Summary
本プロトコールでは、顎下腺(SMG)の内皮バリア機能を、2光子レーザー走査顕微鏡下で in vivo の被験動物モデルの角静脈に異なる分子量蛍光トレーサーを注入することによって評価した。
Abstract
唾液は、口腔および全体的な健康に重要な役割を果たします。血管の無傷の内皮バリア機能は唾液分泌を可能にしますが、内皮バリア機能障害は多くの唾液腺分泌障害に関連しています。本プロトコルは、マウス顎下腺(SMG)における内皮タイトジャンクション(TJ)の機能を評価するための in vivo 傍細胞透過性検出方法を記載する。まず、分子量の異なる蛍光標識デキストラン(4 kDa、40 kDa、または70 kDa)をマウスの角静脈に注入しました。その後、片側SMGを解剖し、2光子レーザー走査型顕微鏡の下でカスタマイズされたホルダーに固定し、血管、腺房、および管の画像をキャプチャしました。この方法を利用して、血管から腺房の基底側、さらには腺房上皮を越えて管への異なるサイズのトレーサーのリアルタイムの動的漏出をモニターし、生理学的または病態生理学的条件下での内皮バリア機能の変化を評価しました。
Introduction
さまざまな唾液腺が唾液を生成し、これは主に感染症に対する防御の最前線として機能し、消化を助け、それによって口腔および全体的な健康に不可欠な役割を果たします1。血液供給は、一次唾液を形成する水、電解質、および分子を常に供給するため、唾液腺分泌に不可欠です。タイトジャンクション(TJ)複合体によって調節される内皮バリア機能は、水、溶質、タンパク質、さらには循環血管から唾液腺組織に移動する細胞に対しても高い透過性である毛細血管の透過を厳密かつ繊細に制限します2,3。我々はこれまでに、コリン作動性刺激に応答して内皮TJが開口すると唾液分泌が促進されるのに対し、シェーグレン症候群では内皮バリア機能の障害が顎下腺(SMG)の分泌低下やリンパ球浸潤と相互に関連していることを見出しました4。これらのデータは、様々な唾液腺疾患に関して内皮バリア機能の寄与に十分な注意を払う必要があることを示唆している。
2光子レーザー走査型顕微鏡は、in vivoで無傷の組織内の細胞のダイナミクスを観察するための強力なツールです。この技術の利点の1つは、標本がNIRによって励起されたときに、近赤外光(NIR)が可視光または紫外線よりも組織の浸透が深く、適切な条件下で組織に明らかな光損傷を引き起こさないことです5,6。実際、唾液腺は非常に均質で表在性の組織であり、表面の腺房細胞は腺表面からわずか約30μmしか離れていません7,8。生体内共焦点顕微鏡は、生きたマウス唾液腺における外分泌とアクチン細胞骨格を細胞内分解能で研究できることが示されています8。それにもかかわらず、2光子レーザー走査顕微鏡は、従来の共焦点顕微鏡の利点があるだけでなく、より深い組織や画像をより明確に検出するためにも使用できます。ここでは、傍細胞透過性トレーサーとして頻繁に使用され、サイズが異なるという利点を有する蛍光標識デクストランスを使用して、TJ細孔9の大きさを試験することができる。本研究では、マウスSMGの内皮バリア機能をその場で評価するために、生体内リアルタイム2光子レーザー走査顕微鏡技術を確立します。マウスSMGにおけるin vivo血管透過性検出のための各作業ステップは、現在のプロトコルに記載されている。マウスSMG管結紮モデルにおける内皮バリア機能の検出例である。
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Protocol
すべての実験手順は、北京大学健康科学センターの動物研究倫理委員会によって承認され、実験動物の世話と使用のためのガイド(NIH出版物第85-23号、1996年改訂)に準拠しています。8〜10週の年齢群の雄野生型(WT)マウスを本研究に使用した。実験動物は、痛みと不快感を最小限に抑えるように注意深く治療されました。
1.動物の手順
- 麻酔薬とトレーサーを準備して投与します。
- 研究全体を通して無菌状態を維持し、オートクレーブ滅菌によって機器を滅菌します。マウスを2つのグループに分けます。
注:対照群は未治療のままにし、片側SMG管結紮術を1日行った他の群を実験群とした。グループ化する場合、血管透過性に対する体重と年齢の影響を減らすために、体重と年齢が類似しているマウスを選択する必要があります。 - フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識デキストラン(分子量:4 kDa;FD4)およびローダミンB標識デキストラン(分子量:70kDa;RD70)( 材料の表を参照)は、透過性アッセイ用の蛍光シグナル間の干渉を最小限に抑えるための明確な励起/発光スペクトルを備えています(それぞれFITCまたはローダミンBフィルターを使用)。
注:FD4とRD70の励起波長はそれぞれ488nmと594nmであり、選択された発光波長はそれぞれ511-564nmと617-669nmです。 - トレーサーを滅菌リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)で100 mg/mLストックに希釈し、光から保護されたアリコートを-20°Cで保管します。
注:4 kDaなどの分子量のデキストランは、病理学的状態がなくてもマウスSMGの血液から急速に漏出します10。 - トリブロモエタノールを腹腔内注射し(25gマウスに対する用量は約600μLであった)、マウスを麻酔した。地元の動物倫理委員会が推奨する鎮痛剤を提供します。
注:麻酔の導入後、乾燥を防ぐために目に獣医軟膏を使用してください。動物の世話をします11.マウスが運動反応なしにつま先のつまみなどの機械的刺激に耐えるまで待ちます。 - 分子量の異なる2つの傍細胞透過性トレーサー(FD4およびRD70)の混合物を角静脈(0.5 mg / g体重)に注入します。各マウスに100 μLのトレーサー溶液混合物を注入し、50 μLの各色素を1:1の比率で混合します。
- 麻酔後、マウスの頭と首をそっと持ち、眼球の片側をわずかに突き出します。蛍光トレーサーを含むインスリン注射器を挿入します(注射器に空気を入れないように注意してください)目に対して直角に目の角に沿って。
注意: 角静脈が正しく挿入されている場合、色素溶液は静脈に簡単に注入され、注入中に抵抗はありません。さらに、マウスでの尾静脈注射も静脈内トレーサー分子の候補である可能性があります。
- 麻酔後、マウスの頭と首をそっと持ち、眼球の片側をわずかに突き出します。蛍光トレーサーを含むインスリン注射器を挿入します(注射器に空気を入れないように注意してください)目に対して直角に目の角に沿って。
- 研究全体を通して無菌状態を維持し、オートクレーブ滅菌によって機器を滅菌します。マウスを2つのグループに分けます。
- 以下の手順に従ってSMG分離を実行します。
注意: 手術には、組織ハサミや分離ニッケルなどの滅菌ツールを使用してください。- 片側腺は、実体顕微鏡で周囲の血管や神経を傷つけないように慎重に分離します。
- 傍細胞透過トレーサーの注射後、マウスを段ボールに素早く置き、四肢と頭をテープで留めた状態で仰臥位に置きます。首の皮膚に脱毛クリームを塗り、マウスの毛を取り除きます。手術前に75%エタノールを使用して皮膚を消毒します。
- 次に、実体顕微鏡下で、一般的な組織ハサミで首の表皮を切り取り、SMGの両側を露出させます(この実験では右腺を処理しました)。次に、鈍い組織分離ニッケル( 材料の表を参照)を使用して、腺組織と血管を傷つけないように注意しながら、カプセルを腺表面から穏やかに分離します。
- 腺構造を損傷することなく、カプセルを腺表面から分離します。さらに、マウスの拘束と腺分離の全プロセスが10分以内に完了することを確認してください。
- 片側腺は、実体顕微鏡で周囲の血管や神経を傷つけないように慎重に分離します。
2. 2光子顕微鏡のセットアップ
- カスタマイズしたホルダーを負圧装置に接続し、負圧効果が適切に達成されているかどうかを事前に確認してください。
注意: ホルダーは、中央に平らな丸いガラス片が付いたミニチュア虫眼鏡のような形をしています(直径:4.32 mm、 図1)。負圧装置は、ホルダーが排水ボトルにリンクされているゴムチューブに接続され、ボトルが短いゴムチューブを介して負圧コントローラーに取り付けられるように社内で設計されました。このようにして、負圧コントローラーは圧力を調整して、組織がホルダーに吸い込まれるようにすることができます。- ホルダーの片側を負圧装置にリンクします。負圧装置が無傷で適切であるかどうかをテストするには、ホルダーを逆さまにし、水滴を追加して、負圧値を20単位に設定します。水が完全かつ迅速に吸い取られると、負圧装置はホルダーに正常に取り付けられます。
- マウスの露出したSMGをカスタマイズしたホルダーにそっと置き、マウスの体からできるだけ離して負圧吸引によって組織を吸い上げて、呼吸やその他の条件によって引き起こされるモーションアーチファクトを減らします。
- 25倍/NA 1.0の水浸対物レンズ(NIR専用)の下でグランドに取り付けられたサポート材料を画像化します。
注:この実験では、直立した2光子顕微鏡( 材料表を参照)を使用します。血管は、トレーサー注射後、明らかな蛍光ですぐに見える必要があります。
3. 血管イメージングと透過性検出
- 腺の視力が選択された直後にイメージングを開始します。
注:通常、実験計画に応じて、20秒以上の45〜50枚の画像の時系列が通常キャプチャされます。 - 腺の表面から組織内に70〜140μmまで、2μm離れたZ軸に沿って連続画像を取得し、3次元(3D)構造を生成します。
- 血管のタイムラプス画像を取得して、SMGの血管透過性を測定します。
注意: 顕微鏡ソフトウェアを実行した後、プログラムメニューの条件を次のように設定します(材料表を参照)。- [エクスプローラー] ダイアログ ボックスで、[ 新しいフォルダーの追加 ] をクリックし、ファイル名を変更します。
- [集録] 列に戻ります。XY では、フォーマットは 512 x 512、速度は 400 Hz です。双方向 X をオンにします。
- ズーム 係数 を 0.75 に設定し、ズームの場合は 1.5 に設定します。
- タイムラプス画像を取得するには、[取得モード]でxytを選択します。実験の必要性に応じて、[持続時間]を20秒、30分、またはそれ以上に設定します。
- 3D 構築を行うには、[ 取り込みモード] を xyz に設定します。Zステップサイズは、実際の状況に応じて設定できます。
- 条件を設定したら、 ライブ をクリックして、フォトフォーミングフレーム内の2つのチャンネルと重なり合うチャンネルの血管イメージングを観察し、関心のある領域を選択します。
- [ 開始 ]をクリックしてイメージングを開始します。
注意: 麻酔下にある間、イメージングプロセス中にマウスを放置しないでください。
4.データ分析
- 血管透過性を評価するには、Image Jソフトウェアを使用して、血管の外側と内側の間のFD4とRD70の蛍光強度比を計算し、それらを血管外および血管内強度4として示します。
注:デキストランの輸送の追跡による血管透過性の変化は、内皮バリア機能の変化を反映しています。さらに、血管の変化の直径と数を計算することにより、血管の形態と密度を観察します。- Image Jソフトウェアを実行します(材料表を参照)。
- [ファイル]をクリックし、[開く]を選択して、2光子顕微鏡でキャプチャされた血管画像を開きます。
- [イメージ] を選択し、[タイプ] を [16 ビット] に設定して、イメージ形式を変換します。
- [分析] を選択し、[測定値の設定] で [面積、平均、IntDen] を選択します。[OK]をクリックして確認します。
- [分析] で [ツール] を選択し、[ROI マネージャー] を開いて、[すべて表示] と [ラベル] を選択します。
- 血管内蛍光強度値の測定:メインインターフェイスのなげなわツールをクリックして、血管の輪郭をスケッチします。ROIマネージャーで[追加]をクリックします。この手順に従って、複数の船舶を選択し続けます。ROI マネージャのオブジェクトをすべて選択し、[測定]をクリックします。
- 総蛍光強度値を測定する:画像全体の輪郭を描き、「 測定」をクリックすると、画像の総蛍光強度値になります。
- 血管外蛍光強度値を算出する。計算のためにデータを Excel にコピーします。血管外蛍光強度比=(1−血管内蛍光強度値/総蛍光強度値)×100%。
5. ダウンストリームアプリケーション
- 実験中、赤血球(2光子顕微鏡で黒い点として表示)4 が時間内に受ける距離を測定して、血流速度を計算します。
- 内皮細胞全体の血球の動きを視覚化するには、蛍光で血球を標識します。次いで、FD4またはRD70をマウス尾静脈を介して蛍光標識細胞に注入する。5分間循環した後、関心のある細胞を一定期間追跡します。
注:ドナーマウスの脾臓に由来する合計2 x 106 CFSE(カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、膜透過性蛍光色素)標識リンパ球を尾静脈注射によってレシピエントに移し、SMGへのリンパ球の浸潤を実験動物モデル4で調査しました。
6.動物の世話と回復
- 実験中は動物の世話をしてください。
注意: 実験中に完全に回復するまで、手術を受けた動物が他の動物と一緒に戻されないようにしてください。 - 十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。
注意: マウスの呼吸状態を継続的に観察し、動物の加熱パッドに置いて暖かく保ちます。地元の動物倫理委員会が推奨するように、術後の痛みの回復ハウジングと鎮痛を提供します。
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Representative Results
プロトコルに従って、片側SMGをカスタムメイドのホルダーに取り付け、呼吸がモーションアーチファクトを引き起こすのを防ぐために、腺をマウスの体からできるだけ離しました。血管内の赤血球(黒い点)の急速な流れを顕微鏡で観察した。眼レンズの下の組織場を見つけた後、顕微鏡ソフトウェアを操作するために切り替える必要があります。対照群では、両方のトレーサーがマウスSMGの血管に存在していた。特にFD4は分子量が小さいため、血管から腺房や管の基底側に漏れ出し、腺房や管の形状をはっきりと描くことができました(図2AのAとDが指摘しているように)。対照的に、40 kDaや70 kDaなどの高分子量のデキストランは、SMG形態を区別できませんでした。実際、RD70は大きな血管や微小血管に主に分布していました。管結紮群ではFD4とRD70の両方が腺房の基底側に血管外漏出しており、管結紮が内皮バリア機能を破壊し、大きな分子への透過性を高める可能性があることが示されました。この半定量的なFD4およびRD70蛍光強度の結果も上記の現象を確認した(図2B)。また,血管径が大きくなり,1日間の管結紮が血管拡張を誘導したことが示された。さらに、3D画像は、結紮群の血管周辺のFD4およびRD70のはるかに不明瞭な蛍光を示しました(図2C)。
図1:カスタマイズされたホルダーを示す概略図。ホルダーはミニチュア虫眼鏡のような形をしており、中央に丸いガラスの平らな部分があります(直径:4.32 mm)。ホルダーの片側は負圧装置に接続されてガラスの下の組織を吸い上げますが、ホルダーの反対側は死んでいます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウス顎下腺(SMG)における血管の in vivo 血管透過性アッセイおよび3D画像。 マウスを対照群と管結紮群に分けた。両群の片側腺が露出し、観察された。(A)4 kDaのFITC標識デキストラン(FD4)および70 kDaのローダミンB標識デキストラン(RD70)を角静脈に注射することにより、 in vivo 血管透過性アッセイを実施しました。矢印は、SMG内のトレーサーの分布の変化を示します。A、アシニ。D、ダクト。スケールバー= 100μm。 (B)上記画像の半定量解析のために、血管内(血管内)および血管外(血管外)のFD4およびRD70を含む蛍光強度をImage Jソフトウェアで測定した。(C)SMGにおける血管および微小血管の3D画像。矢印は、SMG内のトレーサーの分布の変化を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
血管の恒常性維持には内皮バリア機能の維持・調節が不可欠です。内皮細胞とその細胞間接合部は、血管の完全性の維持と制御に重要な役割を果たします12。血流、成長因子、および炎症因子のせん断力は、血管透過性の変化を引き起こし、したがって、高血圧、糖尿病、および自己免疫疾患などの全身性疾患の発生および発症に関与する可能性がある13,14,15。唾液腺の血管分布や血流は、すべての臓器や組織に最も豊富に存在するものの1つですが、唾液腺の血管系に関する研究は広く行われていません。唾液腺血管、特に内皮バリア機能のより深く、より包括的な理解は、唾液分泌のメカニズムに新たな手がかりを提供し、血管生物学の研究を促進します。
in vivo 2光子レーザー走査型顕微鏡技術は、動物を犠牲にすることなく蛍光色素を静脈内注射することにより血管透過性を定量化することができる。異なる分子量またはサイズのミクロスフェアを有する蛍光標識デキストランは、内皮損傷の程度をよりよく評価することができる。一方、血管透過性の動的動態は、血管透過性の生体内評価システムを用いてリアルタイムで決定される。別の利点は、細動脈、細静脈、毛細血管などの血管の種類を簡単に区別できることです16。さらに、血管内皮バリアの破壊と免疫細胞の遊走は必然的に炎症に関連していますが、単一の要因を調査した多くの研究があり、両方の側面間の関係に焦点を当てた研究はごくわずかです17,18。Uhlらは最近、蛍光標識されたデキストランと異なる蛍光マーカーを持つ免疫細胞特異的抗体を同時にin vivoに注射することにより、唾液腺疾患におけるさまざまな病原性因子の役割を分析する研究方法を確立しました19。ここでは、蛍光標識された免疫細胞を尾静脈注射によって追跡し、現在の作業モデルにおける病因を探索することもできます。したがって、本実験方法は、インビボでのSMG疾患動物モデルにおける白血球溢出と内皮バリア完全性との間の相互作用を研究するためのユニークなシステムを提供し得る。
それにもかかわらず、麻酔薬に対するマウスの反応性は異なり、イメージング時間が長くなるほど、必要な麻酔時間が長くなり、マウスの回復が困難になることを無視してはなりません。したがって、この実験は、イメージング後に後続の in vivo 実験が必要ない場合の調査に適しています。さらに、別の制限は、この手法が長い期間の実験には適していないことです。デキストランは水溶性で代謝しやすいため、イメージング時間が長くなると蛍光が弱くなるため、イメージング時間を30分以内に維持することをお勧めします。
全体として、この研究は、血管および微小血管から腺組織への傍細胞透過性トレーサーおよび細胞の浸透に焦点を当てており、マウスSMGの内皮バリア機能を評価するための血管透過性を測定する高度な方法として、造影増強された生体内動的2光子レーザー走査顕微鏡法を厳密に確立しました。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(助成金31972908、81991500、81991502、81771093、81974151)および北京自然科学基金会(助成金7202082)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
References
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