Summary
Kemirgenlerde intestinal iskemi-reperfüzyon hasarının (IRI) yaygın olarak kullanılan bir cerrahi modelinin nasıl oluşturulacağını açıklıyoruz. Prosedür, superior mezenterik arterin tıkanmasını ve ardından kan akışının restorasyonunu içerir. Bu model, hem veterinerlik hem de insan tıbbında bağırsak IRI'sinin tıkayıcı nedenlerini araştıran çalışmalar için yararlıdır.
Abstract
İntestinal iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) hem veterinerlik hem de insan tıbbında sayısız durumla ilişkilidir. Köpekler ve atlar gibi hayvanlarda gastrik dilatasyon volvulus (GDV), mezenterik torsiyon ve kolik gibi bağırsak IRI durumları gözlenir. Kan akışının ilk kesilmesi, dokuların iskemik hale gelmesine neden olur. Canlı dokuyu kurtarmak için gerekli olmasına rağmen, sonraki reperfüzyon daha fazla yaralanmaya neden olabilir. IRI'den sorumlu ana mekanizma, reperfüzyon ve oksijenin hasarlı dokuya yeniden verilmesi üzerine serbest radikal oluşumudur, ancak ilgili birçok başka bileşen vardır. Ortaya çıkan lokal ve sistemik etkiler genellikle kötü bir prognoz sağlar.
Bağırsak IRI, son 50 yılda kapsamlı araştırmalara konu olmuştur. Superior mezenterik arterin (SMA) tabanının geçici olarak bağlandığı bir in vivo kemirgen modeli, şu anda bağırsak IRI'sini incelemek için kullanılan en yaygın yöntemdir. Burada, ince bağırsakların tutarlı histopatolojisi ile gösterildiği gibi, tekrarlanabilir hasara yol açan% 21 O2 tıbbi havada izofluran anestezisi kullanan bir bağırsak IRI modelini tanımladık. Kolon, karaciğer ve böbreklerde doku hasarı da değerlendirildi.
Introduction
İskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) herhangi bir organda ortaya çıkabilir ve iki ardışık bileşen içerir. Kan akışının başlangıçta kesilmesi, etkilenen dokuların iskemik hale gelmesine neden olur ve daha sonra reperfüzyon daha fazla hücre hasarına neden olur. Reperfüzyondan kaynaklanan hasar genellikle iskemi1'in neden olduğu hasarı aşar. IRI'nin patofizyolojisi, en dikkate değer olanı, reperfüzyon2 sırasında meydana gelen oksijenin yeniden verilmesi üzerine serbest radikal oluşumu olan karmaşık bir olaylar dizisi içerir. Enflamatuar hücrelerin ve sitokinlerin aktivasyonu da rol oynar2. Bağırsak IRI vakalarında, endotel hasarını takiben kan dolaşımına bakteriyel translokasyon, sistemik inflamatuar yanıt sendromuna yol açabilir2. IRI'ye bağlı hasar yeterince şiddetli ise, ortaya çıkan sistemik etkiler çoklu organ yetmezliğine yol açabilir3.
İntestinal IRI vakaları yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkilidir 4,5,6. Bağırsak IRI, hem veteriner hem de insan tıbbında birçok patolojik durum ve cerrahi prosedürle ilişkilidir. Veteriner hekimlikte hayvanlar özellikle gastrik dilatasyon volvulus (GDV), mezenterik torsiyon ve kolik 7,8 gibi bağırsak IRI koşullarına eğilimlidir. İnsanlarda IRI, abdominal aort anevrizması cerrahisi, boğulmuş fıtıklar, akut mezenterik iskemi, volvulus, travma, şok, neonatal nekrotizan enterokolit ve ince barsak rezeksiyonu veya transplantasyonunda önemli ve sık görülen bir sorundur9.
Bağırsak IRI'sinin in vivo kemirgen çalışmalarının çoğu, ince bağırsakların çoğuna ve kalın bağırsakların proksimal kısmına kan sağlayan abdominal aort dalı olan superior mezenterik arterin (SMA) tabanının tıkanmasını içerir 10,11,12. Bu modelin yaygın kullanımına ve göreceli basitliğine rağmen, %21 O2 medikal havada inhalan anestezi kullanan ayrıntılı bir protokol yayınlanmamıştır. Standart bir protokolün olmaması, prosedüre aşina olmayan araştırmacılar için zorluk yaratmakta ve çalışmalar arasında tutarlılığı engellemektedir. 8-14 haftalık erkek ve dişi Swiss Webster farelerinde bağırsak IRI'nin cerrahi modelini yürütmek için gerekli adımları gösteriyoruz. Bu bağırsak IRI modeli, tutarlı histopatoloji ile gösterildiği gibi tekrarlanabilir hasara neden olur.
Protocol
Burada açıklanan prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri'ndeki Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmeti Politikası, Hayvan Refahı Yasası ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda belirtilen politikalara uygundur.
1. Cerrahi kurulum
- Aseptik prosedürleri izleyin. Bir maske, saç örtüsü ve temiz tulum/laboratuvar önlüğü/cerrahi önlük giyin.
- Aşağıdaki sterilize edilmiş malzemeleri hazırlayın: cerrahi aletler (Malzeme Tablosuna bakınız), sıcak tuzlu su, pamuklu çubuklar, gazlı bez, cerrahi zımbalar, cerrahi örtüler ve eldivenler. Ayrıca sterilize edilmesi gerekmeyen cerrahi bant elde edin. Malzemeleri otoklav veya etilen oksit sterilizasyon teknikleriyle sterilize edin.
- Ameliyat alanına ısıtılmış bir sirkülasyonlu su battaniyesi yerleştirin ve steril bir havlu veya örtü ile örtün.
- Hassas bir izofluran buharlaştırıcı, basınçlı tıbbi hava (%21 O2) ve farelerin cerrahi anestezi sağlaması için tasarlanmış burun konisine sahip bir Bain yeniden solumayan devre kullanın.
2. Hayvan hazırlama
- Fareyi bir indüksiyon odasında, oda hacminin her litresi için 0,5 L/dak oranında %21O2 tıbbi hava ile %2-4 izofluran vererek uyuşturun.
NOT: Kanı O 2 ile doyurmak IRI'yi etkileyebileceğinden, bu özel model için %100 O2 yerine %21O 2 tıbbi hava kullanılması tercih edilir. - Fareyi hazneden çıkarın ve ameliyat alanından ayrılmış temiz bir yüzeye taşıyın. % 21 O2 tıbbi hava ile% 1.5 izofluran sağlayan bir burun konisi ile takın.
- Dorsal servikotorasik bölgeye deri altına 1 mg / kg buprenorfin enjekte edin.
- Oklüzyon döneminde trombüs oluşumunu önlemek için intraperitoneal olarak 200-600 IU/kg heparin enjekte edilir.
- Kornea hasarını önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün.
- Makas kullanarak ventral karındaki tüyleri alın.
- Fareyi ameliyat alanındaki ısıtılmış su battaniyesinin üzerine getirin. Yine, cerrahi bir anestezi düzlemi elde etmek için% 21O2 tıbbi hava ile% 1.5 izofluran sağlayan bir burun konisi ile takın.
- Fareyi sırt yaslanmış olarak konumlandırın ve uzuvları cerrahi bantla masaya sabitleyin.
- Kemirgenlere özgü bir termometre kullanarak hayvanın vücut ısısını rektal olarak izleyin. Ameliyat süresince vücut ısısını 36,5 ± 0,5 °C'de tutun.
- Klorheksidin fırçalama veya povidon-iyot fırçalama ile ıslatılmış steril gazlı bez ve ardından% 70 alkol kullanarak ventral karnı dezenfekte edin. Bu sırayı, fırçalama ve alkol arasında dönüşümlü olarak üç kez tekrarlayın. Her seferinde yeni bir kese ve alkollü gazlı bez seti kullanılmalıdır.
- Kese ve alkolü dairesel hareketlerle uygulayın, ameliyat bölgesinin ortasındaki küçük dairelerden başlayın ve dairelerin boyutunu artırarak yavaş yavaş kenarlara doğru çalışın. Ameliyat bölgesinin kenarına ulaşıldığında gazlı bezi atın. Kenardan merkeze doğru geriye doğru fırçalamayın.
- Hayvanın tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için bir ayak parmağı sıkışma testi (pedal refleksi) yapın.
- Steril eldiven giyin. Ameliyat bölgesini aseptik olarak örtün.
3. Cerrahi ve iskemi
- #15 neşter bıçağı kullanarak deride 3-5 cm'lik bir ventral orta hat karın kesisi yapın, alttaki kas fasyasından ayırın ve yanal olarak yansıtın. Mikro diseksiyon makası veya yaylı mikro makas kullanarak linea alba boyunca karın duvarı boyunca insizyona devam edin ve yerine bir ekartör yerleştirin.
- Ameliyat alanının etrafına ılık steril tuzlu su ile nemlendirilmiş steril gazlı bez pedleri yerleştirin.
- İnce bağırsağı karın boşluğundan çıkarın, kraniyal olarak ve hayvanın soluna çevirin ve nemli pedlerin üzerine yerleştirin. Kurumasını önlemek için dokuların üzerine başka bir nemli gazlı bez yerleştirin. Dokuları nemli tutmak için periyodik olarak gazlı bez üzerine ılık steril salin damlatın.
- İnferior vena kavaya ventral, çölyak artere kaudal ve renal artere kraniyal olarak bulunan SMA'yı izole edin.
NOT: Şekil 1 , SMA'nın ameliyat sırasında izole edildiği yeri göstermektedir. SMA normalde ventral olarak inferior vena kavaya uzanır ve sağa doğru uzanır. Ameliyat sırasında bağırsaklar dıştan dışa çevrilip sola çevrildiğinde, SMA inferior vena kavanın solunda yer alır. - SMA'nın tabanına, abdominal aorttan dallandığı yere atravmatik bir mikrovasküler klips yerleştirin ve klipsin superior mezenterik veni tıkamadığından emin olun.
- Pembeden soluk beyaza renk değişimini ve mezenterik nabız kaybını not ederek ince bağırsağın iskemisini doğrulayın.
- İç organları iskemik dönem boyunca karın boşluğu içindeki orijinal konumuna getirin. Ekartörü çıkarın ve insizyonu nemli gazlı bezle örtün. Kurumayı önlemek ve vücut ısısını korumak için gazlı beze periyodik olarak ılık steril salin ekleyin.
- 45 dakikalık bir iskemi döneminden sonra (başlangıcı klipsin ilk uygulamasıyla işaretlenir), tıkayıcı klipsi çıkarın. Mezenterik nabız ve kızarmış bir renk gözlemleyerek kan akışının restorasyonunu doğrulayın.
- Uygun hidrasyonu sağlamak için son kapatmadan hemen önce intraperitoneal olarak ılık steril salin uygulayın.
- Karın kaslarını 6-0 poliglaktin 910 sütür ile kapatın. Ağrıyı hafifletmek için kas insizyon hattı boyunca bupivakain (2 mg / kg'a kadar) uygulayın. Cildi cerrahi zımba veya yara klipsleri ile kapatın.
4. İyileşme ve reperfüzyon
- Fareyi sıcak bir odaya veya sirküle eden bir su battaniyesi, el ısıtıcısı veya başka bir uygun ısı kaynağı üzerindeki kafese geri koyun. Hazne hacminin her litresi için 0,5 L/dk akış hızında %21 O2 verin. Farenin burada 90 dakika iyileşmesine izin verin. Kambur duruş, gözlerini kısma ve hareket etme isteksizliği gibi ağrı veya sıkıntı belirtileri için fareyi her 5-10 dakikada bir izleyin.
5. Ötenazi ve kan alma
- 90 dakikalık iyileşme süresinin sonunda, fareyi indüksiyon odasına geri koyun ve tam anesteziyi yeniden indüklemek için 0,5 L / dak oda hacmi oranında% 21 O2 ile% 2 -% 4 izofluran verin.
- Hayvanı ameliyat alanına geri aktarın ve derin anestezi elde etmek için% 21O2 ile% 2 -% 4 izofluran sağlayan bir burun konisi ile takın.
NOT: CO2 , iskemik yaralanma veya doku analitlerine müdahale edebilecek fizyolojik değişikliklere neden olduğu için bu prosedür için uygun bir ötenazi yöntemi değildir13. - Ventral orta hat insizyonunu tekrar açın ve 23 G'lik bir iğne ve şırınga kullanarak abdominal vena kavadan mümkün olduğunca fazla kan toplayarak terminal kanama gerçekleştirin. 0.3-0.5 mL arasında kan toplamayı bekleyin (IRI geçiren farelerde daha az, sahte laparotomi uygulananlarda daha fazla).
NOT: Terminal kanamanın amacı, insancıl ötanaziye yardımcı olmak ve gelecekteki testler için kan toplamak ve korumaktır (yani, serum kimyası, PCR, ELISA). - Kan alımını takiben, abdominal aort tamamen kan kaybına izin vermek için kesilir.
- Başarılı bir ötenazi sağlamak için ikincil bir önlem olarak servikal çıkık veya torakotomi yapın.
6. Histoloji için doku işleme
- Ötenaziden sonra istenen dokuları toplayın. Otoliz ölümden hemen sonra başladığından doku işlemenin derhal yapıldığındanemin olun 14,15.
- Bağırsaklar: İnce bağırsağın ve kalın bağırsağın tüm uzunluğunu toplayın. Çekumu atın.
- Karaciğer: Sol lateral, sol medyan ve sağ medyan lobları toplayın.
- Böbrekler: Her iki böbreği de toplayın. Konvansiyonel olarak, sol böbrek uzunlamasına kesilir ve sağ nekropsi sırasında bir kesit olarak kesilir.
NOT: Kolon, karaciğer ve böbrekler, çoklu organ yetmezliğini veya IRI'nin diğer sistemik etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. İnce bağırsaklar birincil yaralanmayı değerlendirmek için kullanılır. Karaciğer lobu ve böbreklerin ayrı bölümlerini takip etmek gerekli değildir, çünkü her organ bir birim olarak analiz edilecek ve puanlanacaktır. Bununla birlikte, bağırsak bölümleri ayrı tutulmalı ve daha sonra ayrı ayrı etiketlenmeli ve puanlanmalıdır.
- Bağırsakları dört bölüme ayırın: duodenum, jejunum, ileum ve kolon. Üç ince bağırsak segmentinin eşit uzunlukta olduğundan emin olun. Bunu, ince bağırsakları üst çizginin duodenum, orta çizginin jejunum ve alt çizginin ileum olduğu "Z" şeklinde katlayarak yapın. Proksimal ve distal ucu takip etmek önemlidir.
- 20 G anjiyo-kateter ile yapıştırılmış 10 mL'lik bir şırınga kullanarak bağırsak segmentlerinin lümenini salinle yıkayın.
- Kesitler oluşturmadan önce, her bir bağırsak segmentini lümen tarafı yukarı bakacak şekilde düz bir şekilde yerleştirin. 27 G'lik bir iğne ile yapıştırılmış 3 mL'lik bir şırınga kullanarak ve mukozanın tüm uzunluğunu kaplamak için% 10 tamponlu formalini damla damla uygulayın. Ardından, her bir bağırsak segmentini ayrı ayrı yuvarlayın ve ayrı, etiketli doku kasetlerine yerleştirin.
- Yuvarlamak için, her bir parçayı lümen tarafı yukarı bakacak şekilde düz bir şekilde yatırın, ardından bir kürdan etrafında dairesel olarak yuvarlayın. Proksimal kısım rulonun iç kısmını oluşturmalıdır. Lümen içeriye/merkeze bakmalıdır. Villusun sıkışmasını önlemek için mümkün olduğunca nazikçe yuvarlamaya çalışın.
- Yuvarlandığında, bağırsak bir İsviçre rulosu gibi görünmelidir. İsviçre rulo spiralini yüzü yukarı bakacak şekilde kasetin içine yerleştirin.
- Dokuları, oda sıcaklığında sabitlemek için% 10 tamponlu formalin ile doldurulmuş etiketli şişelere yerleştirin. Aşırı sabitleme, az sabitlemeden daha iyidir. Şişeler bol formalin ile büyük olmalıdır - dokudan en az 20 kat daha fazla fiksatif.
- Bağırsaklar: Dört kaseti birlikte bir numune kabına yerleştirin. 24-48 saat için düzeltin.
- Karaciğer: Karaciğer loblarını 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. 24-48 saat için düzeltin.
- Böbrekler: Böbrekleri 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. 48-72 saat için düzeltin.
NOT: Kesilmemiş böbreklerin düzeltilmesi, kesilmiş böbreklere göre daha uzun sürer. Fiksasyon süresini 24-48 saate kısaltmak için, böbrekler medyan düzlem boyunca, uzunlamasına (sol böbrek) ve enine (sağ böbrek) kesilebilir ve formalin içinde biriktirilmeden önce kasetlere yerleştirilebilir.
- Dokular belirlenen süre boyunca formalin içinde sabitlendikten sonra, fosfat tamponlu salin (PBS) veya damıtılmış su ile durulayın ve% 70 EtOH ile doldurulmuş etiketli şişelere aktarın. Doku, histolojiyi beklerken oda sıcaklığında süresiz olarak EtOH'de saklanabilir.
- Bağırsaklar: Dört kaseti birlikte bir numune kabına yerleştirin.
- Karaciğer: Karaciğer loblarını 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.
- Böbrekler: Böbrekleri 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.
- Hazır olduğunda, dokuların hematoksilen ve eozin (H & E) boyaması kullanılarak cam slaytlara işlenmesini sağlayın. Formalinle sabitlenmiş dokuları kesin ve ardından bunları parafine gömün. Slaytlara beş mikronluk bölümler monte edin ve H & E ile boyayın.
7. Doku puanlaması
- Doku skorlaması tercihen örnek gruplarına kör olan deneyimli personel tarafından yapılmalıdır.
- Bağırsak iskemisi, Chiu/Park skorlama sistemi17 kullanılarak puanlanır.
- Böbrek hasarı, Jablonski puanlama sistemi18,19 kullanılarak puanlanır.
- Karaciğer hasarı, Suzuki puanlama sistemi20,21 kullanılarak puanlanır.
NOT: Bağırsak IRI'sinin kemirgen modellerinde doku hasarını değerlendirmek için şu anda kullanımda olan birçok puanlama sistemi vardır. Bu çalışmada kullanılan puanlama sistemleri, keyfi tahmini en aza indirecek ve kasıtlı nitel değerlendirmeyi en üst düzeye çıkaracak şekilde seçilmiştir (Tablo 1).
Representative Results
Farelerde tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar veren bir bağırsak IRI modeli gösterdik. İnce bağırsak, proksimal kolon, böbrekler ve karaciğer kesit alındı ve H&E ile boyandı. Bir veteriner patolog, daha önce bahsedilen skorlama sistemlerini kullanarak doku yaralanmasını derecelendirdi (Tablo 1). İstatistiksel analiz, tek faktörlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'in post hoc ve gruplar arası verilerde anlamlı bir fark olup olmadığını belirleyen ikili karşılaştırmalar kullanılarak gerçekleştirildi. 0.05'e eşit veya daha küçük bir p değeri, istatistiksel anlamlılık oluşturmak için sınır olarak kabul edildi. Tüm istatistiksel testler ve grafikler, Real Statistics Resource Pack eklentisi ile bir elektronik tablo yazılımında (örneğin, Microsoft Excel) gerçekleştirildi. Veriler, ortalamanın (SEM) ortalama ± standart hatası olarak sunulur.
İntestinal iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI; N = 7) sahte laparotomi (Sham; N = 6) (Şekil 2 ve Şekil 3). Bu veriler için standart hata dardı ve sonuçların gruplar içinde ve arasında tutarlılığını gösteriyordu. Sham grubundaki her bir bağırsak segmenti, 0.83'lük aynı ortalama Park / Chiu skorunu verdi. Sham grubunda duodenum, jejunum ve ileum için SEM sırasıyla 0.31, 0.40 ve 0.31 idi. IRI grubunda duodenum, jejunum ve ileum için ortalama Park/Chiu skorları sırasıyla 4.07 ± 0.44, 4.14 ± 0.46 ve 5.14 ± 0.40 idi.
Bu çalışmada, 60 dakika iskemi ve 120 dakika reperfüzyon (60/120 grubu) uygulanan ilk farelerin %50'si (3/6) öldü. Üç fareden ikisi nekropsi için gönderildi. Her iki farede de epitelyal nekroz, tıkanıklık ve ince bağırsakta kanama vardı. Ek olarak, farelerde fizyolojik stresle ilişkili spesifik olmayan bir değişiklik olan lenfositoliz vardı. Her iki farede de kalp, akciğer, karaciğer veya böbreklerde lezyonlar yoktu. Sürelerin 45 dk iskemi ve 90 dk reperfüzyona kısaltılması ve 400 IU/kg heparin (45/90/H grubu) eklenmesi intestinal yaralanma skorlarını değiştirmeden mortaliteyi %20'ye (1/5) düşürmüştür (Şekil 4). 60/120 grubu için ortalama Park/Chiu skoru 4.56 ± 0.38 (N=3), 45/90/H grubu için ortalama skor 4.375 ± 0.38 (N=4) idi.
Proksimal kolon, karaciğer ve böbrekte yaralanmayı gösteren mikroskobik bulgular ne 60/120 farelerde ne de 45/90 / H farelerde görülmedi.
Tablo 1: Bağırsaklar, böbrekler ve karaciğer için skorlama sistemleri. Bağırsak hasarı Chiu/Park sistemi17 kullanılarak derecelendirildi. Böbrek hasarı Jablonski skorlama sistemi18,19 kullanılarak derecelendirildi. Karaciğer hasarı, Suzuki puanlama sistemi20,21 kullanılarak derecelendirildi. Bu tablo, Quaedackers ve ark.17, Du ve ark.19 ve Behrends ve ark.21'de sunulan puanlama sistemlerinden alınan izinlerle uyarlanmıştır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 1: Superior mezenterik arterin (SMA) yeri ve izolasyonu. (A) Normalde, SMA inferior vena kavaya ventral olarak uzanır ve hayvanın sağına doğru uzanır. Çölyak arter ile renal arter arasında yer alır. Bu şekil, Margaret Cook'un (1965) The Anatomy of the Laboratory Mouse (Laboratuvar Faresinin Anatomisi) adlı kitabının izniyle uyarlanmıştır.22. (B) Bu prosedürde, bağırsaklar dışlanır ve sola çevrilir (bu resimde nemli gazlı bezle kaplıdır), böylece SMA (sarı ok) inferior vena kava'nın (mavi ok) solunda yer alır. Kısaltmalar: RK = sağ böbrek; D = onikiparmak bağırsağı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hematoksilen ve eozin ile boyanmış ince bağırsak segmentleri. Sham grubundaki farelerden jejunum (A) ve ileum (B) bölümleri, bozulma olmadan uzun ve ince olan villuslara sahipti. IRI grubundaki farelerden jejunum (C) ve ileum (D) kesitleri, kalan villusların (oklar) künteleşmesi ve bozulması ile nekroz (yıldız) ve kanama alanları içeriyordu. Fotoğraflar, 45 dakika iskemi ve 90 dakika reperfüzyon uygulanan ve 400 IU / kg heparin alan farelerden alınmıştır. Fotoğraflar %10 yakınlaştırma ile 20x büyütme ile çekilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İnce bağırsak segmentleri için Park/Chiu skorları. Bağırsak iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) geçiren hayvanlar için üç bağırsak segmentinin (duodenum, jejunum ve ileum) mikroskobik hasarı, sahte laparotomi (Sham) uygulananlara kıyasla önemli ölçüde artmıştır. * p < Sham'a karşı IRI için 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 60 dakika iskemi ve 120 reperfüzyon geçiren ince bağırsaklar için 45 dakika iskemi ve 400 IU / kg heparin ile 90 dakika reperfüzyon için Park / Chiu skorları. 60 dk iskemi ve 120 dk reperfüzyondan (60/120) 45 dk iskemi ve 400 IU/kg heparin (45/90/H) ile 90 dk reperfüzyona düşürülmesi, IRI grubundaki farelerin ince bağırsaklarının Park/Chiu yaralanma skorlarında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yaratmadı. Bununla birlikte, ölüm oranını %50'den %20'ye düşürdü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu bağırsak IRI modelinin yaygın kullanımına rağmen, sınırlamaları da vardır. Örneğin, SMA'nın sadece tabanının tek başına tıkanması, bağırsağa giden kan akışını tamamen engellemez. Bu muhtemelen, abdominal aortun komşu dallarından kan alabilen mezenterdeki geniş kollateral dolaşımdan kaynaklanmaktadır. Kedilerde yapılan bir çalışmada, SMA oklüzyonu proksimal duodenumda kan akışını %35, distal duodenumda %61, jejunum ve ileumda %71 ve proksimal kolonda %63 oranında azaltmıştır. Kan akışı, dolaşımlarının çoğunu inferior mezenterik arterden alan orta ve distal kolonda azalmadı23. Kemirgenlerde, jejunum ve ileum en sık SMA oklüzyonunu takiben en önemli doku hasarına neden olan bağırsak segmentleri olarak gösterilir9.
Literatürde SMA oklüzyonu sonrası 1 ila 90 dakika veya daha fazla olan çok çeşitli iskemi süreleri belirtilmiştir. Farklı iskemik zamanlar, farklı seviyelerde reperfüzyon hasarına neden olur; Park ve ark. iskemik aralık 40 ila 60 dakika arasında olduğunda reperfüzyon hasarı gözlemledi, ancak iskemik aralık daha kısa veya daha uzun olduğunda gözlemlemedi24. Bu sonuçlar, daha kısa sürelerin reperfüzyon hasarını tetiklemek için yeterli iskemi üretmediğini, daha uzun sürelerin ise dokuya o kadar ciddi hasar verdiğini ve ardından gelen reperfüzyon hasarını göstermenin imkansız olduğunu göstermektedir. Ek olarak, daha uzun iskemik süreler artmış mortalite riski taşır. Çalışmamızda görüldüğü gibi, 60 dakikalık iskemi geçiren ilk farelerin% 50'si (3/6) sadece 90 dakikalık reperfüzyondan sonra öldü. İskemi süresinin 45 dakikaya indirilmesi, doku yaralanma skorlarını değiştirmeden mortaliteyi %20'ye (1/5) düşürdü. Çalışmamıza dayanarak, ideal iskemik hasar penceresinin yaklaşık 45 dakika boyunca SMA oklüzyonu ile elde edilebileceği görülmektedir.
Diğer bir değişken ise doku toplanmadan önceki reperfüzyon süresidir. İskemi zamanlarında olduğu gibi, reperfüzyon süreleri 60 dakikadan 24 saate kadar çalışmalara göre büyük farklılıklar gösterir. Birkaç makale, bağırsak mukozasının reperfüzyondan 2 ila 3 saat sonra maksimum morfolojik hasara maruz kaldığını ve 24 saat 25,26,27'de tam onarımın sağlandığını bildirmiştir. Bu 2 ila 3 saatlik pencereden önce doku toplamak, reperfüzyon hasarının tam boyutunu yakalayamama riski taşırken, 24 saate yakın bir zamanda toplanan dokular onarım sürecini çoktan başlatmış olacaktır. Başlangıçta 120 dakikalık bir reperfüzyon süresi seçtik, ancak daha sonra mortaliteyi azaltmak için 90 dakikaya geçtik. Bu değişiklik, doku hasarı sonuçlarını değiştirmedi, bu da 2 ila 3 saatlik pencereden 30 dakikalık bir sapmanın kabul edilebilir olduğunu düşündürdü.
Oksijen konsantrasyonu da IRI gelişiminde önemli bir değişkendir. Wilding ve ark. %21 O2 alan farelere kıyasla, %100 O2 ile verilen izofluran ile anestezi uygulananların atelektazi nedeniyle ventilasyon-perfüzyon uyumsuzluğu yaşadığını bulmuşlardır. Aynı çalışmada,% 100O2 alan sıçanlarda akut solunum asidozu ve yüksek ortalama arter basıncı28 gelişti. Bu tür fizyolojik değişiklikler, bir dizi sistemik faktörün dahil olduğu IRI gibi bir yaralanmaya neden olurken en iyi şekilde önlenir. Bu nedenle, izofluran iletimi için taşıyıcı gaz olarak% 21O2 ,% 100O2'den daha uygun görünmektedir.
Bu protokolde heparin kullanımı tartışmaya açıktır. Heparinin anti-pıhtılaştırıcı ve anti-inflamatuar etkileri olduğu bilinmektedir29. 60 dk iskemi ve 120 dk reperfüzyondan 45 dk iskemi ve 90 dk reperfüzyon ile 400 IU/kg heparin değişiminin mikroskobik intestinal hasarı değiştirmediğini, ancak mortaliteyi düşürdüğünü bulduk. Olası bir açıklama, heparinin akciğerler ve beyin gibi uzak organlara ölümcül tromboembolizmi önlediğidir, ancak ölen ilk iki farenin brüt veya mikroskobik incelemesiyle nekropsi üzerinde bunun kanıtını bulamadık. Heparin olmadan daha kısa iskemi ve reperfüzyon sürelerinin kullanılması, mortaliteyi azaltmada aynı derecede etkili olabilir. Eğer durum buysa, IRI ile etkileşimi en aza indirmek için heparin kullanımından vazgeçmek ihtiyatlı olacaktır. Bununla birlikte, cerrahi hastalar genellikle perioperatif olarak heparin aldığından, IRI'nin cerrahi nedenlerini modellemek isteyenler için protokole heparin dahil edilmesi uygun olabilir.
İzofluranın bağırsak iltihabı ve iskemi vakalarında doku koruyucu etkileri olduğu gösterilmiştir ve kullanımı klinik olarak anlamlı bir IRI modeli30,31,32 ile etkileşime girebilir. Bununla birlikte, organoflorin inhalanları (yani, izofluran, sevofluran) hem veterinerlik hem de insan tıbbında yaygın olarak kullanılan anesteziklerdir. Ek olarak, bu protokol için gereken anestezi süresi 120 dakikayı aşmaktadır ve bu nedenle bir inhalan, yeniden dozlanması gereken daha kısa etkili bir enjekte edilebilir maddeden daha uygundur.
Proksimal kolon, karaciğer veya böbrekte mikroskobik lezyon yoktu. Mikroskobik değişikliklerin olmaması belki de nispeten kısa 90 ila 120 dakikalık reperfüzyon süresinden kaynaklanıyordu. Ek olarak, proksimal kolon inferior mezenterik arterden kan akışına sahiptir. Bununla birlikte, görünür hasarın olmaması sistemik yaralanmayı dışlamaz. Ters transkripsiyon-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR), TNF-α gibi inflamatuar sitokinleri ölçerek sistemik hasarı göstermek için muhtemelen daha iyi bir metodolojidir.
Bu bağırsak IRI modelinin çeşitli varyasyonları yıllar içinde geliştirilmiştir. 1990'da Megison ve ark. SMA'ya ek olarak kollateral damarların tıkanmasının mezenterik kan akışında daha tutarlı bir azalma sağladığını, ancak mortalite oranında bir artış sağladığını göstermiştir33. Daha yakın tarihli bir çalışma, SMA'yı tabanında tıkamak yerine, distal ileumda iskemiyi indüklemek için periferik ve kollateral dallarını bağlamanın mortalite olmaksızın tekrarlanabilir yaralanmaya yol açtığını göstermiştir34. Lokal arteriyel dalların tıkanması maksimal iskemi sağlar ve SMA'nın hemen tabanında bağlanmasıyla görülen kan akışında multifokal, segmental azalma sorununu çözebilir. Bağırsak IRI'sini modellemek için bu alternatif yöntem, bağırsak IRI'sinin lokal doku etkilerini araştırmak için uygulamaya sahip olsa da, bağırsak hasarı ile ilişkili olabilecek sistemik inflamasyonu ve çoklu organ yetmezliğini doğru bir şekilde modelleyip modelleyemeyeceği bilinmemektedir.
SMA oklüzyonu her tip bağırsak IRI için uygun bir model değildir. Örneğin, tıkayıcı olmayan mezenterik iskemi, azalmış kardiyak debiden kaynaklanan splanknik hipoperfüzyon ile karakterizedir. Bu nedenle, bu teknik, miyokard enfarktüsü, konjestif kalp yetmezliği, aort yetmezliği veya böbrek veya karaciğer hastalığının neden olduğu bağırsak IRI'sini incelemek için uygun olmayacaktır35. Kozar ve ark. SMA oklüzyonunun şok36 ile indüklenen bağırsak IRI için klinik olarak anlamlı bir model olduğunu bildirmiştir. Daha az ekonomik olmasına rağmen, domuzlar gibi diğer türlerin kullanımı, belirli bağırsak yaralanma durumlarını modellemek için kemirgenlere göre fayda sağlayabilir. 2014 yılında Gonzalez ve ark. tarafından yapılan kapsamlı bir inceleme, bağırsak IRI9'u araştırmak için şu anda kullanımda olan hayvan modellerini açıklamaktadır.
Sınırlamalarına rağmen, SMA'yı tabanında tıkama tekniği, bağırsak iskemisi9'un en sık kullanılan kemirgen modellerinden biri olmaya devam etmektedir. Sadece bir damar kelepçesi ve temel bir kurulum gerektirdiğinden, ameliyatın kendisi oldukça basittir. Ayrıca, burada sunulan verilerle kanıtlandığı gibi, tekrarlanabilir yaralanmalara da neden olur. Kemirgenlerde SMA oklüzyonu, bağırsak IRI'sinin tıkayıcı nedenlerini güvenilir bir şekilde modelleyebilir ve hem veterinerlik hem de insan tıbbında pratik uygulamalara sahip olabilir. Bu nedenle, burada ana hatlarıyla belirttiğimiz prosedürlerin tutarlı bir şekilde yürütülmesi önemlidir.
Disclosures
Bu makalenin yazarlarının ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu projenin finansmanı, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü İntramural Araştırma Bölümü tarafından sağlandı.
Dr. James Hawkins'e mentorluğu ve desteği için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Mihai Oltean ve Robert Linford'a superior mezenterik arterin yerini belirlemedeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu protokolün geliştirilmesi sırasında uzmanlıklarını sağlayan Dr. Patricia Carvalho Obeid Ellrich, Claudio Correa Natalini ve George Howell III'e teşekkürlerimizi sunarız. Son olarak, bu yazıda yer alan güzel fotomikrografların elde edilmesindeki yardımları için Stephen Wincovitch'e ve son rakamların etiketlenmesi ve işlenmesindeki yardımları için Dr. Alicia Olivier'e teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adson forceps | Roboz | RS-5236 | Surgical instrument |
| Alm retractor | Roboz | RS-6510 | Surgical instrument |
| Anesthesia machine | Datex-Ohmeda | Aestiva 5 | |
| Anesthesia: isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | Dose: 1-4%, INH |
| Angiocath 20 g x 2 | Smiths Medical | 5057 | Flushing intestines with saline and formalin |
| Atraumatic microvascular clip | Teleflex | 065100 | Surgical instrument |
| Buffered formalin 10% | Fisher Scientific | 23-245684 | Tissue fixation |
| Bupivicaine 0.25% | Hospira, Inc. | NDC 0409-1160-18 | Dose: up to 2 mg/kg drop-wise |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Dose: 1 mg/kg, SQ |
| Chlorhexidine scrub 2% | Vet One | 510083 | Surgical site prep |
| Circulating water blanket | Cincinnati Sub Zero | Blanketrol 2 | Body temp maintenance |
| Clippers - Wahl BravMini, Purple Hair clippers | Lambert Vet Supply | 008WA-41590-0438 | Surgical site prep |
| Conical tubes 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 | Tissue fixation and storage |
| Dry ice | N/A | N/A | PCR tissue samples |
| EtOH 200 proof | The Warner-Graham Company | 64-17-5 | Tissue storage |
| Heparin (optional) | Meitheal Pharmaceuticals | NDC 71288-402-11 | Dose: 200-600 IU/kg |
| Induction chamber | VetEquip | 941456 | |
| Indus Instruments THM100 Rodent Monitor | Indus Instruments | N/A | For monitoring rodent body temperature during surgery |
| Isopropyl Alcohol 70% | Humco | NDC 0395-4202-28 | For scrubbing surgical site |
| Microcentrifuge Tubes: 0.6mL | Fisher Scientific | 05-408-121 | PCR tissue samples. 8 per mouse, Terminal bleed collection, serum storage |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Nose cone | N/A | N/A | Can be homemade with syringe tube or bubble tubing |
| O2 medical air 21% | Roberts Oxygen | N/A | Rate: 0.5 L/min for each L chamber volume |
| Ophthalmic ointment | Akorn, Inc. | NDC 17478-062-35 | Surgical prep |
| PBS pH 7.4 (1x) | ThermoFisher Scientific | 10010-031 | For tissue rinsing and making 70% EtOH |
| Specimen cups | Cardinal Healthcare | C13005 | For holding tissue cassettes in formalin |
| Sterile Castroviejo Needle Holder | Roboz | RS-6412 | Surgical instrument |
| Sterile cotton swabs | Medline | BXTA50002Z | |
| Sterile gauze | Medline | PRM21423Z | |
| Sterile Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5980 | Surgical instrument |
| Sterile micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5693 | Surgical instrument |
| Sterile micro forceps | Roboz | RS-5264 | Surgical instrument |
| Sterile saline (0.9%) | Braun | R5201-01 | Must be warmed |
| Sterile scalpel blade #15 | Cardinal Health (Allegiance) | 32295-015 | Surgical instrument |
| Sterile scalpel handle | Roboz | RS-9843 | Surgical instrument |
| Sterile surgical drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Sterile surgical gloves | Medline | MSG2270 | |
| Sterile surgical stapler | Roboz | RS-9260 | Surgical instrument |
| Sterile surgical staples | Roboz | RS-9262 | Abdominal skin closure |
| Sterile suture: Vicryl (polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Needle | Ethicon | J212G | Closing abdominal muscle |
| Surgical tape | Medline | MMM15271Z | Securing mouse in dorsal recumbancy |
| Syringe 10 ml x 2 | Medline | SYR110010 | Flushing intestines with saline and formalin |
| Tissue cassettes | Fisher Scientific | 22-038-665 | Rolled intestinal segments. 4 per mouse. |
| Towel or drape | Medline | GEM2140 | Water blanket cover |
References
- Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Digestive Diseases and Sciences. 49, 1359-1377 (2004).
- Minguet, G., Joris, J., Lamy, M. Preconditioning and protection against ischaemia-reperfusion in non-cardiac organs: a place for volatile anaesthetics. European Journal of Anaesthesiology. 24 (9), 733-745 (2007).
- Cowled, P., Fitridge, R. Pathophysiology of reperfusion injury. Mechanisms of Vascular Disease: A Reference Book for Vascular Specialists. , University of Adelaide Press. 331-350 (2011).
- Grootjans, J., et al. Human intestinal ischemia-reperfusion-induced inflammation characterized: Experiences from a new translational model. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2283-2291 (2010).
- Sharp, C. R., Rozanski, E. A., Finn, E., Borrego, E. J. The pattern of mortality in dogs with gastric dilatation and volvulus. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 30 (2), 232-238 (2020).
- Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Veterinary Journal. 29 (6), 448-453 (1997).
- McMichael, M., Moore, R. M. Ischemia-reperfusion injury pathophysiology, part I. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 14 (4), 231-241 (2004).
- Kaneene, J. B., Ross, W. A., Miller, R. A. The Michigan equine monitoring system. II. Frequencies and impact of selected health problems. Preventive Veterinary Medicine. 29 (4), 277-292 (1997).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
- Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D'Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane post-conditioning protects against intestinal ischemia-reperfusion injury and multiorgan dysfunction via transforming growth factor-β1 generation. Annals of Surgery. 255 (3), 492-503 (2012).
- García, E. M. S. N., Taylor, J. H., Cenizo, N., Vaquero, C. Beneficial effects of intra-arterial and intravenous prostaglandin E1 in intestinal ischaemia-reperfusion injury. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 18 (4), 466-474 (2014).
- Liu, C., et al. Sevoflurane protects against intestinal ischemia-reperfusion injury partly by phosphatidylinositol 3 kinases/Akt pathway in rats. Surgery. 157 (5), 924-933 (2015).
- Shomer, N. H., et al.
- Diagnostic Necropsy and Tissue Harvest in Rodents. Lab Animal Research. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/v/10294/diagnostic-necropsy-and-tissue-harvest (2023).
- Scudamore, C. L. A Practical Guide to the Histology of the Mouse. , John Wiley and Sons. (2014).
- Scicchitano, M. S., et al. Preliminary comparison of quantity, quality, and microarray performance of RNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded, and unfixed frozen tissue samples. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (11), 1229-1237 (2006).
- Quaedackers, J. S. L. T., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplantation Proceedings. 32 (6), 1307-1310 (2000).
- Jablonski, P., et al. An experimental model for assessment of renal recovery from warm ischemia. Transplantation. 35 (3), 198-204 (1983).
- Du, H., et al. Hydrogen-rich saline attenuates acute kidney injury after liver transplantation via activating p53-mediated autophagy. Transplantation. 100 (3), 563-570 (2016).
- Suzuki, S., et al. The beneficial effect of a prostaglandin 12 analog on ischemic rat liver. Transplantation. 52 (6), 978-983 (1991).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Elsevier. (1965).
- Premen, A. J., et al. Importance of collateral circulation in the vascularly occluded feline intestine. Gastroenterology. 92 (5), 1215-1219 (1987).
- Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107 (5), 574-580 (1990).
- Guzmán-de La Garza, F. J., et al. Different patterns of intestinal response to injury after arterial, venous or arteriovenous occlusion in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (31), 3901-3907 (2009).
- Chang, J. X. Functional and morphological changes of the gut barrier during the restitution process after hemorrhagic shock. World Journal of Gastroenterology. 11 (35), 5485-5491 (2005).
- Illyes, G., Hamar, J. Sequence of morphological alterations in a small intestinal ischaemia/reperfusion model of the anesthetized rat. A light microscopy study. International Journal of Experimental Pathology. 73 (2), 161-172 (1992).
- Wilding, L. A., et al. Benefits of 21% oxygen compared with 100% oxygen for delivery of isoflurane to mice (Mus musculus) and rats (Rattus norvegicus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (2), 148-154 (2017).
- Ding, R., Zhao, D., Guo, R., Zhang, Z., Ma, X. Treatment with unfractionated heparin attenuates coagulation and inflammation in endotoxemic mice. Thrombosis Research. 128 (6), 160-165 (2011).
- Hayes, J. K., Havaleshko, D. M., Plachinta, R. V., Rich, G. F. Isoflurane pretreatment supports hemodynamics and leukocyte rolling velocities in rat mesentery during lipopolysaccharide-induced inflammation. Anesthesia and Analgesia. 98 (4), 999-1006 (2004).
- Miller, L. S., et al. Suppression of cytokine-lnduced neutrophil accumulation in rat mesenteric venules in vivo by general anesthesia. International Journal of Microcirculation. 16 (3), 147-154 (1996).
- Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D'Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane activates intestinal sphingosine kinase to protect against bilateral nephrectomy-induced liver and intestine dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 300 (1), 167-176 (2011).
- Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. The Journal of Surgical Research. 49 (2), 168-173 (1990).
- Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments. (111), 53881 (2016).
- Trompeter, M., Brazda, T., Remy, C. T., Vestring, T., Reimer, P. Non-occlusive mesenteric ischemia: Etiology, diagnosis, and interventional therapy. European Radiology. 12 (5), 1179-1187 (2002).
- Kozar, R. A., et al. Superior mesenteric artery occlusion models shock-induced gut ischemia-reperfusion. The Journal of Surgical Research. 116 (1), 145-150 (2004).
