Ricostruire il retinoblastoma umano in vitro

Summary

Descriviamo un metodo per generare retinoblastoma umano (RB) introducendo mutazioni bialleliche RB1 nelle cellule staminali embrionali umane (hESC). Le linee cellulari RB potrebbero anche essere coltivate con successo usando l’RB isolato in un piatto.

Abstract

La RB umana è un cancro pediatrico, che è letale se non viene somministrato alcun trattamento. Poiché RB proviene da precursori dei coni, che è relativamente raro nei modelli di roditori, nel frattempo per quanto riguarda le differenze interspecie tra esseri umani e roditori, un modello di malattia derivato dagli esseri umani è più vantaggioso per scoprire i meccanismi della RB umana e cercare gli obiettivi della terapia. Qui, il protocollo descrive la generazione di due linee hESC geneticamente modificate con una mutazione puntiforme RB1 biallelica (RB1 Mut/^Mut) e una mutazione knockout RB1 (RB1–^/-), rispettivamente. Durante il processo di sviluppo della retina, si osserva la formazione di RB. Le linee cellulari RB sono anche stabilite segregando dagli organoidi RB. Complessivamente, differenziando le linee hESC geneticamente modificate negli organoidi retinici utilizzando un protocollo di differenziazione combinato 2D e 3D, abbiamo ricostruito con successo il RB umano in un piatto e identificato la sua origine cono-precursore. Fornirebbe un utile modello di malattia per osservare la genesi, la proliferazione e la crescita del retinoblastoma, nonché per sviluppare ulteriormente nuovi agenti terapeutici.

Introduction

Il retinoblastoma umano (RB) è un tumore raro e fatale derivato dai precursori dei coni retinici ^1,2,3, è il tipo più comune di neoplasia intraoculare nell’infanzia⁴. L’inattivazione omozigote del gene RB1 è la lesione genetica iniziale in RB⁵. Tuttavia, i topi con mutazioni RB1 non riescono a formare il tumore retinico². Sebbene i tumori del topo possano essere generati con la combinazione di mutazioni di Rb1 e altre modificazioni genetiche, mancano ancora delle caratteristiche di RB 6^umano. Grazie allo sviluppo della differenziazione organoide retinica, è stato possibile ottenere il RB derivato da hESC, che mostra i caratteri dell’RB umano¹.

Negli ultimi dieci anni sono stati stabiliti numerosi protocolli per la differenziazione degli organoidi retinici, tra cui 2D⁷, 3D⁸ e una combinazione di 2D e 3D⁹. Il metodo utilizzato qui per generare il RB umano è il consolidamento della cultura aderente e della cultura fluttuante⁹. Differenziando l’hESC mutato RB1 in organoidi retinici, la formazione di RB viene rilevata intorno al giorno 45, e quindi prolifera rapidamente intorno al giorno 60. Il giorno 90, è possibile l’isolamento dei RB e la generazione della linea cellulare RB; inoltre, RB circonda quasi tutti gli organoidi retinici al giorno 120.

La RB derivata da hESC è un modello innovativo per esplorare l’origine, la tumorigenesi e i trattamenti per la RB. In questo protocollo, la generazione di hESC di editing genetico, la differenziazione di RB e la caratterizzazione per RB sono descritte in dettaglio.

Protocol

Questo studio è approvato dal Comitato etico istituzionale del Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. Le H9 hESC sono ottenute dal WiCell Research Institute. 1. Generazione di hESC RB1 mutato Vettore di targeting CRISPR/Cas9 per il knockout (KO) di RB1. Progetta una coppia di sgRNA. Per l’ablazione di RB1, colpire il primo esone di questo gene. La sequenza di primer in avanti è CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, e la sequenza di primer in…

Representative Results

La procedura di generazione di RB è spiegata nella Figura 1, che combina la coltura aderente e fluttuante. È stato possibile raccogliere il RB umano da RB1-KO hESC e ottenere la linea cellulare RB isolando gli organoidi RB. Qui, il protocollo fornisce i dettagli della differenziazione in diverse fasi (Figura 2). Nei primi 3 giorni si formano sfere cave che si attaccano alla superficie della coltura e poi si espandono (<stro…

Discussion

Il retinoblastoma umano (RB) è causato dall’inattivazione di RB1 e dalla disfunzione della proteina Rb. In questo protocollo, l’hESC RB1-KO è il passo fondamentale per la generazione di RB in un piatto. Mentre anche con RB1–^/- hESC, è possibile che non vi sia formazione di RB a causa dei metodi di differenziazione organoide retinica¹⁰. In questo protocollo, il trasferimento dalla coltura aderente alla coltura galleggiante è essenziale nel processo di diffe…

Materials

2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Antibody
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Antibody
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Antibody
Anti-Syk (D3Z1E)	Cell Signaling Technology	13198	Antibody
BbsI	NEB	R3539S	Restriction enzymes
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep	Gibco	15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix	BD	356231	Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplement A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML