Summary
No presente protocolo, a função de barreira endotelial da glândula submandibular (SMG) foi avaliada por meio da injeção de diferentes marcadores fluorescentes de peso molecular nas veias angulares de modelos animais de teste in vivo sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons.
Abstract
A saliva desempenha um papel importante na saúde oral e geral. A função de barreira endotelial intacta dos vasos sanguíneos permite a secreção de saliva, enquanto a disfunção da barreira endotelial está relacionada a muitos distúrbios secretores das glândulas salivares. O presente protocolo descreve um método de detecção de permeabilidade paracelular in vivo para avaliar a função das junções endoteliais apertadas (TJs) em glândulas submandibulares de camundongos (SMG). Primeiro, dextrans marcado com fluorescência com diferentes pesos moleculares (4 kDa, 40 kDa, ou 70 kDa) foram injetados nas veias angulares de camundongos. Posteriormente, o SMG unilateral foi dissecado e fixado no suporte personalizado sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons e, em seguida, as imagens foram capturadas para vasos sanguíneos, ácinos e dutos. Utilizando este método, o vazamento dinâmico em tempo real dos traçadores de diferentes tamanhos dos vasos sanguíneos para os lados basais dos ácinos e até mesmo através do epitélio acinar para os ductos foi monitorado para avaliar a alteração da função de barreira endotelial sob condições fisiológicas ou fisiopatológicas.
Introduction
Várias glândulas salivares produzem saliva, que atua principalmente como a primeira linha de defesa contra infecções e ajuda a digestão, desempenhando assim um papel essencial na saúde bucal e geral1. O suprimento de sangue é crucial para a secreção das glândulas salivares, uma vez que fornece constantemente água, eletrólitos e moléculas que formam a saliva primária. A função de barreira endotelial, regulada pelo complexo de junção apertada (TJ), limita estrita e delicadamente a permeação dos capilares, que são altamente permeáveis à água, solutos, proteínas e até mesmo células que se deslocam dos vasos sanguíneos circulantes para os tecidos das glândulas salivares 2,3. Descobrimos anteriormente que a abertura dos TJs endoteliais em resposta a um estímulo colinérgico facilita a secreção salivar, enquanto o comprometimento da função da barreira endotelial está interligado com hipossecreção e infiltração linfocítica nas glândulas submandibulares (SMGs) na síndrome de Sjögren4. Esses dados sugerem que a contribuição da função de barreira endotelial precisa ser prestada atenção suficiente em relação a uma variedade de doenças das glândulas salivares.
Um microscópio de varredura a laser de dois fótons é uma ferramenta poderosa para observar a dinâmica das células no tecido intacto in vivo. Uma das vantagens dessa técnica é que a luz infravermelha próxima (NIR) tem penetração tecidual mais profunda do que a luz visível ou ultravioleta quando os espécimes são excitados pelo NIR e não causa danos evidentes à luz dos tecidos sob condições apropriadas 5,6. De fato, as glândulas salivares são um tecido muito homogêneo e superficial, no qual as células acinares superficiais estão a apenas cerca de 30 μm de distância da superfície da glândula 7,8. Demonstrou-se que a microscopia confocal intravital pode estudar a secreção exócrina e o citoesqueleto de actina em glândulas salivares vivas de camundongos em resolução subcelular8. A microscopia de varredura a laser de dois fótons, no entanto, não só tem a vantagem da microscopia confocal convencional, mas também pode ser usada para detectar tecidos e imagens mais profundos com mais clareza. Aqui, o dextrans marcado por fluorescência, que é frequentemente usado como traçador de permeabilidade paracelular e tem a vantagem de diferentes tamanhos, pode ser usado para testar a magnitude do poro TJ9. No presente estudo, uma técnica intravital de microscopia a laser de dois fótons em tempo real é estabelecida para avaliação in situ da função da barreira endotelial em SMGs de camundongos. Cada etapa de trabalho para detecção de permeabilidade vascular in vivo em SMGs de camundongos é descrita no protocolo atual. Aqui está um exemplo de detecção da função de barreira endotelial no modelo de ligadura do ducto SMG do rato.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Pequim e cumpriram o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publication No. 85-23, revisado em 1996). Camundongos machos do tipo selvagem (WT) na faixa etária de 8-10 semanas foram utilizados para o presente estudo. Os animais experimentais foram cuidadosamente tratados para minimizar sua dor e desconforto.
1. Procedimentos para animais
- Preparar e administrar os anestésicos e traçadores.
- Manter condições estéreis durante todo o estudo e esterilizar os instrumentos por autoclavagem. Divida os ratos em dois grupos.
NOTA: O grupo controle não foi tratado, e o outro grupo com ligadura unilateral do ducto SMG por 1 dia serviu como grupo experimental. Ao agrupar, camundongos com peso corporal e idade semelhantes precisam ser selecionados para reduzir a influência do peso e da idade na permeabilidade vascular. - Escolha traçadores apropriados, como o dextrano marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (peso molecular: 4 kDa; FD4) e dextrano marcado com rodamina B (peso molecular: 70 kDa; RD70) (ver Tabela de Materiais) com espectros distintos de excitação/emissão para minimizar a interferência entre os sinais de fluorescência (usando o filtro FITC ou rodamina B, respectivamente) para o ensaio de permeabilidade.
NOTA: Os comprimentos de onda de excitação de FD4 e RD70 são de 488 nm e 594 nm, respectivamente, e os comprimentos de onda de emissão selecionados são 511-564 nm e 617-669 nm, respectivamente. - Diluir os marcadores em solução salina estéril tamponada com fosfato (1x PBS) em reservas de 100 mg/ml e armazenar as alíquotas protegidas da luz a -20 °C.
NOTA: Dextran com um peso molecular como 4 kDa vazará rapidamente do sangue em SMGs de camundongos, mesmo sem condições patológicas10. - Por via intraperitoneal, injete o tribromoetanol (a dose para um rato de 25 g foi de cerca de 600 μL) para anestesiar os ratinhos. Fornecer analgesia conforme recomendado pelo comitê de ética animal local.
NOTA: Após a indução da anestesia, use pomada veterinária nos olhos para evitar a secura. Cuide bem dos animais11. Aguarde até que o rato tolere a estimulação mecânica, por exemplo, beliscar o dedo do pé sem resposta motora. - Injetar uma mistura de dois traçadores de permeabilidade paracelular com diferentes pesos moleculares (FD4 e RD70) na veia angular (0,5 mg/g de peso corporal). Injectar cada rato com uma mistura de solução traçadora de 100 μL, com 50 μL de cada corante misturado numa proporção de 1:1.
- Após a anestesia, segure suavemente a cabeça e o pescoço do rato para fazer com que um lado do globo ocular se projete ligeiramente. Insira uma seringa de insulina contendo marcadores fluorescentes (tenha cuidado para não introduzir ar na seringa) ao longo do canto do olho em ângulo reto com o olho.
NOTA: Se a veia angular for inserida corretamente, a solução de corante será facilmente injetada na veia e não haverá resistência durante a injeção. Além disso, a injeção de veia caudal em camundongos também pode ser candidata a moléculas traçadoras intravenosas.
- Após a anestesia, segure suavemente a cabeça e o pescoço do rato para fazer com que um lado do globo ocular se projete ligeiramente. Insira uma seringa de insulina contendo marcadores fluorescentes (tenha cuidado para não introduzir ar na seringa) ao longo do canto do olho em ângulo reto com o olho.
- Manter condições estéreis durante todo o estudo e esterilizar os instrumentos por autoclavagem. Divida os ratos em dois grupos.
- Execute o isolamento SMG seguindo as etapas abaixo.
NOTA: Use ferramentas estéreis, incluindo tesouras de tecido e níquel de separação, para a cirurgia.- Separe uma glândula unilateral cuidadosamente para não danificar os vasos sanguíneos e nervos circundantes sob um microscópio estereoscópico.
- Após a injeção de traçadores de permeabilidade paracelular, coloque rapidamente os ratos no papelão e coloque-os em decúbito dorsal com seus membros e cabeças adesivados. Aplique creme de depilação na pele do pescoço para remover o pelo do rato. Use etanol a 75% para desinfetar a pele antes da cirurgia.
- Em seguida, sob um estereomicroscópio, corte a epiderme do pescoço com tesoura de tecido geral para expor ambos os lados dos SMGs (a glândula direita foi tratada neste experimento). Em seguida, use um níquel de separação de tecido contundente (consulte Tabela de Materiais) para separar suavemente a cápsula da superfície da glândula, tomando cuidado para não danificar o tecido da glândula e os vasos sanguíneos.
- Separe a cápsula da superfície da glândula sem danificar a estrutura glandular. Além disso, certifique-se de que todo o processo de contenção do rato e separação da glândula seja realizado dentro de 10 minutos.
- Separe uma glândula unilateral cuidadosamente para não danificar os vasos sanguíneos e nervos circundantes sob um microscópio estereoscópico.
2. Configuração do microscópio de dois fótons
- Conecte o suporte personalizado ao dispositivo de pressão negativa e verifique se o efeito de pressão negativa é adequadamente alcançado com antecedência.
NOTA: O suporte tem a forma de uma lupa em miniatura com um pedaço plano de vidro redondo no centro (diâmetro: 4,32 mm, Figura 1). O dispositivo de pressão negativa foi projetado internamente de tal forma que o suporte é conectado a um tubo de borracha, que é ligado a uma garrafa de drenagem, e a garrafa é anexada ao controlador de pressão negativa através de um tubo de borracha curto. Desta forma, o controlador de pressão negativa pode ajustar a pressão para garantir que o tecido seja sugado para dentro do suporte.- Ligue um lado do suporte ao dispositivo de pressão negativa. Para testar se o dispositivo de pressão negativa está intacto e apropriado, vire o suporte de cabeça para baixo, adicione uma gota de água e defina o valor de pressão negativa para 20 unidades. Se a água for completa e rapidamente sugada, o dispositivo de pressão negativa é instalado com sucesso com o suporte.
- Coloque suavemente o SMG exposto do rato no suporte personalizado e sugue o tecido por sucção por pressão negativa o mais longe possível do corpo do rato para reduzir os artefatos de movimento causados pela respiração e outras condições.
- Fotografe o material de suporte anexado à glândula sob uma objetiva de imersão em água 25x/NA 1.0 (especial para NIR).
NOTA: Use um microscópio vertical de dois fótons (consulte Tabela de Materiais) neste experimento. Os vasos sanguíneos devem ser visíveis imediatamente com fluorescência óbvia após a injeção do traçador.
3. Imagem do vaso e detecção de permeabilidade
- Iniciar a imagem logo após a visão da glândula foi escolhida.
NOTA: Normalmente, séries temporais de 45-50 imagens em 20 s ou mais são geralmente capturadas dependendo do desenho experimental. - Adquira imagens sequenciais ao longo do eixo Z, separados por 2 μm, da superfície da glândula até 70-140 μm no tecido para gerar uma construção tridimensional (3D).
- Adquira imagens de lapso de tempo dos vasos para medir a permeabilidade vascular no SMG.
NOTA: Defina as condições do menu do programa da seguinte forma depois de executar o software do microscópio (consulte Tabela de materiais).- Na caixa de diálogo Explorer, clique em Adicionar Nova Pasta e altere o nome do arquivo.
- Volte para a coluna Aquisição . Em XY, o formato é 512 x 512 e a velocidade é 400 Hz. Ative o X bidirecional .
- Defina o fator Zoom como 0,75 e 1,5 para Zoom.
- Para adquirir imagens de lapso de tempo, selecione xyt em Modo de aquisição. Defina a duração para 20 s, 30 min ou mais, de acordo com a necessidade experimental.
- Para fazer a construção 3D, defina o Modo de Aquisição como xyz. O tamanho do Z-Step pode ser definido de acordo com a situação real.
- Depois de definir as condições, clique em Live para observar a imagem vascular de dois canais e canais sobrepostos no quadro de formação de fotos e escolha as áreas de interesse.
- Clique em Iniciar para iniciar a geração de imagens.
NOTA: O rato não deve ser deixado sem supervisão durante o processo de imagem durante a anestesia.
4. Análise dos dados
- Para avaliar a permeabilidade dos vasos, utilizar o software Image J para calcular a razão de intensidade de fluorescência de FD4 e RD70 entre os vasos externos e internos e denotá-los como intensidade extra e intravascular4.
NOTA: A alteração da permeabilidade vascular através do rastreamento do transporte de dextrans reflete a mudança na função da barreira endotelial. Além disso, observe a morfologia vascular e a densidade calculando o diâmetro e o número de alterações dos vasos.- Execute o software Image J (consulte Tabela de materiais).
- Clique em Arquivo e selecione Abrir para abrir as imagens dos vasos sanguíneos capturadas sob o microscópio de dois fótons.
- Selecione Imagem e defina Tipo como 16 bits para converter o formato da imagem.
- Selecione Analisar e selecione Área, Média, IntDen em Definir Medidas. Clique em OK para confirmar.
- Em Analisar, selecione Ferramentas, abra o Gerenciador de ROI e selecione Mostrar Tudo e Rótulos.
- Meça o valor da intensidade da fluorescência intravascular: clique na ferramenta de laço na interface principal para esboçar o contorno do vaso sanguíneo. Clique em Adicionar no Gerenciador de ROI. Siga esta etapa para continuar a selecionar vários vasos. Selecione todos os objetos do ROI Manager e clique em Medir.
- Meça o valor da intensidade total de fluorescência: contorne a imagem inteira, clique em Medir e o resultado é o valor da intensidade de fluorescência total da imagem.
- Calcule o valor da intensidade de fluorescência extravascular. Copie os dados para o Excel para cálculo. A razão de intensidade de fluorescência extravascular = (1 − valor de intensidade de fluorescência intravascular/valor de intensidade de fluorescência total) × 100%.
5. Aplicações a jusante
- Durante o experimento, calcule a taxa de fluxo sanguíneo medindo a distância que um glóbulo vermelho (mostrado como um ponto preto sob o microscópio de dois fótons)4 sofre em um período de tempo.
- Para visualizar o movimento das células sanguíneas através das células endoteliais, rotule as células sanguíneas por fluorescência. Em seguida, injete as células marcadas com fluorescência com FD4 ou RD70 através da veia da cauda do rato. Depois de circular por 5 min, rastreie as células interessadas por um período.
NOTA: Um total de 2 x 106 CFSE (carboxifluoresceína succinimidil éster, um corante fluorescente permeável à membrana) linfócitos marcados derivados do baço de camundongos doadores foram transferidos para receptores por injeção na veia da cauda, e a infiltração de linfócitos em SMGs foi investigada em modelos animais experimentais4.
6. Cuidados e recuperação dos animais
- Cuide bem dos animais durante todo o experimento.
NOTA: Certifique-se de que o animal que foi submetido à cirurgia não seja devolvido à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado durante o experimento. - Não deixe o animal sozinho até que ele recupere a consciência suficiente.
NOTA: Observe o estado respiratório dos ratos continuamente e mantenha-os aquecidos, colocando-os na almofada de aquecimento do animal. Fornecer alojamento de recuperação da dor pós-cirúrgica e analgesia, conforme recomendado pelo comitê de ética animal local.
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Representative Results
Seguindo o protocolo, o SMG unilateral foi anexado a um suporte personalizado, e a glândula foi mantida o mais longe possível do corpo do rato para evitar que a respiração causasse artefatos de movimento. O rápido fluxo dos glóbulos vermelhos (pontos pretos) nos vasos sanguíneos foi observado ao microscópio. Depois de encontrar o campo de tecido sob uma lente ocular, deve-se mudar para manipular o software do microscópio. No grupo controle, ambos os marcadores existiam nos vasos sanguíneos do camundongo SMG. Em particular, devido ao seu pequeno peso molecular, o FD4 foi capaz de vazar dos vasos sanguíneos para os lados basais dos ácinos e ductos, descrevendo claramente a forma dos ácinos e ductos (como A e D apontam na Figura 2A). Por outro lado, a dextrans com maiores pesos moleculares, como 40 kDa e 70 kDa, não conseguiu diferenciar a morfologia do SMG. De fato, o RD70 foi predominantemente distribuído em vasos sanguíneos e microvasos de grande porte. No grupo de ligadura do ducto, tanto o FD4 quanto o RD70 foram extravasados para os lados basais dos ácinos, o que indicou que a ligadura do ducto poderia interromper a função de barreira endotelial e, em seguida, aumentar a permeabilidade a moléculas grandes. Os resultados semiquantitativos da intensidade de fluorescência FD4 e RD70 também confirmaram os fenômenos acima (Figura 2B). Além disso, o diâmetro dos vasos sanguíneos foi aumentado, indicando que a ligadura do ducto por 1 dia induziu dilatação dos vasos sanguíneos. Além disso, as imagens 3D mostraram fluorescência muito mais obscurecida de FD4 e RD70 ao redor dos vasos sanguíneos no grupo ligadura (Figura 2C).
Figura 1: Um diagrama esquemático mostrando o suporte personalizado. O suporte tem a forma de uma lupa em miniatura com um pedaço plano de vidro redondo no centro (diâmetro: 4,32 mm). Um lado do suporte é conectado com o dispositivo de pressão negativa para sugar os tecidos sob o vidro, enquanto o outro lado do suporte está morto. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ensaio de permeabilidade vascular in vivo e imagens 3D de vasos sanguíneos em glândulas submandibulares de camundongos (SMGs). Os camundongos foram divididos em grupos controle e ligadura ductal. As glândulas unilaterais em ambos os grupos foram expostas e observadas. (A) O ensaio de permeabilidade vascular in vivo foi realizado injetando-se dextrano marcado com FITC (FD4) de 4 kDa e dextrano marcado com rodamina B com 70 kDa (RD70) na veia angular. As pontas de seta indicam as mudanças na distribuição de traçadores no SMG. A, acini. D, duto. Barra de escala = 100 μm. (B) Para a análise de semiquantificação das imagens acima, a intensidade de fluorescência, incluindo FD4 e RD70 dentro dos vasos sanguíneos (intravascular) e fora dos vasos sanguíneos (extravascular), foi medida pelo software Image J. (C) Imagens 3D de vasos sanguíneos e microvasos em SMG. As pontas de seta indicam as mudanças na distribuição de traçadores no SMG. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A manutenção e regulação da função de barreira endotelial são essenciais para a homeostase vascular. As células endoteliais e suas junções intercelulares desempenham um papel crítico na manutenção e controle da integridade vascular12. A força de cisalhamento do fluxo sanguíneo, fatores de crescimento e fatores inflamatórios podem causar alterações na permeabilidade vascular e, assim, participar da ocorrência e desenvolvimento de doenças sistêmicas como hipertensão, diabetes e doenças autoimunes13,14,15. A distribuição vascular e o fluxo sanguíneo da glândula salivar é um dos mais abundantes em todos os órgãos e tecidos, mas a pesquisa sobre o sistema vascular da glândula salivar não foi realizada amplamente. Uma compreensão mais profunda e abrangente dos vasos sanguíneos das glândulas salivares, particularmente a função de barreira endotelial, fornecerá novas pistas sobre o mecanismo da secreção salivar e promoverá a pesquisa em biologia vascular.
A técnica de varredura a laser in vivo de dois fótons pode quantificar a permeabilidade vascular por injeção intravenosa de corante fluorescente sem sacrificar o animal. A dextrans marcada com fluorescência com microesferas de diferentes pesos ou tamanhos moleculares pode avaliar melhor a extensão da lesão endotelial. Enquanto isso, a cinética dinâmica da permeabilidade vascular é determinada em tempo real usando o sistema de avaliação intravital da permeabilidade vascular. Outra vantagem é que é fácil distinguir os tipos de vasos sanguíneos, como arteríolas, vênulas e capilares16. Além disso, a destruição da barreira endotelial vascular e a migração de células imunes estão inevitavelmente ligadas à inflamação, mas há muitos estudos investigando um único fator, e poucos estudos se concentraram na conexão entre ambos os aspectos17,18. Uhl et al. estabeleceram recentemente um método de pesquisa para analisar o papel de diferentes fatores patogênicos em doenças das glândulas salivares, injetando dextrans marcados com fluorescência e anticorpos específicos de células imunes com diferentes marcadores fluorescentes simultaneamente in vivo19. Aqui, as células imunes marcadas com fluorescência também podem ser rastreadas através da injeção da veia da cauda para explorar a patogênese no modelo de trabalho atual. Portanto, o presente método experimental pode fornecer um sistema único para o estudo da interação entre o extravasamento de leucócitos e a integridade da barreira endotelial em modelos animais de doença SMG in vivo.
No entanto, não se deve ignorar que a capacidade de resposta dos ratos aos anestésicos é diferente, e quanto maior o tempo de imagem, maior o tempo de anestesia necessário e mais difícil é para os ratos se recuperarem. Portanto, este experimento é melhor usado para investigar quando nenhum experimento in vivo subsequente é necessário após a imagem. Além disso, outra limitação é que essa técnica não é adequada para experimentos com um longo período de tempo. Os Dextrans são solúveis em água e fáceis de metabolizar, resultando em fluorescência mais fraca com um tempo de imagem mais longo e, portanto, é melhor manter o tempo de imagem dentro de 30 minutos.
No total, o estudo se concentra na penetração de traçadores de permeabilidade paracelular e células de vasos sanguíneos e microvasos em tecidos glandulares e estabeleceu rigorosamente a microscopia dinâmica intravital de varredura a laser de dois fótons com contraste como um método avançado para medir a permeabilidade vascular para avaliar a função da barreira endotelial no SMG de camundongo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (bolsas 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 e 81974151) e pela Fundação de Ciências Naturais de Pequim (7202082 de subsídios).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
References
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