Summary
Aquí presentamos un modelo estandarizado de ratón SAH, inducido por perforación de filamento endovascular, combinado con imágenes de resonancia magnética (MRI) 24 h después de la operación para asegurar el sitio de sangrado correcto y excluir otras patologías intracraneales relevantes.
Abstract
El modelo de perforación de filamento endovascular para imitar la hemorragia subaracnoidea (HSA) es un modelo de uso común, sin embargo, la técnica puede causar una alta tasa de mortalidad, así como un volumen incontrolable de HSA y otras complicaciones intracraneales como accidente cerebrovascular o hemorragia intracraneal. En este protocolo, se presenta un modelo estandarizado de ratón SAH, inducido por perforación de filamento endovascular, combinado con imágenes de resonancia magnética (MRI) 24 h después de la operación para asegurar el sitio de sangrado correcto y excluir otras patologías intracraneales relevantes. Brevemente, los ratones C57BL/6J son anestesiados con una inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (70 mg/16 mg/kg de peso corporal) y colocados en posición supina. Después de la incisión del cuello en la línea media, se exponen la arteria carótida común (CCA) y la bifurcación carotídea, y se inserta una sutura de polipropileno monofilamento no absorbible 5-0 de manera retrógrada en la arteria carótida externa (ECA) y se avanza hacia la arteria carótida común. Luego, el filamento se invagina en la arteria carótida interna (ICA) y se empuja hacia adelante para perforar la arteria cerebral anterior (ACA). Después de la recuperación de la cirugía, los ratones se someten a una resonancia magnética de 7.0 T 24 h más tarde. El volumen de sangrado se puede cuantificar y clasificar a través de una resonancia magnética postoperatoria, lo que permite un grupo experimental robusto de HSA con la opción de realizar análisis de subgrupos adicionales basados en la cantidad de sangre.
Introduction
La hemorragia subaracnoidea (HSA) es causada por la ruptura de un aneurisma intracraneal y plantea una emergencia potencialmente mortal, asociada con una morbilidad y mortalidad sustanciales, que representan aproximadamente el 5% de los accidentes cerebrovasculares 1,2. Los pacientes con HSA presentan cefaleas severas, disfunción neurológica y alteración progresiva de la conciencia3. Alrededor del 30% de los pacientes con HSA mueren dentro de los primeros 30 días después del evento hemorrágico inicial4. Clínicamente, el 50% de los pacientes experimentan lesión cerebral retardada (DBI) después de una lesión cerebral temprana. La DBI se caracteriza por isquemia cerebral retardada y déficits neurológicos retardados. Los estudios actuales han demostrado que los efectos sinérgicos de varios factores diferentes conducen a la pérdida de la función neurológica, incluida la destrucción de la barrera hematoencefálica, la contracción de arterias pequeñas, la disfunción microcirculatoria y la trombosis 5,6.
Un aspecto único de la HSA es que la patogénesis se origina en una ubicación extraparenquimatosa, pero luego conduce a cascadas perjudiciales dentro del parénquima: la patología comienza con la acumulación de sangre en el espacio subaracnoideo, desencadenando una multitud de efectos intraparenquimatosos, como neuroinflamación, apoptosis de células neuronales y endoteliales, despolarización de propagación cortical y formación de edema cerebral7, 8.
La investigación clínica está limitada por varios factores, lo que hace que el modelo animal sea un elemento crítico para imitar de manera consistente y precisa los cambios pathomecanicistas de la enfermedad. Se han propuesto diferentes protocolos modelo de HSA, por ejemplo, inyección de sangre autóloga en la cisterna magna (ACM). También, un método modificado con una doble inyección de sangre autóloga en la cisterna magna y cisterna de quiasma óptico (APC) respectivamente 9,10. Si bien la inyección autóloga en sangre es una forma sencilla de simular el proceso patológico del vasoespasmo y las reacciones inflamatorias después de la hemorragia subaracnoidea, el siguiente aumento de la presión intracraneal (PIC) es relativamente lento, y no se inducen cambios notables en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica11,12. Otro método, la colocación de sangre periarterial, generalmente utilizada en modelos grandes de HSA (por ejemplo, monos y perros), consiste en colocar sangre autóloga anticoagulada o productos sanguíneos comparables alrededor del vaso. Los cambios de diámetro de la arteria se pueden observar con un microscopio, que sirve como indicador de vasoespasmo cerebral después de laHSA 13.
Barry et al. describieron por primera vez un modelo de perforación endovascular en 1979 en el que la arteria basilar se expone después de extirpar el cráneo; luego se perfora la arteria con microelectrodos de tungsteno, utilizando una técnica estereotáctica microscópica14. En 1995, Bederson y Veelken modificaron el modelo Zea-Longa de isquemia cerebral y establecieron la perforación endovascular, que se ha mejorado continuamente desdeel año 15,16. Este método se basa en el hecho de que ratones y humanos comparten una red vascular intracraneal similar, conocida como el círculo de Willis.
Para la evaluación postoperatoria y la calificación de la HSA en el modelo de ratón, se han propuesto diferentes enfoques. Sugawara et al. desarrollaron una escala de clasificación que ha sido ampliamente utilizada desde 200817. Este método evalúa la gravedad de la HSA en función de los cambios morfológicos. Sin embargo, para este método, la morfología del tejido cerebral del ratón debe examinarse bajo visión directa y, por lo tanto, el ratón debe sacrificarse para su evaluación. Además, se han establecido varios métodos para determinar la gravedad de la HSA in vivo. Los enfoques van desde la puntuación neurológica simple hasta el monitoreo de la presión intracraneal (PIC) y varias técnicas de imagen radiológica. Además, la clasificación por resonancia magnética se ha demostrado como una nueva herramienta no invasiva para calificar la gravedad de la HSA, correlacionándose con la puntuación neurológica18,19.
Aquí, se presenta un protocolo para un modelo de HSA causado por perforación endovascular, combinado con resonancia magnética postoperatoria. En un intento de establecer un sistema para objetivar la cantidad de sangrado en un entorno in vivo , también desarrollamos un sistema para la clasificación de la HSA y la cuantificación del volumen sanguíneo total basado en la resonancia magnética ponderada en T2 de alta resolución de 7.0 T. Este enfoque asegura la correcta inducción de la HSA y la exclusión de otras patologías como el ictus, la hidrocefalia o la hemorragia intracerebral (ICH) y complicaciones.
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Protocol
Los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones establecidas por Landesamt fuer Gesundheit und Soziales (LaGeSo), Berlín, Alemania (G0063/18). En este estudio, se utilizaron ratones machos C57Bl / 6J (8-12 semanas de edad) con un peso de 25 ± 0.286 g (promedio de ± s.e.m.).
1. Preparación animal
- Inducir la anestesia inyectando ketamina (70 mg/kg) y xilazina (16 mg/kg) por vía intraperitoneal. Mantener la temperatura corporal normal, contribuyendo a la rápida inducción de la anestesia profunda. Pruebe la sedación adecuada con un estímulo de dolor, como un pellizco en el dedo del pie, y verifique la ausencia de una reacción.
- Afeite cuidadosamente el pelo del cuello del ratón con una maquinilla de afeitar, límpielo con etanol al 70% seguido de betadina / clorhexidina y aplique lidocaína al 1% en la superficie de la piel para el control local del dolor.
- Coloque el ratón en posición supina. Use cinta adhesiva para fijar las extremidades y la cola, estirando suavemente la piel del cuello hacia el lado opuesto de la cirugía. Simultáneamente, eleve el cuello ligeramente.
- Use ungüento oftálmico (por ejemplo, dexpantenol al 5%) para prevenir la deshidratación de los ojos durante la operación.
2. Inducción de HSA
Figura 1: Imágenes paso a paso de la técnica quirúrgica. (A) Representación de la anatomía de la arteria carótida derecha expuesta: se identifican el CCA y su bifurcación en ICA y ECA, así como las pequeñas ramas del ECA (OA y STA). (B) El ECA se moviliza desde el tejido circundante y se liga con dos suturas antes de cortarlo. Una tercera ligadura debe colocarse libremente cerca de la bifurcación sin ocluirla. (C) El ICA y el CCA se ocluyen temporalmente (con ligadura o clips) para evitar un sangrado excesivo cuando el ECA se incide cuidadosamente. D) El filamento se inserta en el ACE y se avanza en el CCA. La ligadura preestablecida debe apretarse cuidadosamente para que no se produzca derrame de sangre, pero sigue siendo posible avanzar por el filamento. E) Se reabren el ICA y el CCA, y el muñón del ECA debe ajustarse a una dirección craneal. Al empujar el filamento ~ 9 mm hacia adelante en el ICA, se alcanzará la bifurcación ACA-MCA, y el recipiente se perfora empujando el filamento ~ 3 mm más. (F) El filamento se retira después de asegurar una re-ligadura temporal del CCA. La ligadura preestablecida de la ECA se ocluye rápidamente y la CCA se reabre para permitir la reperfusión. Abreviaturas: ACA = arteria cerebral anterior, CCA = arteria carótida común, ECA = arteria carótida externa, MCA = arteria cerebral media, ICA = arteria carótida interna, OA = arteria occipital, PPA = arteria pterigopalatina, STA = arteria tiroidea superior. Barra de escala = 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Abra la piel del cuello con un bisturí estéril, desde la barbilla hasta el borde superior del esternón (1,5 cm), y separe sin rodeos las glándulas salivales de su tejido conectivo circundante.
- Separe el grupo muscular a lo largo de un lado [en este caso, el lado derecho] de la tráquea, exponiendo la vaina de la arteria carótida común (CCA) cubierta con vasos sanguíneos y vénulas nutritivas. El CCA y el nervio vago se encuentran muy cerca el uno del otro.
- Disociar el CCA y dejar un 8-0 libre sutura de seda alrededor del CCA sin ligarlo de antemano. Preste atención a la protección del nervio vago, ya que se daña fácilmente (Figura 1A).
- Una triple bifurcación del CCA, el ICA y el ECA es visible a lo largo del tercio inferior posterior de la diástasis. Diseccionar el extremo distal de la ECA y ligar el vaso dos veces más lejos posible.
- Desconecte el ECA en el punto medio del segmento dos veces ligado, creando un muñón de vaso.
- Prearorganice un ligamento para el filamento alrededor del muñón ECA, no lo cierre hasta la inserción exitosa del filamento.
- Utilice una sutura o microclip para ocluir el ICA y el CCA temporalmente (Figura 1B).
- Haga una pequeña incisión (aproximadamente la mitad del diámetro de la ECA) en la ECA usando tijeras microvasculares. Inserte un filamento de proleno 5-0 (alternativamente 4-0) en el ECA y avance hacia el CCA.
- Cierre ligeramente la ligadura en el ECA mientras afloja el micro clip en el ICA y el CCA (Figura 1C).
- Tire suavemente hacia atrás del filamento y ajuste el muñón ECA en la dirección craneal, invaginando el filamento a través de la bifurcación en el ICA (Figura 1D).
- Apunte la punta del filamento medialmente en un ángulo de ~30° a la línea media traqueal y ~30° al plano horizontal. Empuje el filamento hacia adelante dentro del ICA. Después de alcanzar la bifurcación ACA-MCA, se encuentra resistencia (~ 9 mm).
- Avanza el filamento 3 mm más, perforando el ACA derecho. Retire rápidamente el filamento al muñón ECA, permitiendo el flujo sanguíneo hacia el espacio subaracnoideo.
- Mantenga el filamento en esta posición durante unos 10 s (Figura 1E). La presencia de temblores musculares, miosis ipsilateral, jadeo por respirar, ritmo cardíaco alterado e incontinencia urinaria pueden ser evidencia de apoyo de una cirugía exitosa.
- Cierre temporalmente el CCA para evitar la pérdida excesiva de sangre. Extraiga el filamento instantáneamente y ligate el ECA con la sutura preestablecida. Vuelva a abrir el CCA y permita la reperfusión y una mayor efusión de sangre en el espacio subaracnoideo (Figura 1F).
- Después de verificar si hay fugas de sangrado, desinfecte la piel que rodea la herida para prevenir infecciones cutáneas postoperatorias y suture la herida con una sutura de fibra de poliéster 4-0 no absorbible.
- Coloque el ratón en una caja térmica hasta que se recupere la conciencia. Espere hasta que el animal esté completamente despierto y asegúrese de que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la reclinación esternal. No devuelva a los animales a la compañía de otros ratones hasta que se recuperen por completo.
- Administrar 200-300 mg/kg de paracetamol de peso corporal para el alivio del dolor postoperatorio.
- Revise a los ratones diariamente después de la cirugía.
3. Medición por resonancia magnética
- 24 h después de la cirugía, realice una resonancia magnética utilizando un escáner de roedores (Tabla de materiales) y un resonador de cabeza de ratón dedicado: aquí, se utilizó un resonador de volumen de cuadratura de transmisión / recepción de 20 mm.
- Coloque el ratón sobre una manta de agua circulante calentada para garantizar una temperatura corporal constante de ~ 37 ° C. Inducir anestesia con isoflurano al 2,5 % en una mezcla de O2/N2O (30%/70%) y mantener con isoflurano al 1,5-2 % mediante mascarilla bajo monitorización continua de ventilación.
- Primero realice un escaneo de referencia rápido adquiriendo 3 paquetes de corte ortogonales (Tri-Pilot-Multi, FLASH con tiempo de repetición TR / tiempo de eco TE = 200 ms / 3 ms, 1 promedio, ángulo de giro FA = 30 °, campo de visión FOV = 28 mm x 28 mm, matriz MTX = 256 x 256, grosor de corte 1 mm, tiempo total de adquisición TA = 30 s).
- A continuación, utilice una secuencia de eco de espín turbo 2D ponderada en T2 de alta resolución para la obtención de imágenes (parámetros de imagen TR/TE = 5505 ms/36 ms, factor RARE 8, 6 promedios, 46 rodajas axiales contiguas con un grosor de rebanada de 0,35 mm para cubrir todo el cerebro, FOV = 25,6 mm x 25,6 mm, MTX = 256 x 256, TA = 13 min).
- Si el resultado no está claro, utilice una secuencia de eco de gradiente ponderado T2* desencadenada por respiración adicional con la misma isodistancia que la exploración T2w (2D FLASH, TR/TE = 600 ms/6,3 ms, FA = 30°, 1 promedio, 20 rodajas axiales con 0,35 mm de espesor, FOV y MTX idénticos a T2w, TA = 5-10 min dependiendo de la frecuencia respiratoria).
- Transfiera los datos al formato de imagen DICOM y utilice el software ImageJ para la clasificación SAH y la volumetría de coágulos sanguíneos. Los detalles sobre la cuantificación se enumeran como una guía paso a paso en el material complementario (Figura suplementaria 1).
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Representative Results
Mortalidad
Para este estudio, un total de 92 ratones machos C57Bl/6J de entre 8 y 12 semanas de edad fueron sometidos a una operación de HSA; en estos, observamos una tasa de mortalidad global del 11,9% (n = 12). La mortalidad ocurrió exclusivamente dentro de las primeras 6-24 h después de la cirugía, lo que sugiere la mortalidad perioperatoria, así como el sangrado de HSA en sí mismo como los factores contribuyentes más probables.
Grado de sangrado de HSA
Un total de 50 ratones recibieron resonancia magnética 24 h después de la operación para confirmar la HSA y garantizar la detección de otras patologías concurrentes, incluido el accidente cerebrovascular isquémico subagudo y la hidrocefalia. Los animales restantes se utilizaron para exploraciones anteriores para seleccionar el tiempo adecuado para la resonancia magnética postoperatoria. Entre los 50 ratones examinados en el punto de tiempo de 24 h, n = 7 animales que no presentaron HSA (grado de sangrado 0) y n = 5 ratones en los que se detectó accidente cerebrovascular adicional y / o ICH (grado de sangrado IV). El grado de sangrado de LASA se cuantificó en función de las resonancias magnéticas ponderadas en T2 de la siguiente manera (Figura 2A, B):
grado 0: no se ha identificado HSA ni hemorragia (14%)
grado I: espesor de SAH ≤0,80 mm (24%)
grado II: espesor SAH >0,8 y <1,6 mm (28%)
grado III: espesor de SAH ≥1,6 mm (24%)
grado IV: HSA con ICH y/o accidente cerebrovascular (10%).
Figura 2: Sistema de clasificación de HSA con el volumen sanguíneo correspondiente e imágenes de resonancia magnética. (A) Secciones axiales de resonancia magnética ponderadas en T2 que representan imágenes representativas que clasifican el grado de HSA. Grado 0: no se identificó HSA o hemorragia (14%); grado I: espesor SAH ≤0,80 mm; grado II: espesor SAH >0,8 y <1,6 mm; grado III: espesor SAH ≥1,6 mm; grado IV: HSA con ICH y/o accidente cerebrovascular. (B) Gráfico circular que muestra la distribución del grado de HSA en los ratones experimentales. (C,E) Volumen de sangrado SAH calculado basado en la fórmula V = A1 + A2 + ... + Ax) · d, mediante el cual el área de sangrado se determina a través de ImageJ en cada sección de la diapositiva, y la suma de todas las áreas de sangrado se multiplica con el grosor de la diapositiva de resonancia magnética correspondiente. (D) Volumen total de sangrado de cada grado de HSA basado en la estimación del volumen abc/2 de Kothari. Los valores se expresan como media ± SEM. Abreviaturas: ICH = hemorragia intracerebral, RM = resonancia magnética. Barra de escala = 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Volumen de sangrado
Para los grados I-III, el volumen de sangrado se cuantificó mediante dos métodos diferentes:
Método A: El volumen total de sangrado se calculó en base a la estimación del volumen abc/2 por Kathari et al., una modificación de la ecuación para el volumen elipsoide que se ha utilizado ampliamente en el entorno clínico para estimar el volumen de ICH (Figura 2D)20.
Método B: El volumen de sangrado SAH calculado se estimó en base a la fórmula V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d, mediante el cual el área de sangrado se determinó a través de ImageJ en cada sección de la diapositiva y la suma de todas las áreas de sangrado se multiplicó con el grosor de la diapositiva de resonancia magnética correspondiente ('Ai' corresponde al área de sangrado en la rebanada 'i', 'x' es el número total de rodajas, 'd' corresponde al grosor de la rebanada). Este método tuvo en cuenta la irregularidad de la forma (Figura 2C,E). Como era de esperar, el Método B mostró un mayor rango de valores en cada subgrupo. Sin embargo, ambos métodos mostraron una diferencia significativa en los grados de sangrado correspondientes que se basaron en el espesor axial de la HSA y se describen en el siguiente párrafo. La Figura Suplementaria 2 muestra el volumen de HSA de todos los subgrupos; como era de esperar, el grado IV era de naturaleza heterogénea, ya que también contenía ICH concurrente.
Análisis estadístico y cifras
Los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism para análisis estadísticos. Se utilizaron análisis ANOVA unidireccionales para comparar múltiples grupos. Los valores se muestran como medias ± errores estándar y los valores p de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los elementos de la Figura 1 y la Figura 2 se compusieron utilizando BioRender.com.
Figura suplementaria 1: Una guía paso a paso para cuantificar el volumen de sangrado con ImageJ. Importe las imágenes con ImageJ e introduzca "Strg+I" para mostrar los datos dimensionales. A continuación, establezca la escala de la imagen. Identifica todas las imágenes en las que se puede ver SAH. Para el método A, identifique la rebanada con el área de sangrado más grande y mida la longitud craneocaudal (=a), así como la longitud mediolateral (=b) de los dos ejes ortogonales que abarcan el volumen elipsoide de la HSA. La dimensión ventrodorsal (=c) de la forma elipsoide se puede estimar en función del grosor de la rebanada y el número de rodajas en las que se ve SAH [c = grosor de la rebanada x número de rodajas]. Calcule el volumen basado en la fórmula:V= abc/2. Para el método B, mida las áreas de sangrado en cada rebanada por separado y luego calcule el volumen basado en la fórmula: V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d, por el cual d = grosor de la rebanada. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 2: Volúmenes de sangrado de todos los subgrupos. (A) Volumen de sangrado (mm3) en cada subgrupo basado en el método A utilizando la fórmula V= abc/2. (B) Volúmenes sangrantes (mm3) de los subgrupos correspondientes utilizando el método B (fórmula V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d; d= espesor de la rebanada). Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En resumen, un modelo estandarizado de ratón de HSA inducido por operación de perforación de filamento endovascular se presenta con invasión menor, tiempo quirúrgico corto y tasas de mortalidad aceptables. La resonancia magnética se realiza 24 h después de la operación para asegurar el sitio de sangrado correcto y la exclusión de otras patologías intracraneales relevantes. Además, se clasificaron diferentes grados de sangrado de HSA y se midieron los volúmenes de sangrado, lo que permitió realizar análisis de subgrupos adicionales basados en el grado de sangrado.
El posicionamiento adecuado del ratón afecta el éxito de la perforación correcta. El cuello del ratón debe estirarse ligeramente hacia el lado opuesto de la operación, con la cabeza ligeramente elevada. Esto expone la trifurcación y hace que el camino de punción sea más fácilmente accesible. Si el avance del filamento falla, puede ser útil retirar el filamento ligeramente a la trifurcación y ajustar la posición de la cabeza hasta que sea posible avanzar sin ninguna resistencia.
La protección nerviosa intraoperatoria es crítica. Las alteraciones del nervio vago y el plexo cervical pueden causar cambios en los ritmos respiratorios y cardíacos, y algunos ratones pueden incluso morir debido a arritmias malignas. Si se presentan estos síntomas, es esencial pausar el procedimiento durante unos minutos hasta que la respiración y la frecuencia cardíaca se estabilicen.
Reducir la pérdida de sangre intraoperatoria es vital para mejorar la supervivencia de los ratones. Según nuestra experiencia, la ligadura de doble sutura se aplica mejor cerca de la ECA. Desconectamos el ECA en el medio de las dos ligaduras para evitar el reflujo sanguíneo del muñón distal del ECA. Cuando el filamento se inserta en el ECA, la sutura preestablecida debe ligarse para evitar el derrame de sangre de la incisión. Es fundamental no ligar el vaso demasiado apretado, ya que esto dificulta el avance adecuado del filamento.
La profundidad adecuada de inserción del filamento es esencial para una inducción exitosa de la HSA. Debido a la edad de los ratones utilizados (8-12 semanas), insertamos el filamento ~ 9 mm dentro del ICA y nos detenemos cuando se encontró resistencia, luego avanzamos ~ 3 mm más para la perforación. La inserción del filamento no lo suficientemente profundo podría resultar en una perforación insuficiente, sin causar SAH, mientras que la inserción excesiva podría conducir a un accidente cerebrovascular y / o ICH (Figura 3). Al mismo tiempo, la anatomía original de los ratones y las estructuras vasculares deben preservarse lo mejor posible durante la operación. Por ejemplo, la arteria occipital (OA) o la arteria tiroidea superior (STA), y los vasos sanguíneos nutritivos en la vaina, deben conservarse tanto como sea posible.
Figura 3: Anatomía del cerebro de ratón e imágenes macroscópicas de la HSA. (A) Anatomía vascular esquemática del ratón que muestra el sitio de perforación del filamento. (B) Imagen macroscópica clásica de inducción exitosa de la HSA. Antes de extirpar el cerebro, se realizó una perfusión de 1x PBS. (C) Vista macroscópica del ratón en la que el filamento fue empujado demasiado profundo, causando ICH. Abreviaturas: ACA = arteria cerebral anterior, ECA = arteria carótida externa, CCA = arteria carótida común, ICA = arteria carótida interna, ICH = hemorragia intracerebral, L = izquierda, MCA = arteria cerebral media, PPA = arteria pterigopalatina, R = derecha. Barra de escala = 3 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El modelo de perforación endovascular es un modelo animal de uso común para estudiar la HSA, pero los medios para asegurar el grado hemorrágico y excluir otras patologías como el ictus o la hemorragia intracerebral no están suficientemente estandarizados en la literatura21. Al igual que cualquier modelo animal quirúrgico, la tasa de éxito y la robustez de la inducción de la HSA dependen de la experiencia del cirujano.
Actualmente, el modelo de perforación endovascular es uno de los métodos más populares de inducción experimental de HSA en ratones. Este enfoque no requiere craneotomía y se asemeja con precisión a los procesos que tienen lugar en humanos que sufren de HSA22 aneurismática. Las ventajas incluyen la imitación cercana de la fisiopatología después de la HSA aneurisma, con respecto a las reacciones agudas y tardías23. Además, las tasas de mortalidad en este modelo han demostrado ser similares a las de los estudios clínicos en pacientes que sufren de HSA23 aneurismática. En comparación con los modelos de inyección de sangre, los cambios en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica se imitan más de cerca, y se logran tasas más altas de vasoespasmo en la perforación del filamento11,24. Los modelos de inyección de sangre son más invasivos y, por lo tanto, presentan un mayor riesgo de daño tisular en comparación con el modelo de perforación endovascular menos invasivo. No obstante, debe tenerse en cuenta que una ventaja importante de los métodos de inyección de sangre es el volumen sanguíneo fácilmente controlable23. Es importante tener en cuenta la estandarización de la velocidad de inyección, ya que las alteraciones de la PIC dependen en gran medida de la velocidad de inyección23. Aparte de estos modelos clásicos, la combinación de la inyección de elastasa para inducir la formación de aneurismas y la hipertensión por nefrectomía unilateral, que en última instancia conduce a la ruptura del aneurisma, plantea un modelo interesante para estudiar la hemorragia subaracnoidea en un entorno más fisiopatológicamente realista25. La integración de tales técnicas con ratones modificados genéticamente será de interés para futuros estudios.
Los sistemas de clasificación SAH anteriores para el modelo de perforación de filamentos se basan en la cantidad de sangre subaracnoidea visible en diferentes segmentos cerebrales después de que el ratón ha sido sacrificado17. En consecuencia, estos sistemas de clasificación no permiten estudios a largo plazo cuando la sangre ya ha sido reabsorbida en el momento del sacrificio. En el ámbito clínico, la HSA se clasifica en función de la presentación clínica, así como del grosor de la HSA en las imágenes, lo que corresponde al resultado clínico 1,26,27,28. Por lo tanto, en un intento de clasificar la gravedad del sangrado de forma no invasiva, añadimos un examen estandarizado de seguimiento de RM para calificar la HSA radiográficamente, mediante el cual la clasificación se basó en escalas de clasificación humanas preexistentes, adaptando el sistema de clasificación de un sistema de clasificación por RESONANCIA magnética publicado previamente en ratones SAH por Egashira et al.18. Este enfoque también garantiza la cuantificación del volumen sanguíneo total y la exclusión de animales con otras patologías intracraneales concurrentes (por ejemplo, accidente cerebrovascular, ICH, hidrocefalia). Algunos estudios propusieron la presión intracraneal (PIC), la perfusión cerebral y el monitoreo de la presión arterial como evidencia de una inducción exitosa de la HSA, lo que podría ser una herramienta útil adicional29. Las formas indirectas de calificar la gravedad de la HSA y el posible daño intraparenquimatoso incluyen la combinación de hallazgos clínicos con tinción histológica para marcadores de muerte celular como p53, TUNEL o caspasa-3. Sin embargo, estas herramientas indirectas, como la monitorización de la PIC y la neurológica, pueden no distinguir claramente otras patologías como el accidente cerebrovascular, la hemorragia intracraneal o la hidrocefalia. A pesar de las ventajas de la clasificación por resonancia magnética, hay un inconveniente importante de este enfoque con respecto a su viabilidad: la resonancia magnética no está tan ampliamente disponible para los laboratorios como otros métodos. Esto limita la amplia introducción de sistemas de clasificación por resonancia magnética en la HSA experimental. Sin embargo, cuando está disponible, el sistema de clasificación por resonancia magnética presentado agrega una herramienta para estandarizar los modelos experimentales de HSA, facilitando así la reproducibilidad y la comparabilidad de los experimentos23. En este estudio, a pesar de los cambios clínicos observados durante la operación, todavía hubo una tasa del 14% de ratones sin evidencia de HSA en la resonancia magnética postoperatoria. Posiblemente, los ratones de este subgrupo sufrieron microhemorragias, no detectables en la resonancia magnética (similar a los pacientes con HSA con TC negativa pero la presencia de xantocromía en la punción lumbar). Estos ratones fueron excluidos en esta configuración experimental para análisis adicionales. La razón técnica de estos "no sangrados" en la resonancia magnética podría ser la inserción insuficiente de filamentos, lo que resulta en ninguna perforación (por ejemplo, por colocación incorrecta en OA o arteria pterigopalatina (PPA)). Además, el vaso perforado con éxito podría cerrarse nuevamente después de retirar el filamento, evitando la HSA.
En resumen, se presenta un modelo estandarizado de HSA aneurismática experimental por perforación endovascular, combinado con rmología 24 h después de la cirugía para confirmar y calificar la hemorragia y excluir otras patologías intracraneales relevantes.
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Disclosures
Sin conflictos de intereses
Acknowledgments
SL fue apoyado por el Consejo chino de Becas. KT fue apoyado por la beca BIH-MD del Instituto de Salud de Berlín y la Sonnenfeld-Stiftung. RX cuenta con el apoyo del Programa de Científicos Clínicos de BIH-Charité, financiado por la Charité -Universitätsmedizin Berlin y el Instituto de Salud de Berlín. Agradecemos el apoyo de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) y el Fondo de Publicación de Acceso Abierto de Charité - Universitätsmedizin Berlin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eye cream | Bayer | 815529836 | Bepanthen |
| Images analysis software | ImageJ | Bundled with Java 1.8.0_172 | |
| Ligation suture (5-0) | SMI | Silk black USP | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Ketamine | CP-pharma | 797-037 | 100 mg/mL |
| MRI | Bruker | Pharmascan 70/16 | 7 Tesla |
| MRI images acquired software | Bruker | Bruker Paravision 5.1 | |
| Paracetamol (40 mg/mL) | bene Arzneimittel | 4993736 | |
| Prolene filament (5-0) | Erhicon | EH7255 | |
| Razor | Wella | HS61 | |
| Surgical instrument (Fine Scissors) | FST | 14060-09 | |
| Surgical instrument (forceps#1) | AESCULAP | FM001R | |
| Surgical instrument (forceps#2) | AESCULAP | FD2855R | |
| Surgical instrument (forceps#3) | Hammacher | HCS 082-12 | |
| Surgical instrument (Needle holder) | FST | 91201-13 | |
| Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) | FST | 15000-08 | |
| Surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Ventilation monitoring | Stony Brook | Small Animal Monitoring & Gating System | |
| Wounding suture(4-0) | Erhicon | CB84D | |
| Xylavet | CP-pharma | 797-062 | 20 mg/mL |
References
- Macdonald, R. L., Schweizer, T. A.
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J.
- Abraham, M. K., Chang, W. -T. W.
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