Summary
我们描述了如何生成啮齿动物肠缺血再灌注损伤 （IRI） 的广泛使用的手术模型。该手术包括闭塞肠系膜上动脉，然后恢复血流。该模型可用于调查兽医和人类医学中肠道 IRI 闭塞原因的研究。
Abstract
肠缺血再灌注损伤 （IRI） 与兽医和人类医学中的多种疾病有关。在狗和马等动物中观察到肠道 IRI 疾病，例如胃扩张扭转 （GDV）、肠系膜扭转和绞痛。血流的初始中断会导致组织缺血。虽然对于挽救活组织是必要的，但随后的再灌注可能会诱发进一步的损伤。IRI 的主要机制是再灌注和将氧气重新引入受损组织时形成自由基，但还涉及许多其他成分。由此产生的局部和全身效应往往预后不良。
在过去的 50 年中，肠道 IRI 一直是广泛研究的主题。暂时结扎肠系膜上动脉 （SMA） 底部的 体内 啮齿动物模型是目前用于研究肠 IRI 的最常用方法。在这里，我们描述了一种在 21% O2 医用空气中使用异氟醚麻醉的肠道 IRI 模型，该模型产生可重复的损伤，如小肠一致的组织病理学所证明的那样。还评估了结肠、肝脏和肾脏的组织损伤。
Introduction
缺血再灌注损伤 （IRI） 可发生在任何器官中，涉及两个连续组成部分。血流的初始停止会导致受影响的组织缺血，然后随后的再灌注会诱导进一步的细胞损伤。再灌注造成的损害通常超过缺血引起的损害 1.IRI 的病理生理学涉及一系列复杂的事件，其中最显着的是重新引入氧气时自由基的形成，这发生在再灌注期间 2。炎症细胞和细胞因子的活化也起着作用2.在肠道 IRI 病例中，内皮损伤后细菌易位到血液中可导致全身炎症反应综合征2。如果 IRI 造成的损害足够严重，由此产生的全身效应可导致多器官衰竭3.
肠道 IRI 病例与高发病率和死亡率相关 4,5,6。肠道IRI与兽医和人类医学中的许多病理状况和外科手术有关。在兽医学中，动物特别容易出现肠道 IRI 疾病，例如胃扩张扭转 （GDV）、肠系膜扭转和绞痛 7,8。在人类中，IRI 是腹主动脉瘤手术、绞窄性疝、急性肠系膜缺血、肠扭转、创伤、休克、新生儿坏死性小肠结肠炎和小肠切除或移植中主要且经常发生的问题9.
肠IRI的大多数体内啮齿动物研究涉及肠系膜上动脉（SMA）底部的闭塞，SMA是腹主动脉的分支，为大多数小肠和大肠的近端部分供血10,11,12。尽管该模型被广泛使用且相对简单，但在 21% O2 医用空气中使用吸入麻醉的详细方案尚未公布。缺乏标准方案给不熟悉该程序的研究人员带来了困难，并阻碍了研究之间的一致性。我们演示了在 8-14 周龄的雄性和雌性瑞士韦伯斯特小鼠中进行肠道 IRI 手术模型所需的步骤。这种肠道 IRI 模型产生可重复的损伤，如一致的组织病理学所示。
Protocol
此处描述的程序已获得美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所动物护理和使用委员会的批准，并符合《关于人道护理和使用实验动物的公共卫生服务政策》、《动物福利法》和《实验动物护理和使用指南》中概述的政策。
1. 手术设置
- 遵循无菌程序。戴上口罩、发套和干净的连身衣/实验室外套/手术磨砂膏。
- 准备以下消毒材料：手术器械（见 材料表）、生理盐水、棉签、纱布、手术钉、手术窗帘和手套。还要获得不需要消毒的手术胶带。使用高压灭菌器或环氧乙烷灭菌技术对材料进行灭菌。
- 在手术区域放置加热的循环水毯，并用无菌毛巾或窗帘盖住。
- 使用精密异氟醚汽化器、加压医用空气（21% O2）和带有专为小鼠设计的鼻锥的 Bain 非再呼吸回路以提供手术麻醉。
2.动物准备
- 通过以每升室容积0.5L / min的速率递送2%-4%异氟醚和21%O2 医用空气，在诱导室中麻醉小鼠。
注意：对于此特定型号，最好使用 21% O2 医用空气而不是 100% O2 ，因为用 O2 饱和血液可能会干扰 IRI。 - 将鼠标从腔室中取出，并将其移动到与手术区域分开的干净表面上。将其与鼻锥配合使用，提供 1.5% 异氟烷和 21% O2 医用空气。
- 皮下注射 1 mg/kg 丁丙诺啡到颈胸背侧区域。
- 腹膜内注射200-600IU/kg肝素，以防止闭塞期间血栓形成。
- 将眼药膏涂抹在眼睛上，以防止角膜损伤。
- 用剪刀去除腹腹的毛发。
- 将鼠标移动到手术区域的热水毯上。同样，将其与提供 1.5% 异氟醚和 21% O2 医用空气的鼻锥配合使用，以实现手术麻醉平面。
- 将鼠标置于背卧位置，并用手术胶带将四肢固定在桌子上。
- 使用啮齿动物专用温度计直肠监测动物的体温。在整个手术过程中将体温保持在36.5±0.5°C。
- 使用浸泡在洗必泰磨砂膏或聚维酮碘磨砂膏中的无菌纱布对腹腹腹部进行消毒，然后用 70% 酒精消毒。重复此序列三次，在磨砂膏和酒精之间交替进行。每次都应使用一套新的磨砂膏和酒精纱布。
- 以圆周运动涂抹磨砂膏和酒精，从手术部位中心的小圆圈开始，通过增加圆圈的大小逐渐向边缘移动。到达手术部位边缘后丢弃纱布。不要从边缘向后擦洗到中心。
- 进行脚趾捏合测试（踏板反射）以确保动物完全麻醉。
- 戴上无菌手套。无菌覆盖手术部位。
3.手术和缺血
- 使用 #15 手术刀刀片在皮肤上做一个 3-5 厘米的腹侧中线腹部切口，将其从下面的肌肉筋膜中解剖出来，并横向反射。使用显微解剖剪刀或弹簧式微型剪刀继续切口，沿着白线穿过腹壁，并将牵开器放置到位。
- 将蘸有温热无菌盐水的无菌纱布垫放在手术区域周围。
- 从腹腔中取出小肠，将其翻转到颅内并向动物左侧移动，然后将其放在湿润的垫子上。将另一个湿润的纱布垫放在纸巾上以防止干燥。定期将温热的无菌盐水滴在纱布上，以保持组织湿润。
- 分离 SMA，它位于下腔静脉的腹侧、腹腔动脉的尾部和肾动脉的颅内。
注意： 图 1 显示了 SMA 在手术过程中被隔离的位置。SMA通常位于下腔静脉的腹侧，并向右延伸。当肠道在手术过程中向外翻转并向左翻转时，SMA 位于下腔静脉的左侧。 - 在 SMA 底部放置一个无创伤微血管夹，使其从腹主动脉分支，确保夹子不会阻塞肠系膜上静脉。
- 通过注意颜色从粉红色到淡白色的变化以及肠系膜搏动的丧失来验证小肠缺血。
- 在缺血期间，将内脏恢复到腹腔内的原始位置。取下牵开器并用湿纱布覆盖切口。定期在纱布中加入温热的无菌生理盐水，以防止干燥并保持体温。
- 经过45分钟的缺血期（其开始以夹子的初始应用为标志），取下闭塞夹。通过观察肠系膜搏动和潮红颜色来验证血流的恢复。
- 在最终闭合之前腹膜内涂抹温热的无菌生理盐水，以保持适当的水合作用。
- 用 6-0 聚乳蛋白 910 缝合线闭合腹部肌肉。沿肌肉切口线给予布比卡因（高达 2 mg/kg）以缓解疼痛。用手术钉或伤口夹缝合皮肤。
4.恢复和再灌注
- 将鼠标放回循环水毯、暖手器或其他适当热源上的温暖室或笼子中。以每升腔室容积的流速输送 21% O2 ，流速为 0.5 L/min。让鼠标在这里恢复 90 分钟。每 5-10 分钟监测一次鼠标是否有疼痛或痛苦的迹象，例如驼背姿势、眯眼和不愿移动。
5. 安乐死和采血
- 在90分钟恢复期结束时，将小鼠返回诱导室，并以0.5L / min的腔室容积速率提供2%-4%异氟醚和21%O2 ，以重新诱导完全麻醉。
- 将动物转移回手术区域，并用鼻锥装上鼻锥，提供 2%-4% 异氟醚和 21% O2 以实现深度麻醉。
注意：CO2 不是此程序的合适安乐死方法，因为它会引起生理变化，这可能会干扰缺血性损伤或组织分析物13。 - 重新打开腹侧中线切口，并使用 23 G 针头和注射器从腹腔静脉收集尽可能多的血液，进行终末出血。预计收集 0.3-0.5 mL 血液（在接受 IRI 的小鼠中较少，在接受假剖腹手术的小鼠中更多）。
注意：终末出血的目的是帮助人道安乐死，并收集和保存血液以备将来检测（即血清化学、PCR、ELISA）。 - 采血后，腹主动脉被切断以允许完全放血。
- 进行颈椎脱位或开胸手术作为辅助措施，以确保成功安乐死。
6. 组织学组织处理
- 安乐死后，收集所需的组织。确保及时完成组织处理，因为自溶在死亡后立即开始14,15。
- 肠：收集小肠和大肠的整个长度。丢弃盲肠。
- 肝脏：收集左外侧叶、左正中叶和右正中叶。
- 肾脏：收集两个肾脏。按照惯例，在尸检时将左肾纵向切开，右肾作为横截面切开。
注意：结肠、肝脏和肾脏可用于评估 IRI 的多器官衰竭或其他全身影响。小肠用于评估原发性损伤。没有必要跟踪肝叶和肾脏的各个部分，因为每个器官都将作为一个单元进行分析和评分。然而，肠段应分开，然后单独标记和评分。
- 将肠道分为四个部分：十二指肠、空肠、回肠和结肠。确保三个小肠段的长度相等。通过将小肠折叠成“Z”形来做到这一点，其中顶线是十二指肠，中间线是空肠，底线是回肠。跟踪近端与远端很重要。
- 使用装有 20 G 血管导管的 10 mL 注射器用生理盐水冲洗肠段腔。
- 在切片之前，将每个肠段平放，管腔面朝上。使用贴有 27 G 针头的 3 mL 注射器，并大量滴加 10% 缓冲福尔马林以覆盖粘膜的整个长度。然后，将每个肠段单独滚动并放入单独的标记组织盒中。
- 要滚动，请将每个部分平放，管腔面朝上，然后绕牙签圆周滚动。近端部分应形成卷的内部。管腔应朝向内侧/中心。尽量轻柔地滚动，以免压缩绒毛。
- 卷起后，肠子应该看起来像瑞士卷。将瑞士卷螺旋面朝上放入盒内。
- 将组织放入装有10%缓冲福尔马林的标记小瓶中，以在室温下固定。过度固定总比固定不足好。小瓶应该很大，含有大量的福尔马林——至少比组织多 20 倍。
- 肠：将四个盒放在一起放在标本杯中。固定 24-48 小时。
- 肝脏：将肝叶一起放入 50 mL 锥形管中。固定 24-48 小时。
- 肾脏：将肾脏一起放入 50 mL 锥形管中。固定 48-72 小时。
注意：未修剪的肾脏比修剪的肾脏需要更长的时间来修复。为了将固定时间缩短至24-48小时，可以沿正中平面，纵向（左肾）和横向（右肾）切割肾脏，并在沉积在福尔马林之前放置在盒中。
- 将组织固定在福尔马林中指定时间后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）或蒸馏水冲洗，然后转移到装有70%EtOH的标记小瓶中。在等待组织学的同时，组织可以在室温下无限期地储存在 EtOH 中。
- 肠：将四个盒放在一起放在标本杯中。
- 肝脏：将肝叶一起放入 50 mL 锥形管中。
- 肾脏：将肾脏一起放入 50 mL 锥形管中。
- 准备好后，使用苏木精和伊红 （H&E） 染色将组织处理到载玻片上。修剪福尔马林固定的组织，然后将它们嵌入石蜡中。将五微米切片安装在载玻片上并用 H&E 染色。
7. 组织评分
- 组织评分最好由对样本组不知情的有经验的人员进行。
- 使用 Chiu/Park 评分系统对肠缺血进行评分17。
- 使用 Jablonski 评分系统18,19 对肾脏损伤进行评分。
- 使用铃木评分系统20,21对肝损伤进行评分。
注意：目前有许多评分系统用于评估肠道 IRI 啮齿动物模型中的组织损伤。本研究中使用的评分系统被选择，以尽量减少任意估计并最大限度地提高有意的定性评估（表1）。
Representative Results
我们在小鼠中展示了一种肠道IRI模型，该模型产生了一致且可重复的结果。对小肠、近端结肠、肾脏和肝脏进行切片并用 H&E 染色。兽医病理学家使用前面提到的评分系统对组织损伤进行分级（表 1）。使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后使用Tukey事后进行成对比较，以确定组内和组间的数据是否存在显着差异。小于或等于 0.05 的 p 值被认为是建立统计显著性的临界值。所有统计测试和图表都是在带有Real Statistics Resource Pack插件的电子表格软件（例如Microsoft Excel）中进行的。数据表示为均值±均值标准误差 （SEM）。
对于接受肠缺血再灌注损伤 （IRI） 的动物，三个小肠段（十二指肠、空肠和回肠）的显微镜病变评分显着增加;N = 7）与接受假剖腹手术的患者（Sham;N = 6）（图2 和 图3）。这些数据的标准误差很小，表明组内和组间结果的一致性。Sham 组的每个肠段产生完全相同的平均 Park/Chiu 评分，为 0.83。Sham组十二指肠、空肠和回肠的SEM分别为0.31、0.40和0.31。IRI组十二指肠、空肠和回肠的平均Park/Chiu评分分别为4.07±0.44、4.14±0.46和5.14±0.40。
在这项研究中，接受60分钟缺血和120分钟再灌注的初始小鼠中有50%（3/6）死亡（60/120组）。三只小鼠中有两只被送去进行尸检。两只小鼠都有小肠上皮坏死、充血和出血。此外，小鼠有淋巴细胞溶解症，这是一种与生理应激相关的非特异性变化。两只小鼠的心脏、肺、肝脏或肾脏都没有病变。将时间缩短至 45 分钟缺血和 90 分钟再灌注并加入 400 IU/kg 肝素（45/90/H 组）将死亡率降低至 20% （1/5），而不改变肠道损伤评分（图 4）。60/120 组的平均 Park/Chiu 评分为 4.56 ± 0.38 （N = 3），45/90/H 组的平均评分为 4.375 ± 0.38 （N = 4）。
在60/120小鼠或45/90/H小鼠中均未观察到表明近端结肠，肝脏和肾脏损伤的显微镜发现。
表 1：肠道、肾脏和肝脏的评分系统。 使用 Chiu/Park 系统对肠道损伤进行分级17.使用 Jablonski 评分系统对肾脏损伤进行分级18,19。使用铃木评分系统20,21 对肝损伤进行分级。此表根据 Quaedackers 等人 17、Du 等人 19 和 Behrends 等人 21 中提供的评分系统的许可进行了改编。请按此下载此表格。
图 1：肠系膜上动脉 （SMA） 的位置和隔离。 （A） 正常情况下，SMA 位于下腔静脉的腹侧，并向动物的右侧延伸。它位于腹腔动脉和肾动脉之间。此图经许可改编自玛格丽特·库克 （Margaret Cook） 的《实验室小鼠解剖学》（The Anatomy of the Laboratory Mouse）（1965）22。（B）在这个过程中，肠子被外化并向左翻转（在这张图片中用湿润的纱布覆盖），因此SMA（黄色箭头）位于下腔静脉（蓝色箭头）的左侧。缩写：RK = 右肾;D = 十二指肠。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：用苏木精和伊红染色的小肠段。 Sham组小鼠的空肠（A）和回肠（B）切片具有绒毛，绒毛长而薄，没有变形。IRI组小鼠的空肠（C）和回肠（D）切片具有坏死（星号）和出血区域，其余绒毛（箭头）变钝和变形。这些照片来自接受 45 分钟缺血和 90 分钟再灌注并接受 400 IU/kg 肝素的小鼠。照片以 20 倍放大倍率和 10% 变焦拍摄。比例尺 = 100 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：小肠段的 Park/Chiu 评分。 与接受假剖腹手术（Sham）的动物相比，接受肠缺血再灌注损伤（IRI）的动物对所有三个肠段（十二指肠、空肠和回肠）的微观损伤显着增加。* IRI 与 Sham 的 p < 0.05。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：接受 60 分钟缺血和 120 次再灌注的小肠与接受 400 IU/kg 肝素 45 分钟缺血和 90 分钟再灌注的小肠的 Park/Chiu 评分。 将时间从60分钟缺血和120分钟再灌注（60/120）减少到45分钟缺血和90分钟再灌注400IU / kg肝素（45/90 / H）在IRI组小鼠小肠的Park/Chiu损伤评分中没有统计学上的显着差异。然而，它确实将死亡率从50%降低到20%。 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
尽管这种肠道IRI模型被广泛使用，但它并非没有局限性。例如，仅阻塞SMA底部不会完全阻碍流向肠道的血液。这可能是由于肠系膜中广泛的侧支循环，它可以从腹主动脉的邻近分支抽血。在一项针对猫的研究中，SMA 闭塞使近端十二指肠的血流量减少了 35%，十二指肠远端减少了 61%，空肠和回肠减少了 71%，近端结肠减少了 63%。结肠中部和远端的血流量没有减少，结肠的大部分循环来自肠系膜下动脉23。在啮齿动物中，空肠和回肠最常被认为是 SMA 闭塞后发生最严重组织损伤的肠段9。
文献中引用了 SMA 闭塞后的广泛缺血时间，从 1 到 90 分钟或更长时间。不同的缺血时间导致不同程度的再灌注损伤;Park 等人观察到缺血间期在 40 至 60 分钟之间的再灌注损伤，但当缺血间期较短或较长时则未观察到再灌注损伤24。这些结果表明，较短的时间不会产生足够的缺血来诱发再灌注损伤，而较长的时间会严重损害组织，以至于无法证明随后的再灌注损伤。此外，较长的缺血时间会带来死亡率增加的风险。从我们的研究中可以看出，50%（3/6）的初始小鼠在再灌注90分钟后死亡。将缺血时间缩短至 45 分钟可将死亡率降低至 20% （1/5），而不会改变组织损伤评分。根据我们的研究，似乎可以通过 SMA 闭塞约 45 分钟达到理想的缺血性损伤窗口。
另一个变量是组织采集前的再灌注时间。与缺血时间一样，再灌注时间在不同研究中差异很大，从 60 分钟到 24 小时以上不等。几篇论文报道，肠粘膜在再灌注 2 至 3 小时时发生最大的形态学损伤，在 24 小时达到完全修复 25,26,27。在此 2 至 3 小时窗口之前收集组织可能无法捕获再灌注损伤的全部范围，而接近 24 小时收获的组织已经开始修复过程。我们最初选择了 120 分钟的再灌注时间，但后来改为 90 分钟以降低死亡率。这种变化没有改变组织损伤结果，表明从 2 到 3 小时窗口的 30 分钟偏差是可以接受的。
氧浓度也是IRI发展中的一个重要变量。Wilding等人发现，与接受21%O2的小鼠相比，用100%O2 递送异氟醚麻醉的小鼠由于肺不张而出现通气灌注不匹配。在同一项研究中，接受 100% O2 的大鼠出现急性呼吸性酸中毒和平均动脉压升高28。在诱发损伤（如 IRI）时，最好避免这种生理变化，因为损伤涉及许多全身因素。因此，21% O2 似乎比 100% O2 更适合作为异氟烷输送的载气。
在该方案中使用肝素有待商榷。众所周知，肝素具有抗凝和抗炎作用29。我们发现，从 60 分钟缺血和 120 分钟再灌注改为 45 分钟缺血和 90 分钟再灌注 400 IU/kg 肝素不会改变微观肠道损伤，但会降低死亡率。一种可能的解释是，肝素可以防止远处器官（如肺和脑）的致命血栓栓塞，但是我们没有通过对最初死亡的两只小鼠进行大体或显微镜检查来发现尸检的证据。在不使用肝素的情况下使用较短的缺血和再灌注时间可能同样有效降低死亡率。如果是这样的话，谨慎的做法是放弃使用肝素，以尽量减少对IRI的干扰。然而，在方案中包括肝素可能适合那些希望模拟 IRI 手术原因的患者，因为手术患者通常在围手术期接受肝素治疗。
异氟醚已被证明在肠道炎症和缺血的情况下具有组织保护作用，其使用可能会干扰临床相关的IRI模型30,31,32。然而，有机氟吸入剂（即异氟烷、七氟烷）是兽医和人类医学中常用的麻醉剂。此外，该方案所需的麻醉时间超过 120 分钟，因此吸入剂比需要重新给药的短效注射剂更合适。
近端结肠、肝脏或肾脏未见显微镜病变。缺乏微观变化可能是由于 90 至 120 分钟的再灌注时间相对较短。此外，近端结肠有来自肠系膜下动脉的血液供应。然而，缺乏可见的损伤并不能排除全身性损伤。逆转录定量聚合酶链反应 （RT-qPCR） 可能是通过测量炎症细胞因子（如 TNF-α）来证明全身损伤的更好方法。
多年来，已经开发了这种肠道 IRI 模型的几种变体。1990 年，Megison 等人证明，除 SMA 外，闭塞侧支血管可更一致地减少肠系膜血流量，但会增加死亡率33。最近的一项研究表明，与其在其底部闭塞 SMA，不如结扎其外周和侧支以诱导远端回肠缺血，从而产生可重复的损伤而不会死亡34。局部动脉分支的闭塞可确保最大程度的缺血，并且可以解决仅在其底部结扎 SMA 时看到的多灶性、节段性血流减少的问题。虽然这种模拟肠道 IRI 的替代方法可用于研究肠道 IRI 的局部组织效应，但尚不清楚它是否能准确模拟可能与肠道损伤相关的全身炎症和多器官衰竭。
SMA 闭塞并非适用于所有类型的肠道 IRI 模型。例如，非闭塞性肠系膜缺血的特征是心输出量减少引起的内脏灌注不足。因此，该技术对于研究由心肌梗死、充血性心力衰竭、主动脉瓣关闭不全或肾脏或肝脏疾病引起的肠道 IRI 不是最佳选择35。Kozar 等人报告说，SMA 闭塞是休克诱导的肠道 IRI 的临床相关模型36。虽然不太经济，但使用其他物种（如猪）可能比啮齿动物对某些肠道损伤状况进行建模有好处。Gonzalez 等人在 2014 年的一项综合综述描述了目前用于研究肠道 IRI 的动物模型9。
尽管有其局限性，但在其底部闭塞 SMA 的技术仍然是肠缺血最常用的啮齿动物模型之一 9。由于它只需要一个血管夹和一个基本设置，因此手术本身非常简单。它还会产生可重复的伤害，正如此处提供的数据所证明的那样。啮齿动物的SMA闭塞可以可靠地模拟肠道IRI的闭塞原因，并且可以在兽医和人类医学中具有实际应用。因此，我们在这里概述的程序必须始终如一地执行。
Disclosures
本文作者没有要披露的利益冲突。
Acknowledgments
该项目的资金由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所校内研究部提供。
我们要感谢詹姆斯·霍金斯博士的指导和支持。我们还要感谢 Mihai Oltean 博士和 Robert Linford 博士在定位肠系膜上动脉方面提供的帮助。我们要感谢 Patricia Carvalho Obeid Ellrich 博士、Claudio Correa Natalini 博士和 George Howell III 博士在制定本协议期间提供他们的专业知识。最后，我们要感谢 Stephen Wincovitch 在获取本文中精美的显微照片方面的帮助，以及 Alicia Olivier 博士帮助标记和渲染最终数字。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adson forceps | Roboz | RS-5236 | Surgical instrument |
| Alm retractor | Roboz | RS-6510 | Surgical instrument |
| Anesthesia machine | Datex-Ohmeda | Aestiva 5 | |
| Anesthesia: isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | Dose: 1-4%, INH |
| Angiocath 20 g x 2 | Smiths Medical | 5057 | Flushing intestines with saline and formalin |
| Atraumatic microvascular clip | Teleflex | 065100 | Surgical instrument |
| Buffered formalin 10% | Fisher Scientific | 23-245684 | Tissue fixation |
| Bupivicaine 0.25% | Hospira, Inc. | NDC 0409-1160-18 | Dose: up to 2 mg/kg drop-wise |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Dose: 1 mg/kg, SQ |
| Chlorhexidine scrub 2% | Vet One | 510083 | Surgical site prep |
| Circulating water blanket | Cincinnati Sub Zero | Blanketrol 2 | Body temp maintenance |
| Clippers - Wahl BravMini, Purple Hair clippers | Lambert Vet Supply | 008WA-41590-0438 | Surgical site prep |
| Conical tubes 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 | Tissue fixation and storage |
| Dry ice | N/A | N/A | PCR tissue samples |
| EtOH 200 proof | The Warner-Graham Company | 64-17-5 | Tissue storage |
| Heparin (optional) | Meitheal Pharmaceuticals | NDC 71288-402-11 | Dose: 200-600 IU/kg |
| Induction chamber | VetEquip | 941456 | |
| Indus Instruments THM100 Rodent Monitor | Indus Instruments | N/A | For monitoring rodent body temperature during surgery |
| Isopropyl Alcohol 70% | Humco | NDC 0395-4202-28 | For scrubbing surgical site |
| Microcentrifuge Tubes: 0.6mL | Fisher Scientific | 05-408-121 | PCR tissue samples. 8 per mouse, Terminal bleed collection, serum storage |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Nose cone | N/A | N/A | Can be homemade with syringe tube or bubble tubing |
| O2 medical air 21% | Roberts Oxygen | N/A | Rate: 0.5 L/min for each L chamber volume |
| Ophthalmic ointment | Akorn, Inc. | NDC 17478-062-35 | Surgical prep |
| PBS pH 7.4 (1x) | ThermoFisher Scientific | 10010-031 | For tissue rinsing and making 70% EtOH |
| Specimen cups | Cardinal Healthcare | C13005 | For holding tissue cassettes in formalin |
| Sterile Castroviejo Needle Holder | Roboz | RS-6412 | Surgical instrument |
| Sterile cotton swabs | Medline | BXTA50002Z | |
| Sterile gauze | Medline | PRM21423Z | |
| Sterile Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5980 | Surgical instrument |
| Sterile micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5693 | Surgical instrument |
| Sterile micro forceps | Roboz | RS-5264 | Surgical instrument |
| Sterile saline (0.9%) | Braun | R5201-01 | Must be warmed |
| Sterile scalpel blade #15 | Cardinal Health (Allegiance) | 32295-015 | Surgical instrument |
| Sterile scalpel handle | Roboz | RS-9843 | Surgical instrument |
| Sterile surgical drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Sterile surgical gloves | Medline | MSG2270 | |
| Sterile surgical stapler | Roboz | RS-9260 | Surgical instrument |
| Sterile surgical staples | Roboz | RS-9262 | Abdominal skin closure |
| Sterile suture: Vicryl (polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Needle | Ethicon | J212G | Closing abdominal muscle |
| Surgical tape | Medline | MMM15271Z | Securing mouse in dorsal recumbancy |
| Syringe 10 ml x 2 | Medline | SYR110010 | Flushing intestines with saline and formalin |
| Tissue cassettes | Fisher Scientific | 22-038-665 | Rolled intestinal segments. 4 per mouse. |
| Towel or drape | Medline | GEM2140 | Water blanket cover |
References
- Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Digestive Diseases and Sciences. 49, 1359-1377 (2004).
- Minguet, G., Joris, J., Lamy, M. Preconditioning and protection against ischaemia-reperfusion in non-cardiac organs: a place for volatile anaesthetics. European Journal of Anaesthesiology. 24 (9), 733-745 (2007).
- Cowled, P., Fitridge, R. Pathophysiology of reperfusion injury. Mechanisms of Vascular Disease: A Reference Book for Vascular Specialists. , University of Adelaide Press. 331-350 (2011).
- Grootjans, J., et al. Human intestinal ischemia-reperfusion-induced inflammation characterized: Experiences from a new translational model. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2283-2291 (2010).
- Sharp, C. R., Rozanski, E. A., Finn, E., Borrego, E. J. The pattern of mortality in dogs with gastric dilatation and volvulus. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 30 (2), 232-238 (2020).
- Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Veterinary Journal. 29 (6), 448-453 (1997).
- McMichael, M., Moore, R. M. Ischemia-reperfusion injury pathophysiology, part I. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 14 (4), 231-241 (2004).
- Kaneene, J. B., Ross, W. A., Miller, R. A. The Michigan equine monitoring system. II. Frequencies and impact of selected health problems. Preventive Veterinary Medicine. 29 (4), 277-292 (1997).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
- Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D'Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane post-conditioning protects against intestinal ischemia-reperfusion injury and multiorgan dysfunction via transforming growth factor-β1 generation. Annals of Surgery. 255 (3), 492-503 (2012).
- García, E. M. S. N., Taylor, J. H., Cenizo, N., Vaquero, C. Beneficial effects of intra-arterial and intravenous prostaglandin E1 in intestinal ischaemia-reperfusion injury. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 18 (4), 466-474 (2014).
- Liu, C., et al. Sevoflurane protects against intestinal ischemia-reperfusion injury partly by phosphatidylinositol 3 kinases/Akt pathway in rats. Surgery. 157 (5), 924-933 (2015).
- Shomer, N. H., et al.
- Diagnostic Necropsy and Tissue Harvest in Rodents. Lab Animal Research. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/v/10294/diagnostic-necropsy-and-tissue-harvest (2023).
- Scudamore, C. L. A Practical Guide to the Histology of the Mouse. , John Wiley and Sons. (2014).
- Scicchitano, M. S., et al. Preliminary comparison of quantity, quality, and microarray performance of RNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded, and unfixed frozen tissue samples. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (11), 1229-1237 (2006).
- Quaedackers, J. S. L. T., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplantation Proceedings. 32 (6), 1307-1310 (2000).
- Jablonski, P., et al. An experimental model for assessment of renal recovery from warm ischemia. Transplantation. 35 (3), 198-204 (1983).
- Du, H., et al. Hydrogen-rich saline attenuates acute kidney injury after liver transplantation via activating p53-mediated autophagy. Transplantation. 100 (3), 563-570 (2016).
- Suzuki, S., et al. The beneficial effect of a prostaglandin 12 analog on ischemic rat liver. Transplantation. 52 (6), 978-983 (1991).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Elsevier. (1965).
- Premen, A. J., et al. Importance of collateral circulation in the vascularly occluded feline intestine. Gastroenterology. 92 (5), 1215-1219 (1987).
- Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107 (5), 574-580 (1990).
- Guzmán-de La Garza, F. J., et al. Different patterns of intestinal response to injury after arterial, venous or arteriovenous occlusion in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (31), 3901-3907 (2009).
- Chang, J. X. Functional and morphological changes of the gut barrier during the restitution process after hemorrhagic shock. World Journal of Gastroenterology. 11 (35), 5485-5491 (2005).
- Illyes, G., Hamar, J. Sequence of morphological alterations in a small intestinal ischaemia/reperfusion model of the anesthetized rat. A light microscopy study. International Journal of Experimental Pathology. 73 (2), 161-172 (1992).
- Wilding, L. A., et al. Benefits of 21% oxygen compared with 100% oxygen for delivery of isoflurane to mice (Mus musculus) and rats (Rattus norvegicus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (2), 148-154 (2017).
- Ding, R., Zhao, D., Guo, R., Zhang, Z., Ma, X. Treatment with unfractionated heparin attenuates coagulation and inflammation in endotoxemic mice. Thrombosis Research. 128 (6), 160-165 (2011).
- Hayes, J. K., Havaleshko, D. M., Plachinta, R. V., Rich, G. F. Isoflurane pretreatment supports hemodynamics and leukocyte rolling velocities in rat mesentery during lipopolysaccharide-induced inflammation. Anesthesia and Analgesia. 98 (4), 999-1006 (2004).
- Miller, L. S., et al. Suppression of cytokine-lnduced neutrophil accumulation in rat mesenteric venules in vivo by general anesthesia. International Journal of Microcirculation. 16 (3), 147-154 (1996).
- Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D'Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane activates intestinal sphingosine kinase to protect against bilateral nephrectomy-induced liver and intestine dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 300 (1), 167-176 (2011).
- Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. The Journal of Surgical Research. 49 (2), 168-173 (1990).
- Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments. (111), 53881 (2016).
- Trompeter, M., Brazda, T., Remy, C. T., Vestring, T., Reimer, P. Non-occlusive mesenteric ischemia: Etiology, diagnosis, and interventional therapy. European Radiology. 12 (5), 1179-1187 (2002).
- Kozar, R. A., et al. Superior mesenteric artery occlusion models shock-induced gut ischemia-reperfusion. The Journal of Surgical Research. 116 (1), 145-150 (2004).
