Reconstruir o retinoblastoma humano in vitro

Summary

Descrevemos um método para gerar retinoblastoma humano (RB) através da introdução de mutações RB1 bialélicas em células-tronco embrionárias humanas (hESC). As linhagens celulares de RB também podem ser cultivadas com sucesso usando o RB isolado em um prato.

Abstract

RB humano é câncer pediátrico, que é letal se nenhum tratamento for administrado. Como o RB se origina de precursores de cones, o que é relativamente raro em modelos de roedores, enquanto isso, em relação às diferenças entre espécies entre humanos e roedores, um modelo de doença derivado de humanos é mais benéfico para descobrir os mecanismos do RB humano e buscar os alvos da terapia. Aqui, o protocolo descreve a geração de duas linhagens hESC editadas por genes com uma mutação de ponto RB1 bialélica (RB1 Mut/^Mut) e uma mutação knockout RB1 (RB1–^/-), respectivamente. Durante o processo de desenvolvimento da retina, observa-se a formação de RB. As linhagens celulares RB também são estabelecidas pela segregação dos organoides RB. No total, ao diferenciar as linhas hESC editadas por genes nos organoides da retina usando um protocolo de diferenciação combinada 2D e 3D, reconstruímos com sucesso o RB humano em um prato e identificamos sua origem precursora de cone. Ele forneceria um modelo de doença útil para observar a gênese, proliferação e crescimento do retinoblastoma, bem como desenvolver novos agentes terapêuticos.

Introduction

O retinoblastoma humano (RB) é um tumor raro e fatal, derivado dos precursores do cone da ^retina1,2,3, sendo o tipo mais comum de malignidade intraocular na infância⁴. A inativação homozigótica do gene RB1 é a lesão genética inicial na RB⁵. No entanto, camundongos com mutações RB1 não conseguem formar o tumor da retina². Embora os tumores de camundongos possam ser gerados com a combinação de mutações Rb1 e outras modificações genéticas, eles ainda não possuem as características do RB⁶ humano. Graças ao desenvolvimento da diferenciação organoide da retina, o RB derivado do hESC pôde ser obtido, exibindo os caracteres do RB¹ humano.

Numerosos protocolos para diferenciação organoide da retina foram estabelecidos na última década, incluindo 2D⁷, 3D⁸ e uma combinação de 2D e 3D⁹. O método aqui utilizado para gerar a RB humana é a consolidação da cultura aderente e da cultura flutuante⁹. Ao diferenciar o hESC mutado RB1 em organoides da retina, a formação de RB é detectada por volta do dia 45 e, em seguida, prolifera rapidamente por volta do dia 60. No dia 90, é possível o isolamento dos RBs e a geração da linhagem celular RB; além disso, a RB envolve quase todos os organoides da retina no dia 120.

A RB derivada de hESC é um modelo inovador para explorar a origem, tumorigênese e tratamentos para RB. Neste protocolo, a geração de hESC de edição de genes, a diferenciação de RB e a caracterização para RB são descritas em detalhes.

Protocol

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional do Hospital Tongren de Pequim, Capital Medical University. Os hESCs H9 são obtidos do WiCell Research Institute. 1. Geração de hESC mutado RB1 Vetor de direcionamento CRISPR/Cas9 para o nocaute (KO) do RB1. Projete um par de sgRNA. Para a ablação de RB1, vise o primeiro éxon deste gene. A sequência do primer para a frente é CACCGCGGGGCGGCCTTTTCGG, e a sequência do primer revers…

Representative Results

O procedimento de geração de RB é elucidado na Figura 1, que combina a cultura aderente e flutuante. Foi possível colher o RB humano do RB1-KO hESC e obter a linhagem celular RB isolando os organoides RB. Aqui, o protocolo fornece os detalhes da diferenciação em diferentes estágios (Figura 2). Esferas ocas são formadas nos primeiros 3 dias que se ligam à superfície da cultura e depois se expandem (<strong class="xfi…

Discussion

O retinoblastoma humano (RB) é causado pela inativação do RB1 e pela disfunção da proteína Rb. Neste protocolo, o RB1-KO hESC é o passo fundamental para a geração de RB em um prato. Mesmo com RB1–^/- hESC, é possível que não haja formação de RB devido aos métodos de diferenciação organoide da retina¹⁰. Neste protocolo, a transferência da cultura aderente para a cultura flutuante é essencial no processo de diferenciação. A densidade dos cist…

Materials

2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Antibody
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Antibody
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Antibody
Anti-Syk (D3Z1E)	Cell Signaling Technology	13198	Antibody
BbsI	NEB	R3539S	Restriction enzymes
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep	Gibco	15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix	BD	356231	Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplement A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML