Rekonstruktion des humanen Retinoblastoms in vitro

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von humanem Retinoblastom (RB) durch Einführung biallelischer RB1-Mutationen in humane embryonale Stammzellen (hESC). RB-Zelllinien konnten auch erfolgreich mit dem isolierten RB in einer Schale kultiviert werden.

Abstract

Humane RB ist pädiatrischer Krebs, der tödlich ist, wenn keine Behandlung verabreicht wird. Da RB aus Zapfenvorläufern stammt, was in Nagetiermodellen relativ selten ist, ist ein vom Menschen und Nagetieren abgeleitetes Krankheitsmodell vorteilhafter, um die Mechanismen der menschlichen RB aufzudecken und die Ziele der Therapie zu suchen. Hierin beschreibt das Protokoll die Erzeugung von zwei geneditierten hESC-Linien mit einer biallelischen RB1-Punktmutation (RB1 Mut/Mut) bzw. einer RB1-Knockout-Mutation (RB1–^/-). Während des Prozesses der Netzhautentwicklung wird die Bildung von RB beobachtet. Die RB-Zelllinien werden auch durch Trennung von den RB-Organoiden etabliert. Insgesamt haben wir durch die Differenzierung der geneditierten hESC-Linien in die retinalen Organoide unter Verwendung eines kombinierten 2D- und 3D-Differenzierungsprotokolls die menschliche RB in einer Schale erfolgreich rekonstruiert und ihren Ursprung als Zapfenvorläufer identifiziert. Es würde ein hilfreiches Krankheitsmodell für die Beobachtung der Genese, Proliferation und des Wachstums des Retinoblastoms sowie für die Weiterentwicklung neuartiger therapeutischer Wirkstoffe liefern.

Introduction

Das humane Retinoblastom (RB) ist ein seltener, tödlicher Tumor, der von den Netzhautzapfenvorläufern ^1,2,3 abgeleitet ist und die häufigste Form der intraokularen Malignität im Kindesalter^{ist 4}. Die homozygote Inaktivierung des RB1-Gens ist die auslösende genetische Läsion in RB⁵. Mäuse mit RB1-Mutationen bilden jedoch nicht den Netzhauttumor². Obwohl die Maustumoren durch die Kombination von Rb1-Mutationen und anderen genetischen Veränderungen erzeugt werden könnten, fehlen ihnen noch die Merkmale des menschlichen RB⁶. Dank der Entwicklung der retinalen Organoiddifferenzierung konnte das hESC-abgeleitete RB erhalten werden, das die Charaktere des menschlichen RB¹ zeigt.

In den letzten zehn Jahren wurden zahlreiche Protokolle für die retinale Organoiddifferenzierung etabliert, darunter 2D⁷, 3D⁸ und eine Kombination aus 2D und 3D⁹. Die Methode, die hier verwendet wird, um die menschliche RB zu erzeugen, ist die Konsolidierung der adhärenten Kultur und der schwimmenden Kultur⁹. Durch die Differenzierung des RB1-mutierten hESC in retinale Organoide wird die Bildung von RB um den Tag 45 nachgewiesen, und dann vermehrt es sich schnell um Tag 60. Am Tag 90 ist die Isolierung von RBs und die Erzeugung der RB-Zelllinie möglich; Darüber hinaus umgibt RB fast alle retinalen Organoide am Tag 120.

Das von hESC abgeleitete RB ist ein innovatives Modell zur Erforschung des Ursprungs, der Tumorgenese und der Behandlung von RB. In diesem Protokoll werden die Erzeugung von Gen-Editing-hESC, die Differenzierung von RB und die Charakterisierung für RB detailliert beschrieben.

Protocol

Diese Studie wurde von der institutionellen Ethikkommission des Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, genehmigt. H9 hESCs werden vom WiCell Research Institute bezogen. 1. Erzeugung von RB1 mutiertem hESC CRISPR/Cas9-Zielvektor für den Knockout (KO) von RB1. Entwerfen Sie ein Paar sgRNA. Für die Ablation von RB1 zielen Sie auf das erste Exon dieses Gens ab. Die Vorwärtsprimersequenz ist CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGGGG und die umgekeh…

Representative Results

Der Ablauf der RB-Generierung wird in Abbildung 1 erläutert, die die adhärente und die schwimmende Kultur kombiniert. Es war möglich, das menschliche RB aus RB1-KO hESC zu gewinnen und die RB-Zelllinie durch Isolierung der RB-Organoide zu erhalten. Hier liefert das Protokoll die Details der Differenzierung in verschiedenen Stufen (Abbildung 2). In den ersten 3 Tagen bilden sich Hohlkugeln, die sich an der Kulturoberfläche…

Discussion

Das humane Retinoblastom (RB) wird durch die Inaktivierung von RB1 und die Dysfunktion des Rb-Proteins verursacht. In diesem Protokoll ist der RB1-KO hESC der entscheidende Schritt für die Erzeugung von RB in einer Schale. Während es auch bei RB1^-/- hESC möglich ist, dass es aufgrund der Methoden der retinalen Organoiddifferenzierung¹⁰ zu keiner RB-Bildung kommt. In diesem Protokoll ist der Übergang von der adhärenten Kultur zur schwimmenden Kultur im Pro…

Materials

2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Antibody
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Antibody
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Antibody
Anti-Syk (D3Z1E)	Cell Signaling Technology	13198	Antibody
BbsI	NEB	R3539S	Restriction enzymes
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep	Gibco	15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix	BD	356231	Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplement A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML