Reconstrueer humaan retinoblastoom in vitro

Summary

We beschrijven een methode voor het genereren van humaan retinoblastoom (RB) door biallelische RB1-mutaties in menselijke embryonale stamcellen (hESC) te introduceren. RB-cellijnen kunnen ook met succes worden gekweekt met behulp van de geïsoleerde RB in een schaal.

Abstract

Menselijke RB is kinderkanker, die dodelijk is als er geen behandeling wordt toegediend. Aangezien RB afkomstig is van kegelvoorlopers, wat relatief zeldzaam is in knaagdiermodellen, is een ziektemodel dat is afgeleid van mensen en knaagdieren, wat betreft de interspecies-verschillen tussen mensen, gunstiger voor het blootleggen van de mechanismen van menselijke RB en het zoeken naar de doelen van therapie. Hierin beschrijft het protocol de generatie van twee gen-bewerkte hESC-lijnen met respectievelijk een biallelische RB1-puntmutatie (RB1^Mut/Mut) en een RB1 knock-outmutatie (RB1^-/-). Tijdens het proces van retinale ontwikkeling wordt de vorming van RB waargenomen. De RB-cellijnen worden ook vastgesteld door te scheiden van de RB-organoïden. Al met al, door de gen-bewerkte hESC-lijnen te differentiëren in de retinale organoïden met behulp van een 2D- en 3D-gecombineerd differentiatieprotocol, hebben we met succes de menselijke RB in een schotel gereconstrueerd en de oorsprong van de kegelvoorloper geïdentificeerd. Het zou een nuttig ziektemodel bieden voor het observeren van de genese, proliferatie en groei van retinoblastoom, evenals het verder ontwikkelen van nieuwe therapeutische middelen.

Introduction

Humaan retinoblastoom (RB) is een zeldzame, fatale tumor afgeleid van de retinale kegel-precursoren ^1,2,3, is het meest voorkomende type intraoculaire maligniteit in de kindertijd⁴. Homozygote inactivatie van het RB1-gen is de initiërende genetische laesie in RB⁵. Muizen met RB1-mutaties slagen er echter niet in om de retinale tumor te vormen². Hoewel de muistumoren kunnen worden gegenereerd met de combinatie van Rb1-mutaties en andere genetische modificaties, missen ze nog steeds de kenmerken van menselijke RB⁶. Dankzij de ontwikkeling van retinale organoïde differentiatie kon de hESC-afgeleide RB worden verkregen, met de karakters van menselijke RB¹.

Talrijke protocollen voor retinale organoïde differentiatie zijn in het afgelopen decennium vastgesteld, waaronder 2D⁷, 3D⁸ en een combinatie van 2D en 3D⁹. De methode die hier wordt gebruikt om de menselijke RB te genereren, is de consolidatie van de aanhankelijke cultuur en de zwevende cultuur⁹. Door de RB1 gemuteerde hESC te differentiëren in retinale organoïden, wordt de vorming van RB gedetecteerd rond dag 45 en vervolgens prolifereert het snel rond dag 60. Op dag 90 is isolatie van KB’s en generatie van de RB-cellijn mogelijk; bovendien omringt RB bijna alle retinale organoïden op dag 120.

hESC-afgeleide RB is een innovatief model voor het onderzoeken van de oorsprong, tumorigenese en behandelingen voor RB. In dit protocol worden de generatie van genbewerking hESC, de differentiatie van RB en karakterisering voor RB in detail beschreven.

Protocol

Deze studie is goedgekeurd door de institutionele ethische commissie van het Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESCs worden verkregen van het WiCell Research Institute. 1. Generatie van RB1 gemuteerde hESC CRISPR/Cas9 richt vector voor de knock-out (KO) van RB1. Ontwerp een paar sgRNA. Richt u voor de ablatie van RB1 op het eerste exon van dit gen. De voorwaartse primersequentie is CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG en de omgekeerde …

Representative Results

De procedure van RB-generatie wordt toegelicht in figuur 1, die de aanhankelijke en zwevende cultuur combineert. Het was mogelijk om de menselijke RB uit RB1-KO hESC te oogsten en de RB-cellijn te verkrijgen door de RB-organoïden te isoleren. Hier geeft het protocol de details van de differentiatie in verschillende fasen (figuur 2). Holle bollen worden gevormd in de eerste 3 dagen die zich hechten aan het kweekoppervlak en v…

Discussion

Humaan retinoblastoom (RB) wordt veroorzaakt door de inactivatie van RB1 en de disfunctie van Rb-eiwit. In dit protocol is de RB1-KO hESC de cruciale stap voor het genereren van RB in een gerecht. Terwijl het zelfs met RB1^-/- hESC mogelijk is dat er geen RB-vorming is als gevolg van de methoden van retinale organoïde differentiatie¹⁰. In dit protocol is de overgang van hechte cultuur naar zwevende cultuur essentieel in het proces van differentiatie. De dichth…

Materials

2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Antibody
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Antibody
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Antibody
Anti-Syk (D3Z1E)	Cell Signaling Technology	13198	Antibody
BbsI	NEB	R3539S	Restriction enzymes
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep	Gibco	15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix	BD	356231	Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplement A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML