare ile geçerek elde edilebilir. Burada, mTmG muhabir fareleri kullanıldı (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) Pf4-cre fareler11ile geçti , megakaryositlerde ve trombositlerde yoğun yeşil floresan etiketlemesine izin verdi12. Lökositlerde Pf4-cre fareler ile monositler / makrofajlar ve fibroblastlar12,13dahil olmak üzere bazı sızıntıların bildirildiğini belirtmek önemlidir.
Bununla birlikte, megakaryositler büyük boyutları ve çekirdekleri ile kolayca tanınır. Sahada yeni deney yapanlar [mTmG; Pf4-cre] megakaryosit spesifik etiketlemeden sonra elde edilen farelerle. Bu, trombosit spesifik protein GPIX (CD42a)3,14'ekarşı yönlendirilen Alexa-flor etiketli bir antikorun intravenöz olarak verilmesiyle mümkündür. Bu ikinci yaklaşım, floresan muhabir farelerle sıkıcı ve zaman alıcı fare geçişleri gerçekleştirmeden genetik olarak tasarlanmış herhangi bir fareden floresan megakaryositleri görüntülemek için de faydalıdır. Burada, 5-7 haftalık fareler, yaşlı farelere kıyasla daha yarı saydam ve görüntülemeyi kolaylaştıran daha ince bir kemikle daha genç fareler olarak kullanıldı. Bununla birlikte, çok genç olan fareler, kranial halkanın montajında sızıntı olmadan zorluklar ortaya çıkabilir.
Bu çalışmada intravital görüntüleme, sayısal diyaframı 0,95(Malzeme Tablosu)olan 25x su hedefi ile donatılmış bir Leica mikroskobu kullanılarak gerçeklenmiştir. Amaç konik olmalıdır, böylece kranial halkanın oluşturduğu bardağa optimum çalışma mesafesiyle girebilir. Görüntüler rezonans tarayıcı (12 veya 8 kHz) ile kaydedildi. Genel ayarlar yanıtlanacak bilimsel sorunun türüne bağlı olacaktır ve gereken büyütme, çözünürlük ve alım hızına bağlı olarak optimize edilmelidir. Örneğin, 12 kHz rezonans tarayıcı ile trombosit hızını ölçmek için 25x'lik bir hedef daha uygun olurken, 8 kHz tarayıcı ve daha düşük bir büyütme proplatelet uzamasını kaydetmek için yeterli olabilir.
Protokolün en kritik adımı, halkanın kafatası kemiğine doğru şekilde bağlanmasıdır, böylece sızıntı olmaz ve kayıt sırasında kopmaz. Bunun için, halkayı uygulamadan hemen önce kafatası kemiğinin kuru olması önemlidir. Halka yapıştırıldıktan sonra, kemiği hızla yeniden nemlendir. Ayrıca, başın halka üzerindeki ağırlığının uyguladığı kuvvet nedeniyle, halka kayıt sırasında kısmen kopmasına neden olabilecek bir gerilime maruz kalır. Bu, sızıntıya ve dolayısıyla kemiğin kuruluğuna neden olabilir ve hem düşük kaliteli görüntülere hem de istenmeyen enflamatuar reaksiyonlara yol açabilir. Bu sorun, başı desteklemek için farenin burnunun altına katlanmış bir kompres ekleyerek kolayca önlenebilir (Şekil 3C). Bir diğer kritik nokta, bulanık görüntülere yol açabileceğinden kanamayı ve halkanın içindeki kan varlığını en aza indirmektir. Kusurlu hemostaz sunan ve kanamaya eğilimli fareleri incelerken bu akılda tutulmalıdır. Dektran gibi bazı izleyiciler, konsantre bir formda enjekte edilirse kemik iliği boşluğunda sızıntı gösterebilir, bu da megakaryositlerin yeşil floresanını olmasa da damar görüntülemesini kötüleştirebilir. Qtracker-655 çok fazla sızdırmaz, ancak 30 dakika içinde dolaşımdan temizlenir, böylece izleyicileri daha uzun süreler boyunca görselleştirmek için yeni izleyiciler enjeksiyonları gerekir.
Burada açıklanan bu yöntemin bir sınırlaması, anestezikleri yeniden enjekte etmek için her 35 dakikada bir alımı durdurma zorunluluğudur. Anestezi makinesi mevcutsa bu sınırlama aşılabilir. Bu durumda, kateterin yerleştirilmesini ve küçük ameliyatı gerçekleştirmenin en kolay yolu olan ketamin ve ksilazin karışımının i.p. enjeksiyonu ile anestezi benzer şekilde indüklenebilir. Mikroskop hedefinin altına konumlandıktan sonra, anestezi daha sonra gazların solunmasıyla (oksijen karışımı, izofluran ve ortam havası gibi anestezikler) korunur. Bu şekilde, gözlemler birkaç saat boyunca kesintisiz olarak yapılabilir. Ancak etik nedenlerle bu çalışmada gözlemler 3 saat ile sınırlandırıldı. Ketamin/ksilazin karışımının kullanılmasındaki bir diğer sınırlama, alternatif anestezi şemaları gerektirebilecek trombosit fonksiyonları16 üzerindeki potansiyel zararlı etkisi olabilir.
Genel olarak, bu köklü protokolün temel değeri, sadece minimal cerrahi ile noninvaziv yönüdür. Uzun kemiklerde zaman atlamalı intravital görüntüleme yapmak için başka protokoller geliştirilmiştir. Bunlar ya kas dokusu çıkarılması ve kemik aşınması gerektiren invaziv cerrahiye dayanır17,18, uyluk kafasına yakın implante endoskopik problar19,20, veya uyluk kemiğine bir pencere odasıtakmak 21. Tüm bu işlemler büyük travma ve çeşitli derecelerde iltihaplanma ile sonuçlanır. İnflamasyon sadece fareye zarar vermekle kalmaz, aynı zamanda trombosit oluşumu6 sürecini değiştirdiği bildirilmiştir, böylece kontrolsüz enflamatuar durumlar verilerin tutarsızlaşmasına ve yanlış yorumlanmasına neden olabilir. Bu nedenle bu prosedür enflamatuar reaksiyonları önlemek için seçildi. Bununla birlikte, bilimsel soruya bağlı olarak, deneyciler daha derin bir gözlem alanına ve daha yüksek çözünürlüğe (daha az saçılma) sahip olmayı tercih edebilir, bu da düşük derecede enflamatuar reaksiyon pahasına kafatası inceltme tabanlı bir yaklaşım kullanarak mümkündür.
Noninvaziv doğası nedeniyle, bu yöntemin ana sınırlaması ulaşılabilen maksimum derinliktir. Kemiğin yoğunluğu ve saçılma özellikleri nedeniyle, bölgeleri sadece birkaç yüz mikrometre derinlikte görüntüleyerek tüm kalvarial iliğin gözlemlenmesine engel olmak mümkündür. Daha da yüksek kızılötesi ekscitasyon dalga boylarına dayanan üç fotonlu mikroskopinin geliştirilmesi, üstün derin doku çözünürlüğü ile umut verici bir yaklaşım gibi görünmektedir. Kemik22 , 23, kemiği inceltmek veya cerrahi bir pencere yerleştirmek zorunda kalmadan uzun kemikler içinde kemik iliğini görüntünün heyecan verici olasılığını açmak için beynin derinliklerine bile görüntü vermek için zaten başarıyla kullanılmıştır.
Özetle, bu yöntem kemik iliğindeki megakaryositlerin davranışını incelemek ve proplateletlerin uzantısını görselleştirmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Ayrıca dış kalvarial kompakt kemiğin yanı sıra alttaki iliğin bir kısmının görselleştirilmesine olanak sağlayarak trombosit alanı dışındaki birçok uygulamada bu yöntem zaten kullanılmıştır. Osteoblastlar ve osteoklastlar, lökosit kaçakçılığı ve ilik çıkışı, endotel hücreleri ve mikrovaskülür mimarisi, ilik mikrovesküllerinde kan akışı dinamikleri veya hücre homing24dahil olmak üzere çevrelerindeki hem kemik hem de ilik hücre dinamiklerinin incelenmesi için kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, laboratuvarda tekniği kurduğumuz dönemde iki fotonlu mikroskopi deneyleri konusundaki uzman tavsiyeleri için Florian Gaertner'e (Avusturya Bilim ve Teknoloji Enstitüsü), IGBMC /CBI Görüntüleme Merkezi'ndeki (Illkirch, Fransa) Yves Lutz'a ise uzmanlığı ve iki foton mikroskobu konusundaki yardımı için teşekkür ediyor. Ayrıca jean-Yves Rinkel'e teknik yardımı için ve Ines Guinard'a şekil 1'deki şemanın çizimi için teşekkür ederiz. ARMESA'ya (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) iki foton mikroskobun satın alınmasındaki desteği için teşekkür ederiz. AB, Etablissement Français du Sang (APR2016) ve Agence Nationale de la Recherche'den (ANR-18-CE14-0037-01) doktora sonrası burslarla desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter - Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
References
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
- Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
- Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
- Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
- Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).
- Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
- Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
- Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).
- Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).
