Reconstruire le rétinoblastome humain in vitro

Summary

Nous décrivons une méthode de génération de rétinoblastome humain (RB) en introduisant des mutations bialléliques RB1 dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Les lignées cellulaires RB pourraient également être cultivées avec succès en utilisant le RB isolé dans une boîte.

Abstract

La RB humaine est un cancer pédiatrique, qui est mortel si aucun traitement n’est administré. Comme la RB provient de précurseurs de cônes, ce qui est relativement rare dans les modèles de rongeurs, en ce qui concerne les différences inter-espèces entre les humains et les rongeurs, un modèle de maladie dérivé de l’homme est plus bénéfique pour découvrir les mécanismes de la RB humaine et rechercher les cibles thérapeutiques. Ici, le protocole décrit la génération de deux lignées de CSEh génétiquement modifiées avec une mutation ponctuelle RB1 biallélique (RB1 Mut/^Mut) et une mutation knockout RB1 (RB1–^/-), respectivement. Au cours du processus de développement rétinien, la formation de RB est observée. Les lignées cellulaires RB sont également établies en se séparant des organoïdes RB. Au total, en différenciant les lignées de CSEh génétiquement modifiées en organoïdes rétiniens à l’aide d’un protocole de différenciation combinée 2D et 3D, nous avons réussi à reconstruire la RB humaine dans une boîte et à identifier son origine conique-précurseur. Il fournirait un modèle de maladie utile pour observer la genèse, la prolifération et la croissance du rétinoblastome, ainsi que pour développer de nouveaux agents thérapeutiques.

Introduction

Le rétinoblastome humain (RB) est une tumeur rare et mortelle dérivée des précurseurs du cône rétinien ^1,2,3, est le type le plus courant de malignité intraoculaire dans l’enfance⁴. L’inactivation homozygote du gène RB1 est la lésion génétique initiatrice de RB⁵. Cependant, les souris porteuses de mutations RB1 ne parviennent pas à former la tumeur rétinienne². Bien que les tumeurs de souris puissent être générées avec la combinaison de mutations Rb1 et d’autres modifications génétiques, elles n’ont toujours pas les caractéristiques de RB⁶ humain. Grâce au développement de la différenciation organoïde rétinienne, le RB dérivé de l’hESC a pu être obtenu, affichant les caractères de RB¹ humain.

De nombreux protocoles de différenciation organoïde rétinienne ont été établis au cours de la dernière décennie, notamment 2D⁷, 3D⁸ et une combinaison de 2D et 3D⁹. La méthode utilisée ici pour générer le RB humain est la consolidation de la culture adhérente et de la culture flottante⁹. En différenciant les CSEh mutés RB1 en organoïdes rétiniens, la formation de RB est détectée vers le jour 45, puis elle prolifère rapidement vers le jour 60. Au jour 90, l’isolement des RB et la génération de la lignée cellulaire RB sont possibles; de plus, la RB entoure presque tous les organoïdes rétiniens au jour 120.

La RB dérivée de la CSEh est un modèle innovant pour explorer l’origine, la tumorigenèse et les traitements de la RB. Dans ce protocole, la génération de CSEh d’édition de gènes, la différenciation de RB et la caractérisation de RB sont décrites en détail.

Protocol

Cette étude est approuvée par le Comité d’éthique institutionnel de l’hôpital Tongren de Pékin, Capital Medical University. Les CSEh H9 sont obtenues auprès de l’Institut de recherche WiCell. 1. Génération de CSEh avec mutation RB1 Vecteur de ciblage CRISPR/Cas9 pour le KO (KO) de RB1. Concevez une paire d’ARNg. Pour l’ablation de RB1, cibler le premier exon de ce gène. La séquence d’amorce avant est CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTTT…

Representative Results

La procédure de génération RB est élucidée dans la figure 1, qui combine la culture adhérente et flottante. Il a été possible de récolter la RB humaine à partir de RB1-KO hESC et d’obtenir la lignée cellulaire RB en isolant les organoïdes RB. Ici, le protocole fournit les détails de la différenciation en différentes étapes (Figure 2). Des sphères creuses se forment au cours des 3 premiers jours qui s’atta…

Discussion

Le rétinoblastome humain (RB) est causé par l’inactivation de RB1 et le dysfonctionnement de la protéine Rb. Dans ce protocole, le RB1-KO hESC est l’étape cruciale pour la génération de RB dans une boîte. Alors que même avec RB1–^/- hESC, il est possible qu’il n’y ait pas de formation de RB en raison des méthodes de différenciation organoïde rétinienne¹⁰. Dans ce protocole, le passage de la culture adhérente à la culture flottante est esse…

Materials

2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Antibody
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Antibody
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Antibody
Anti-Syk (D3Z1E)	Cell Signaling Technology	13198	Antibody
BbsI	NEB	R3539S	Restriction enzymes
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep	Gibco	15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix	BD	356231	Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplement A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML