Summary
Apesar dos avanços na imunohistoquímica multiplex e na imagem multiespectral, caracterizar a densidade e o agrupamento das principais células imunes simultaneamente no endométrio continua sendo um desafio. Este artigo descreve um protocolo detalhado de coloração multiplex e imagens para a localização simultânea de quatro tipos de células imunes no endométrio.
Abstract
A imunohistoquímica é o método mais utilizado para identificação e visualização de antígenos teciduais em pesquisas biológicas e diagnósticos clínicos. Pode ser usado para caracterizar vários processos biológicos ou patologias, como cicatrização de feridas, resposta imune, rejeição tecidual e interações tecido-biomateriais. No entanto, a visualização e quantificação de múltiplos antígenos (especialmente para células imunes) em uma única seção tecidual usando a coloração imunohistoquímica convencional (IHC) permanece insatisfatória. Assim, tecnologias multiplexadas foram introduzidas nos últimos anos para identificar múltiplos marcadores biológicos em uma única amostra de tecido ou um conjunto de diferentes amostras de tecido.
Essas tecnologias podem ser especialmente úteis para diferenciar as mudanças nas interações célula-imune dentro do endométrio entre mulheres férteis e mulheres com abortos recorrentes durante a implantação. Este artigo descreve um protocolo detalhado para coloração de fluorescência multiplexada do IHC para investigar a densidade e o agrupamento de quatro tipos principais de células imunes simultaneamente em amostras endometrial precisamente cronometradas durante a implantação de embriões. O método inclui preparação amostral, otimização multiplex com marcadores para subtipos de células imunes e a varredura dos slides, seguido pela análise de dados, com referência específica à detecção de células imunes endometrial.
Usando este método, a densidade e o agrupamento de quatro tipos principais de células imunes no endométrio podem ser analisados simultaneamente em uma única seção tecidual. Além disso, este artigo discutirá os fatores críticos e a solução de problemas para superar possíveis interferências fluorforais entre as sondas fluorescentes que estão sendo aplicadas. É importante ressaltar que os resultados desta técnica de coloração multiplex podem ajudar a fornecer uma compreensão aprofundada da interação e regulação imunológica durante a implantação de embriões.
Introduction
Aborto recorrente (RM) pode ser definido como a perda de duas ou mais gestações antes das 24 semanas de gestação1. Esta condição reprodutiva frequente afeta até 1% dos casais em todo o mundo2,3. A fisiopatologia é multifatorial e pode ser dividida em causas embriológicas (principalmente devido a um karyótipo embrionário anormal) e causas maternamente orientadas que afetam o desenvolvimento endométrio e/ou placentário. Essa manifestação pode resultar de anormalidades genéticas parentais, anomalias uterinas, condições protombolíticas, fatores de endocrinologia e distúrbios imunológicos4.
Nos últimos anos, a disfunção celular com efeito imunológico tem sido implicada na patogênese da perda precoce da gravidez5. Isso inspirou muitas investigações sobre a elucidação das populações específicas de células imunes no endométrio durante o ciclo menstrual, implantação e gravidez precoce, com papéis específicos no início da gravidez. Entre essas células imunes, as células assassinas naturais uterinas (uNK) desempenham um papel crítico durante a implantação e gravidez de embriões, particularmente nos processos de invasão trofoblástica e angiogênese6. Estudos têm mostrado um aumento da densidade celular uNK no endométrio de mulheres com RM7,8, embora este achado não tenha sido associado a um risco aumentado de aborto9. No entanto, isso estimulou pesquisas avaliando a densidade de outros tipos de células imunes (como macrófagos, células dendríticas uterinas) no endométrio em mulheres com RM10,11. No entanto, permanece incerto se há uma alteração significativa na densidade das células imunes no endométrio de peri-implantação em mulheres com RM.
Uma possível explicação para a incerteza é que a avaliação da densidade das células imunes endometrial pode ser difícil devido às rápidas mudanças no endométrio durante a janela de implantação. Durante o período de 24 horas, mudanças significativas no endométrio alteram a densidade das células imunes e a secreção de citocinas, introduzindo uma fonte de variação nesses resultados12. Além disso, a maioria dos relatórios depende principalmente do uso de coloração unicelular (por exemplo, métodos tradicionais de IHC) que não puderam examinar vários marcadores na mesma seção tecidual. Embora a citometria de fluxo possa ser usada para detectar múltiplas populações celulares em uma única amostra, as grandes quantidades de células necessárias e a otimização demorada dificultam a popularidade e eficiência deste método. Assim, o recente avanço na coloração multiplex IHC poderia resolver esse problema imunossumando múltiplos marcadores no mesmo slide para avaliar vários parâmetros, incluindo linhagem celular e localização histológica de subpopulações imunomunes individuais. Além disso, essa tecnologia pode maximizar as informações obtidas em caso de disponibilidade limitada de tecidos. Em última análise, essa técnica pode ajudar a elucidar as diferenças nas interações de células imunes no endométrio entre mulheres férteis e mulheres com RM.
Dois grupos de mulheres foram recrutados do Hospital Prince of Wales, incluindo mulheres de controle fértil (FC) e mulheres com aborto recorrente inexplicável (RM). O controle fértil foi definido como mulheres que tiveram pelo menos um parto vivo sem histórico de aborto espontâneo, e as mulheres RM foram definidas como aquelas que tiveram um histórico de abortos consecutivos ≥2 antes das 20 semanas de gestação. Os sujeitos dos dois grupos atenderam aos seguintes critérios de inclusão: (a) idade entre 20 e 42 anos, (b) não fumante, (c) ciclo menstrual regular (25-35 dias) e estrutura uterina normal, (d) não utilização de qualquer regime hormonal por pelo menos 3 meses antes da biópsia endometrial, (e) no hidrosalpinx por hytero-salpingograma. Além disso, todos os sujeitos recrutados tinham kariotipagem normal, ultrassonografia 3-dimensional normal histerosalpingograma, hormônio estimulante do folículo dia 2 < 10 UI/L, progesterona mid-luteal > 30 nmol/L, função tireoide normal, e testado negativo para lúpus anticoagulante e anticardolipina IgG e IgMbodies.
Para entender melhor a base imunológica da RM, seria mais desejável quantificar e localizar simultaneamente os principais tipos de células imunes presentes no endométrio no momento da implantação. Este artigo descreve todo o protocolo desde a preparação da amostra, a otimização multiplex com marcadores para subtipos de células imunes e a varredura dos slides, seguido pela análise de dados com referência específica à detecção de células imunes endometrial. Além disso, este artigo descreve como determinar a densidade e o agrupamento dos tipos de células imunes simultaneamente no endométrio.
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Protocol
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica da Universidade Conjunta Chinesa de Hong Kong-Novos Territórios do Leste. O consentimento informado foi obtido dos participantes antes da coleta das biópsias endometrial. Consulte a seção de introdução para critérios de inclusão dos grupos de controle e RM.
1. Preparação da amostra
- Certifique-se de que todas as mulheres deste estudo se submetam a um teste diário de vareta de urina a partir do dia 9 do ciclo menstrual em diante para identificar o surto do hormônio luteinizador (LH) para detectar a ovulação, e cronometrar as biópsias endometrial precisamente no7º dia após o surto de LH (LH+7).
- Obtenha um fragmento de0,5 cm 2 de biópsia endometrial usando um sampler Pipelle ou Pipet Curet de mulheres férteis e mulheres com RM inexplicável. Rotular o recipiente e colocar a amostra imediatamente em formalina tamponada neutra de 10% (pH 7) para fixação durante a noite à temperatura ambiente.
NOTA: O volume do fixador deve ser de 5 a 10 vezes o do tecido. - Coloque o tecido em um cartucho para desidratação em uma máquina de processamento de tecidos antes de incorporá-lo em cera de parafina derretida. Incorpore os tecidos em parafina a 58-60 °C.
- Deixe o bloco de parafina esfriar durante a noite à temperatura ambiente. Use um microtome para aparar os blocos de parafina a uma espessura de 3 μm.
NOTA: O uso de água destilada auxilia na montagem e adesão adequada do tecido ao longo da coloração multiplex. - Coloque a fita de parafina em um banho de água a 40-45 °C para 30 s.
- Monte as seções em lâminas de vidro de microscópio revestidas de poli-L (0,1% w/v). Coloque as lâminas com o tecido voltado para cima e deixe secar a 37 °C durante a noite. Armazene os slides em uma caixa de slides longe de temperaturas extremas até que use mais.
2. Determine a concentração ideal de anticorpos para multiplex IHC usando IHC convencional.
NOTA: Isso é importante para identificar o nível de expressão e o padrão de cada marcador imunológico na amostra de endométrio, e determinar a sequência de coloração de cada marcador, bem como seus pares associados de amplificação de sinal de tiraside (TSA).
- Teste os anticorpos para sua adequação para multiplex IHC usando o Manual Convencional IHC13.
- Use tecidos de endométrio para testes de anticorpos únicos.
- Inclua um controle positivo (por exemplo, baço) e controle negativo (controle de isótipo) para otimizar a condição de coloração de cada anticorpo.
- Realize a coloração utilizando a diluição recomendada pela folha de dados do anticorpo.
- Realizar coloração adicional utilizando concentrações acima e abaixo da diluição recomendada utilizada na etapa 2.3.
NOTA: Um patologista clínico deve avaliar os slides manchados cegamente para confirmar a localização da sondagem de anticorpos e integridade celular.
3. Método de coloração multiplex
- Preparação e fixação de slides
- Coloque os slides (a partir da etapa 1.6) plano com o tecido voltado para cima em um forno e asse a 60 °C por pelo menos 1h.
- Remova os slides do forno e deixe esfriar por pelo menos 20 minutos em temperatura ambiente antes de colocá-las em um rack de slides vertical.
- De cera e reidratar os slides formadolin-fixos, embutidos em parafina com 10 min alocados em cada um dos seguintes passos: xileno (2x), 100% etanol (2x), 95% de etanol (1x), 70% de etanol (2x) e água destilada (2x).
- Coloque o rack de slides em uma caixa de slides de plástico e submerse-os em soro fisiológico tris (TBS, pH 7.6).
NOTA: Os slides devem permanecer úmidos a partir desta etapa de reidratação até a montagem na etapa final. - Fixar as amostras submergindo os slides em uma caixa de slides de plástico cheia de uma mistura de formaldeído diluído em metanol (1:9) por 30 min no escuro.
- Lave os slides duas vezes em água deionizada por 2 minutos e, em seguida, proceda à recuperação de antígenos.
- Recuperação de epitope
- Coloque o rack de slides em uma caixa resistente ao calor e preencha-o com tampão de ácido cítrico (pH 6.0) para cobrir os slides.
- Coloque a caixa no micro-ondas, e aqueça os slides por 50 s a 100% de potência seguido de 20 min com 20% de potência para manter a mesma temperatura.
- Deixe os slides esfriarem por aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente.
- Enxágüe os slides na água por 2 min seguidos por TBS-Tween 20 (TBST) por 2 min.
NOTA: O TBST é composto por 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl e 0,05% Tween 20 (v/v).
- Bloqueio
- Bloqueie a atividade de peroxidase endógena no tecido, imergindo o slide em um frasco contendo solução de bloqueio de peroxidase (ver a Tabela de Materiais) por 10 minutos.
- Lave os slides com TBST por 5 minutos.
- Use uma caneta de barreira hidrofóbica para marcar um limite ao redor da seção tecidual na lâmina.
- Cubra as seções de tecido com um tampão de bloqueio (ver a Tabela de Materiais) ou albumina de soro bovino (5%, w/v), e incuba os slides em uma câmara umidificada por 15 minutos.
- Aplicação de anticorpos e sinais
- Remova os reagentes de bloqueio.
- Incubar com o anticorpo primário de interesse (por exemplo, CD3, diluição de 1:100 em diluente de anticorpos, ver Tabela 1) em uma câmara umidificada à temperatura ambiente por 30 minutos.
- Remova o anticorpo primário. Lave 3x com TBST por 5 minutos cada vez.
- Incubar com o anticorpo secundário de rabanete de polímero (HRP)(Tabela 1) por 15 minutos em uma câmara umidificada à temperatura ambiente. Lave 3x com TBST por 5 minutos cada vez.
- Aplique a solução de trabalho opal fluorophore TSA (1:100 em diluente de amplificação) e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos para permitir a conjugação de fluorforeiro à amostra de tecido em locais primários de ligação de anticorpos. Lave com TBST em triplicado por 5 minutos cada vez.
- Descascamento à base de micro-ondas
- Enxágüe com o tampão de recuperação de antígeno (solução tampão citrato, pH 6.0).
- Realize a desmontagem baseada em micro-ondas para remover o complexo hrp primário-secundário para introduzir o próximo anticorpo primário (por exemplo, CD20).
- Coloque os slides no tampão de recuperação de antígeno, microondas-los a 100% de potência para 50 s seguido de 20% de potência por 20 minutos em recipientes seguros para micro-ondas, e esfriá-los em temperatura ambiente por 15 minutos.
- Repetir passos 3.2.4 a 3.5.2 até que as amostras de tecido tenham sido sondadas com todos os anticorpos primários.
- Contra-mancha e montagem
- Após a desmontagem e resfriamento do tampão de recuperação de antígeno à base de micro-ondas, enxágue os slides em água destilada e TBST.
- Incubar com solução de 4', 6-diamidino-2-fenildole (DAPI) (1,0 μg/mL) por 5 min em uma câmara umidificada à temperatura ambiente.
- Lave 3x com TBST por 5 minutos cada vez. Lave com água uma vez por 5 minutos.
- Seque o escorregador e monte com o meio de montagem apropriado (veja a tabela de materiais).
NOTA: A contratenção não será necessária para que slides monoplex sejam usados para o desenvolvimento da biblioteca espectral.
4. Imagem e análise
- Preparação de slides da biblioteca espectral
- Crie slides de biblioteca (imagens de referência de uma única mancha) para cada fluoróforo, DAPI e auto-fluorescência com o mesmo tecido de controle para análise de imagem multiespectral.
- Utilizando os slides das amostras de biópsia endometrial de mulheres com RM e mulheres férteis, realize etapas de 1,1 a 3,6,4 para detecção de anticorpos únicos para cada lâmina (sem maiores anticorpos ou adição de fluoróforos).
- Para cada detecção de anticorpos, colorir um dos slides com DAPI (como na etapa 3.6.2) e deixar um slide sem manutenção para a detecção de qualquer possível auto-fluorescência tecidual no espectro.
- Use os filtros apropriados na estação de trabalho para obter a imagem para este conjunto de slides para cada anticorpo e carretá-los na biblioteca de análise de imagens (conforme descrito na etapa 4.2).
- Uma vez que a imagem seja capturada, selecione inForm como a Fonte da Biblioteca Espectral e construa a biblioteca espectral.
- À medida que os fluoroforos são usados, selecione Manchas/Fluores... do menu.
- Ao escolher as manchas ou fluoroforos, reduza as opções selecionando um ou mais Grupos. Selecione Tudo para mostrar todos os espectros compatíveis com as imagens.
- Imagem espectral
NOTA: As imagens foram capturadas usando a Estação de Trabalho Mantra com a biblioteca espectral estabelecida usando o software inForm Image Analysis.- Capture a imagem dos slides de um único anticorpo com os filtros de epi-fluorescência apropriados, conforme proposto na Tabela 2 (por exemplo, DAPI, isothiocyanato de fluoresceína [FITC], CY3, Texas Red e CY5) usando a estação de trabalho.
NOTA: Os filtros recomendados para os fluoroforos específicos utilizados neste protocolo são mostrados na Tabela 2. - Identifique um tempo de exposição adequado para um sinal ideal examinando cada marcador em seu canal de fluorescência correspondente.
NOTA: O sinal ideal é determinado de acordo com a referência sobre a positividade e localização obtida na coloração de anticorpos únicos. - Determine um tempo fixo de exposição para cada analito (combinação anticorpo-fluorohore) para padronizar uma comparação entre amostras.
NOTA: A determinação da exposição fixa depende da intensidade na amostra de interesses. - Escaneie os slides manchados de multiplex no modo de varredura apropriado com o algoritmo de foco automático incorporado.
NOTA: A biblioteca espectral estabelecida seria usada para diferenciar o cubo de imagem multiespectral em componentes individuais únicos (descompração espectral). Isso permitiria que a identificação baseada em cores para todos os marcadores de interesse fosse processada usando as duas etapas principais: sessão de treinamento e sessão de análise de imagens.
- Capture a imagem dos slides de um único anticorpo com os filtros de epi-fluorescência apropriados, conforme proposto na Tabela 2 (por exemplo, DAPI, isothiocyanato de fluoresceína [FITC], CY3, Texas Red e CY5) usando a estação de trabalho.
- Análise de imagem
- Contagem celular de tipos de células imunes selecionadas no endométrio
- Capture um mínimo de 10 campos para análise sob ampliação de 200x.
NOTA: Os campos foram capturados digitalizando toda a seção sem qualquer seleção. Isso pode garantir a captura simultânea de todos os componentes celulares do endométrio, por exemplo, a fronteira epitelial luminal, estroma e glândulas. - Para contar as células, clique no botão Objetos de Contagem na barra de passo para exibir o painel Configurações de contagem de objetos.
- Verifique o objeto descarte se tocar em uma caixa de borda para obter a exclusão de quaisquer objetos que toquem na borda da imagem, região do processo ou região do tecido.
- Se o tecido tiver sido segmentado, selecione a categoria de tecido na qual os objetos devem ser encontrados. Não conte objetos fora da categoria de tecido selecionado.
- Selecione a abordagem desejada para identificar objetos: Base de objeto ou pixel (limiar).
NOTA: A abordagem baseada em Pixel (Threshold) deve ser selecionada em caso de uma mancha confiável ou consistente para a qual a aplicação de um simples limiar produzirá os pixels do objeto. A abordagem baseada em objeto é recomendada quando abordagens mais avançadas baseadas em morfometria são necessárias em caso de falta de consistência e especificidade da coloração de objetos. - Selecione a escala de sinaldesejada: escala automática ou escala fixa.
NOTA: A escolha da escala automática resultará em dimensionamento automático de cada plano componente antes de realizar a segmentação do objeto. A opção Escala Fixa é recomendada quando é necessário melhor desempenho de segmentação e os sinais de manchas são consistentes e confiáveis. - Selecione o componente Principal para segmentação de objetos na lista de retirada.
- Ajuste o valor do sinal mínimo para o componente primário ao valor limiar desejado.
- Para preencher automaticamente os orifícios nos objetos, selecione Preencher buracos.
- Para detectar objetos que tocam em outros objetos como objetos individuais, em vez de como um objeto, selecione a caixa de seleção De divisão de refinar depois de selecionar a caixa de seleção de tamanho máximo (pixels).
- Para excluir objetos com base na arredondamento do objeto, verifique a caixa De arredondamento e especifique a Circularidade Mínimadesejada .
- Conte todas as células estromas (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−, e DAPI+), incluindo as células ao redor dos vasos sanguíneos.
- Conte as células imunes separadamente, incluindo células T (CD3+ e DAPI+), células B (CD20+ e DAPI+), macrófagos (CD68+ e DAPI+), e células uNK (CD56+ e DAPI+).
- Expresse os dados como as porcentagens das células imunes em relação ao número total de células estromal para cada imagem capturada, e reporte a contagem final de células como uma média de todos os campos.
- Use o Editor de exibição para visualizar o pós processamento de tabelas de dados resultantes. Exportar a tabela Dados de Contagem.
- Quantificação da distribuição espacial de células imunes endometrial
- Sob ampliação de 200x, estime a função L utilizando o programa R para uma faixa de 0-20 μm considerada uma distância máxima de contato celular14.
NOTA: A caixa de ferramentas de idioma R 'spatstat' foi usada para medir a função L.- Denotar o nível de agrupamento de diferentes pares de células imunes com base na área sob a curva (AUC) de sua função L.
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Representative Results
O processo esquemático global de realização de um ensaio multiplex de 4 cores para a detecção de 4 tipos de células imunes endometrial é mostrado na Figura 1. Resumindo, o protocolo para esta coloração de imunofluorescência multiplex exigiu 8 passos-chave: 1. Preparação de slides, 2. Recuperação de epitope, 3. Bloqueio, aplicação de anticorpos primários, 5. aplicação de anticorpos secundários, 6. Amplificação de sinal, 7. Remoção de anticorpos e 8. Contrastain e montagem. A renderização e análise de imagem foram então realizadas utilizando-se a Estação de Trabalho Mantra com a biblioteca espectral gerada utilizando o software inForm Image Analysis para diferenciar os 4 tipos de células imunes na amostra de endométrio(Figura 2).
Quatro tipos de células imunes endometrial podem ser identificados em amostras de endométrio humano usando essa técnica de coloração multiplex: células T CD3+, células CD20+ B, macrófagos CD68+ e células cd56+ uNK(Figura 3). No entanto, a interferência fluorófora deve ser cuidadosamente considerada para obter uma imagem clara e útil. Embora esta tecnologia multiespectral que utiliza a Estação de Trabalho Mantra possa suportar ensaios de até 8 plex, a aplicação dos 4 fluoroforos utilizados neste protocolo demonstrou um desempenho ideal sem interferência fluorofópica devido às diferenças nos espectros de emissões dos fluoroforos. Em contraste, a coloração multiplex envolvendo fluoroforos de 5-8 muitas vezes requer mais atenção para a interferência fluorófora resultante da emiteção dos comprimentos de onda compartilhados.
Para superar essa desvantagem, a coloração monoplex seria necessária para determinar a ordem de cada anticorpo no multiplex e identificar o nível de expressão e o padrão de cada marcador imunológico na amostra de endométrio. Isso pode ajudar a determinar a sequência de manchas dos marcadores e seus pares de fluoróforos TSA associados. Uma vez que o ensaio monoplex tenha sido concluído para determinar a ordem dos anticorpos a serem aplicados, o próximo passo será selecionar o fluorohore para detecção após a coloração multiplex. Um fluoróforo único deve ser escolhido para cada anticorpo de interesse. O número relacionado a cada fluoróforo seria aproximadamente o comprimento de onda fluorescente emitido durante a excitação (Tabela 1 e Tabela 2). Uma abordagem para evitar interferências fluoróforas é escolher pares fluoróforos com comprimentos de onda o mais longe possível um do outro (especialmente para anticorpos co-localizadores). Isso pode ajudar a reduzir o excesso de sobreposição espectral e fornecer uma imagem nítida e fenotipagem mais confiável. Além disso, a avaliação meticulosa ligando e desligando lasers da imagem composta multiplex no software inForm também pode ajudar a reconhecer os padrões de coloração para minimizar a saturação fluorófora(Figura 4).
Para análise de imagens, o número de células CD3+ T, células CD20+ B, MACRÓfagos CD68+ macrófagos, células CD56+ uNK e células estromamicas no endometrial stroma (CD3−/CD20−/CD68−/ CD56− e dapi-stained) pode ser contado automaticamente usando o inForm Tissue Finder Software 14.0 (Figura 5). Cada densidade do tipo de célula imune foi expressa em percentagem em relação ao número total de células estromas(Figura 5). Da mesma forma, a quantificação da distribuição espacial das células imunes endometrial baseou-se na posição X e Y de cada célula imune obtida do sistema InForm(Figura 6). Usando a língua R, o nível de agrupamento de diferentes pares de células imunes baseadas no AUC pode então ser distinguido.
Figura 1: Diagrama de fluxo de trabalho de coloração. Abreviaturas: BSA = albumina de soro bovino; HRP = peroxidase de rabanete. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estação de trabalho para captura e análise de imagens. (A) Mantra Imaging Workstation, (B) imagem espectral não processada,(C) segmentação de tecido,(D)segmentação de tecido (compartimentos epiteliais e estroma),(E)imagem composta do tecido endométrio mostrando quatro marcadores coloridos para identificar diferentes populações celulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem espectral. A imunosstaining multiplex de 4 tipos diferentes de células imunes foi realizada nas biópsias endometrial de (A) uma mulher de controle fértil e (B) uma mulher com RM inexplicável apresentada como imagem multiespectral única. Após a produção de uma biblioteca de uma única mancha, o descompramento espectral poderia revelar imagens de fluoroforos únicos representando(C) CD3, (D) CD56, (E) CD68, (F) CD20, (G) DAPI. Uma imagem composta foi então criada incorporando todos os fluoroforos após a imagem multiespectral(H). Barras de escala = 50 μm(A, B). Abreviaturas: LE = epitélio luminal; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole; RM = aborto recorrente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ferramenta de contagem inform. A ferramenta de contagem de software inForm é ativada selecionando o ícone da caixa bege (indicado por ◗). (A) Preparação de imagem, (B, C) segmentação de tecido para treinamento e automação desenhados à mão, (D) segmentando células individuais, (E) fenotipando as células com base na intensidade do fluoroforeiro, (F) análise para intensidade de fluorforeiro (a caixa vermelha mostrando o número de células positivas na intensidade do fluorohore selecionado) e(G) exportando os resultados para uso (a caixa vermelha indica as opções de exportação). Abreviação: IHC = imunohistoquímico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Contagem celular. (A) Fenotipagem das células para contagem automática de células e (B) saída das células manchadas positivas na região segmentada (por exemplo, stromal) para maior comparação e análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Medição da densidade espacial. (A) Detecção automática da posição de células imunes manchadas positivamente na região segmentada (por exemplo, stromal), (B) exibição de saída da coordenada de cada CD20+ célula imune manchada positivamente, e (C) determinando a densidade espacial e localização entre células CD20+ e outras células imunes nas regiões de tecido segmentado usando Spatstat. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ordem | Anticorpo | Clone | Clonalidade | Fator de diluição de anticorpos | Opalas | Fator de diluição opala |
| 1 | CD3 | SP7 | Monoclonal | 1 em 100 | Opala 620 | 0.111111111 |
| 2 | CD20 | L26 | Monoclonal | 1 em 100 | Opala 650 | 0.215277778 |
| 3 | CD68 | SP251 | Monoclonal | 1 em 100 | Opala 520 | 0.111111111 |
| 4 | CD56 | CD564 | Monoclonal | 1 em 100 | Opala 690 | 0.111111111 |
Tabela 1: Lista de anticorpos, clones e concentrações utilizadas.
| Tingir | Máximo de excitação (nm) | Emissão máxima (nm) | Detecção esperada no conjunto de filtros (nome) | Cor esperada |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI | Azul |
| Opala 520 | 494 | 525 | FITC | Verde |
| Opala 620 | 588 | 616 | Cy3 e Texas Red | Âmbar |
| Opala 650 | 627 | 650 | Texas Red e Cy5 | Laranja |
| Opala 690 | 676 | 694 | Texas Red e Cy5 | Claro |
Tabela 2: Lista de fluoroforos com seus comprimentos máximos de onda de excitação e emissão, detecção esperada em conjuntos de filtros apropriados e cores observáveis.
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Discussion
Passos críticos dentro do protocolo
É importante notar que a coloração multiplex requer otimização diligente. A recuperação de antígenos, usando a tecnologia de tampão citrato e micro-ondas, requer otimização para garantir a remoção completa de anticorpos e manter a viabilidade do tecido. Como os reagentes da TSA se ligam covalentemente aos locais ao redor do antígeno, eles podem potencialmente inibir a ligação de um anticorpo primário subsequente através de obstáculos estéricos (também conhecido como o "efeito guarda-chuva"). Isso tende a ocorrer quando vários marcadores imunológicos residem em um único compartimento celular e causam interferência de fluorforeiro. Para identificar se haverá efeito, seria fundamental realizar o IHC monoplex/IF de antemão para identificar qualquer sobreposição na localização das células imunes. Como a coloração de uma amostra seria necessária para gerar a biblioteca espectral, bibliotecas de espectros validadas podem facilitar a discriminação de sinais individuais para evitar ainda mais interferências fluorópicas. Se necessário, as concentrações primárias de anticorpos e os tempos de incubação, o pareamento fluoróforo-anticorpo, as concentrações de fluoróforos TSA e a ordem de coloração podem ser modificados para minimizar a interferência do fluorohore. Da mesma forma, é importante equilibrar adequadamente as concentrações de HRP, a fim de evitar a formação de dimer TSA. Isso pode ser alcançado pela titulação de anticorpos primários e secundários. Além disso, é de vital importância lembrar que as concentrações e tempos de incubação de anticorpos primários usados para coloração multiplex podem variar daquelas utilizadas em coloração cromogênica convencional. Assim, a determinação da concentração e ordem dos anticorpos para solicitar a coloração multiplex deve ser realizada com antecedência.
Modificações e solução de problemas
Neste estudo, utilizamos a coloração imunohistoquímica de fluorescência multiplex para detectar simultaneamente a interação de quatro tipos principais de células imunes em biópsias de endométrio de mulheres com e sem RM. Esta técnica usa anticorpos contra CD3 para células T, CD20 para células B, CD68 para macrófagos e CD56 para células uNK para distinguir entre esses tipos de células. Com base nesse método, descobrimos que os valores medianos de densidade celular CD3+, CD68+e CD56+ nas mulheres RM foram significativamente maiores do que os dos controles férteis15. O agrupamento entre células CD56+ uNK e macrófagos CD68+ foi significativamente maior no grupo RM do que nos controles férteis. Além disso, o uso deste método revelou que as células CD56+ uNK pareciam ter correlação numérica e espacial com CD68+ macrófagos em ambos os grupos de mulheres. Em contraste, as células CD56+ uNK têm uma correlação numérica significativa, mas não espacial com células CD3+ T em mulheres com RM15. Este método também determina a relação espacial de múltiplos tipos de células imunes no endométrio. No entanto, a positividade para um marcador específico pode ser limítrofe em alguns casos. Para superar esse problema, é aconselhável incluir um controle positivo e um controle negativo para determinar o limiar da positividade na construção da biblioteca espectral. Além disso, a avaliação meticulosa ligando e desligando lasers da imagem composta multiplex no software inForm também pode ajudar a reconhecer os padrões de coloração para minimizar a saturação do fluorohore.
Limitações da técnica
A identificação da interferência fluorófora durante a interpretação dos dados é essencial para diferenciar entre a colocalização genuína de marcadores e artefatos desenixados. Esta metodologia de coloração multiplex utiliza reagentes baseados em TSA impulsionados pela amplificação enzimática, o que pode aumentar a intensidade do marcador de antígeno em 10-100 vezes em comparação com os métodos indiretamente convencionais de IF. Isso gera um risco de deposição de tirado hiperativa, resultando potencialmente em um efeito guarda-chuva e/ou sinal de sangramento. Para identificar a sobretenção, os níveis de sinal podem ser avaliados visualmente por imagens descompridas em inForm e pairando o cursor sobre áreas brilhantes e positivas em uma imagem de tecido multiplex. Os níveis de sinal geralmente devem permanecer abaixo de 30 e, idealmente, dentro de um fator 3 um do outro, particularmente para fluoroforos espectralmente adjacentes. Mais de 5 vezes as diferenças nos sinais para fluoroforos espectralmente adjacentes podem levar à interferência de fluoróforos e causar artefatos descompradores. Se os níveis de sinal de qualquer fluorforeiro mostrarem mais de 3 vezes a diferença do fluoróforo adjacente, as concentrações de fluoróforo TSA precisam ser ajustadas para alcançar o equilíbrio do sinal. Uma vez confirmado que o sinal esteja na faixa correta, a relação sinal-fundo deve ser mantida em <1:10 para garantir que a coloração positiva não seja falsamente detectada a partir do fundo inespecífico.
Como o crosstalk espectral também pode criar interferência fluoróvia significativa, a ordem de coloração deve ser ajustada para separar corantes espectralmente adjacentes em sequência e expressão de marcadores. Embora esta tecnologia multiespectral usando o Mantra Workstation suporte até 8 ensaios plex, a aplicação de 4 fluoroforos, ou seja, Opal 520, 540, 620 e 690, demonstra o melhor desempenho sem interferência fluorópica. O uso de fluoroforos ≥5 muitas vezes requer mais otimização e validação para evitar o crosstalk espectral devido aos perfis espectrais de fluoroforos que compartilham comprimentos de onda próximos. Em outras palavras, o número de alvos que podem ser detectados simultaneamente por essa abordagem é limitado apenas pelo número de bandas de comprimento de onda e conjuntos de filtros de excitação/emissão disponíveis. Assim, para descartar a possível super-minguagem de um fluoróforo TSA que bloqueia a aplicação adicional de outros fluoroforos TSA e/ou para identificar o crosstalk de sinal, é essencial ser meticuloso ligando e desligando camadas da imagem composta multiplex no software inForm; interpretar os padrões de coloração a partir da única coloração do IHC corretamente; e procurando por sinais óbvios de perda, ganho ou idênticos em um plano correspondente à localização em outro plano.
A coloração multiespectral requer anticorpos emparelhados com fluoroforos específicos para detectar simultaneamente vários marcadores. Este emparelhamento fluoróforo-anticorpo segue duas regras: i) fluoroforos atribuídos para marcadores co-expressos devem ser espectralmente separados, e ii) alvos mais abundantes devem ser emparelhados com fluoroforos com menor brilho ou vice-versa. A ordem de coloração também precisa ser organizada para que os anticorpos sequenciais não co-localizem nos mesmos compartimentos celulares nas células manchadas. Portanto, além das concentrações de anticorpos e tempos de incubação, que são fatores críticos nos métodos convencionais de coloração, parâmetros adicionais, como o emparelhamento fluoródeo-anticorpo apropriado, as concentrações de fluoróforos TSA, a sequência de manchas e a exposição de um anticorpo específico a um ou mais tratamentos de micro-ondas, devem ser considerados para o sucesso da coloração multiplex. Devido à alta variabilidade nas amostras de estudo, um determinado protocolo multiplex pode não gerar o mesmo resultado em outros tipos de amostras de estudo.
Todo o processo de coloração sequencial opal multiplex pode levar de um a vários dias, dependendo do número de marcadores envolvidos no painel e dos tempos de incubação primária de anticorpos. Em contraste, os métodos if padrão normalmente permitem a visualização de marcadores 4-5 em uma única rodada de coloração. Deve-se notar que as condições otimizadas utilizando o método convencional de IHC precisam de maior otimização antes de prosseguir para procedimentos de coloração multiplex, que envolvem tratamentos adicionais de micro-ondas múltiplos e a aplicação de fluoroforos TSA que, em última análise, afetarão a intensidade de coloração de cada anticorpo. Atualmente, abordagens de imagem que utilizam tecnologias multiespectrais podem exigir instrumentação cara e dedicada. Além disso, só pode ser limitado a regiões de interesse selecionadas por imagens. Portanto, isso pode não ser ideal para laboratórios com recursos limitados e o escotismo de tecidos com alvos de antígeno incertos.
Significância em relação aos métodos existentes
Uma força particular deste método atual é a capacidade de medir a densidade de múltiplos tipos de células imunes no endométrio simultaneamente ao contrário dos métodos convencionais de IHC que só podem rotular de um a dois tipos de células em uma única seção de tecido. A citometria de fluxo é outro método que pode analisar as proporções relativas de diferentes tipos de células imunes na amostra endometrial; no entanto, não seria capaz de fornecer informações espaciais entre vários tipos de células imunes e a distribuição específica dentro de diferentes compartimentos endometrial. Além disso, o esgotamento tecidual é uma preocupação séria na prática clínica, especialmente durante os ensaios clínicos e ao usar amostras de biópsia. Esses dois métodos convencionais exigiriam um grande número de espécimes (seções ou células) para otimizar o procedimento e para detectar múltiplos tipos de células imunes no endométrio de mulheres com e sem RM.
Como descrito neste protocolo, o fluxo de trabalho Opal foi projetado para a detecção de até sete marcadores na mesma seção de tecido usando a Estação de Trabalho Mantra. Além disso, a reatividade cruzada de espécies durante a seleção de anticorpos não é uma limitação dessa tecnologia. De fato, uma vantagem dessa tecnologia é que ela permite o uso de anticorpos criados na mesma espécie para detectar até sete marcadores. Esta abordagem envolve a detecção com reagentes TSA fluorescentes seguidos de tratamento de micro-ondas para remover qualquer coloração inespecífica. Após a desmontagem baseada em micro-ondas, outra rodada de coloração pode ser realizada para detecção adicional de alvos sem o risco de reatividade cruzada de anticorpos. Além disso, este método de detecção tsa pode ser realizado em um mínimo de 3 dias para combinar até 7 fluorochromes enquanto ainda produz resultados confiáveis para detectar alvos proteicos de baixa expressão. Outra vantagem da coloração multiplex sobre o estudo tradicional de IHC é sua eficiência aprimorada à medida que a medição é automatizada, o que pode eliminar viés subjetivo. Os dados quantitativos gerados representam os resultados finais do ensaio.
Aplicações futuras
A gama de aplicação deste protocolo multiplex é imensa. É importante ressaltar que este é o primeiro artigo a descrever o método de detecção de expressão de marcador de imunofluorescência multiplexada usando a Estação de Trabalho Mantra e análise de imagem usando o software InForm 2.2.1 para fornecer resultados precisos e reprodutíveis na diferenciação de múltiplas populações de células imunes em mulheres com e sem RM. É importante, a localização de múltiplos alvos na mesma seção de tecido pode fornecer uma visão única sobre suas interações celulares. Em última análise, isso levará a uma melhor compreensão do microambiente das células imunes durante a implantação de embriões em mulheres com RM para estabelecer tratamento específico direcionado.
Além disso, nossos métodos atuais ajudaram a demonstrar que várias células imunes e suas interações podem ser importantes para a função do endométrio. Isso é demonstrado pelas mudanças significativas na densidade de três dos quatro tipos de células imunes endometrial e um aumento significativo no agrupamento entre as células CD68+ e CD56+. Por outro lado, as interações anormais desses tipos de células imunes podem ser fatores predispontos para a RM. Importante, ao contrário da detecção de um único subtipo de células imunes endometrial, a aplicação desta coloração multiplex IHC pode fornecer uma compreensão aprofundada da regulação imunológica da implantação de embriões. Além disso, a quantificação e a compreensão das características espaciais no microambiente imunológico podem ajudar a lançar luz sobre a biologia desta doença no contexto das imunoterapias.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Fundo Fiduciário Obstetra e Ginecológico de Hong Kong em 2018 e pelo Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
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