שחזור רטינובלסטומה אנושית במבחנה
Summary
אנו מתארים שיטה ליצירת רטינובלסטומה אנושית (RB) על ידי החדרת מוטציות RB1 ביאליליות בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC). קווי תאי RB יכולים גם להיות בתרבית בהצלחה באמצעות RB מבודד בצלחת.
Abstract
RB אנושי הוא סרטן ילדים, שהוא קטלני אם לא ניתן טיפול. מכיוון שמקורו של RB במבשרי חרוטים, דבר נדיר יחסית במודלים של מכרסמים, בינתיים לגבי ההבדלים הבין-מיניים בין בני אדם למכרסמים, מודל מחלה שמקורו בבני אדם מועיל יותר לחשיפת המנגנונים של RB אנושי ולחיפוש אחר מטרות הטיפול. כאן, הפרוטוקול מתאר יצירת שני קווי hESC שעברו עריכה גנטית עם מוטציה דו-אלילית של נקודת RB1 (RB1 Mut/Mut) ומוטציית נוקאאוט RB1 (RB1–/-), בהתאמה. במהלך תהליך התפתחות הרשתית, היווצרות של RB הוא ציין. קווי תאי RB נקבעים גם על ידי הפרדה מהאורגנואידים של RB. בסך הכל, על ידי הבחנה בין קווי hESC שעברו עריכה גנטית לאורגנואידים ברשתית באמצעות פרוטוקול התמיינות משולב דו-ממדי ותלת-ממדי, הצלחנו לשחזר את ה-RB האנושי בצלחת ולזהות את מקורו החרוט המבשר. הוא יספק מודל מחלה מועיל להתבוננות בראשית הרטינובלסטומה, התפשטותה וצמיחתה, כמו גם פיתוח נוסף של חומרים טיפוליים חדשניים.
Introduction
רטינובלסטומה אנושית (RB) היא גידול נדיר וקטלני שמקורו במבשרי חרוט הרשתית 1,2,3, הוא הסוג הנפוץ ביותר של ממאירות תוך עינית בילדות 4. השתקה הומוזיגוטית של הגן RB1 היא הנגע הגנטי היוזם ב- RB5. עם זאת, עכברים עם מוטציות RB1 לא מצליחים ליצור את הגידול ברשתית2. למרות שגידולי העכברים יכולים להיווצר עם שילוב של מוטציות Rb1 ושינויים גנטיים אחרים, הם עדיין חסרים את התכונות של RB6 אנושי. הודות לפיתוח של התמיינות אורגנואידית ברשתית, ניתן היה להשיג את ה- RB שמקורו ב- hESC, המציג את הדמויות של RB1 אנושי.
פרוטוקולים רבים להבחנה אורגנואידית ברשתית נקבעו בעשור האחרון, כולל 2D7, 3D8, ושילוב של 2D ו- 3D9. השיטה המשמשת כאן ליצירת RB האנושי היא איחוד של תרבות דבק ותרבות צפה9. על ידי הבחנה בין ה-hESC שעבר מוטציה ב-RB1 לאורגנואידים ברשתית, היווצרות ה-RB מתגלה בסביבות היום ה-45, ואז היא מתפשטת במהירות בסביבות היום ה-60. ביום 90, בידוד של RBs, ויצירת קו התאים RB אפשרי; יתר על כן, RB מקיף כמעט את כל האורגנואידים ברשתית ביום 120.
RB שמקורו ב-hESC הוא מודל חדשני לחקר המקור, הגידול והטיפולים ב-RB. בפרוטוקול זה, הדור של עריכת גנים hESC, ההבחנה של RB, ואפיון עבור RB מתוארים בפירוט.
Protocol
Representative Results
Discussion
רטינובלסטומה אנושית (RB) נגרמת על ידי השבתה של RB1 ותפקוד לקוי של חלבון Rb. בפרוטוקול זה, RB1-KO hESC הוא השלב המרכזי ליצירת RB בצלחת. בעוד שאפילו עם RB1–/- hESC, ייתכן שאין היווצרות RB עקב השיטות של הבחנה אורגנואידית ברשתית10. בפרוטוקול זה, המעבר מתרבות דבק לתרבות צפה הוא חי…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לצוות 502 על כל העזרה. עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי הקרן העירונית למדעי הטבע של בייג’ינג (Z200014) ותוכנית המו”פ הלאומית של סין (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
Riferimenti
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
- Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
- Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E. The biology of retinoblastoma. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 503-516 (2015).
- Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
- Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
- Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Biologia dello sviluppo. 462 (2), 197-207 (2020).
- Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
- Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
- Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).
