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Modello di roditore di danno da ischemia-riperfusione intestinale attraverso l'occlusione dell'arteria mesenterica superiore

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/64314
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3
1Animal Surgery and Resources Core, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2College of Veterinary Medicine, Mississippi State University, 3Division of Veterinary Resources, Office of Research Services, National Institutes of Health

Summary

Descriviamo come generare un modello chirurgico ampiamente utilizzato di danno da ischemia-riperfusione intestinale (IRI) nei roditori. La procedura prevede l'occlusione dell'arteria mesenterica superiore seguita dal ripristino del flusso sanguigno. Questo modello è utile per gli studi che indagano le cause occlusive dell'IRI intestinale sia in medicina veterinaria che umana.

Abstract

Il danno da ischemia-riperfusione intestinale (IRI) è associato a una miriade di condizioni sia in medicina veterinaria che umana. Condizioni IRI intestinali, come il volvolo di dilatazione gastrica (GDV), la torsione mesenterica e le coliche, sono osservate in animali come cani e cavalli. Un'interruzione iniziale del flusso sanguigno provoca l'ischemizzazione dei tessuti. Sebbene sia necessaria per salvare il tessuto vitale, la successiva riperfusione può indurre ulteriori lesioni. Il principale meccanismo responsabile dell'IRI è la formazione di radicali liberi in seguito alla riperfusione e alla reintroduzione dell'ossigeno nel tessuto danneggiato, ma ci sono molti altri componenti coinvolti. Gli effetti locali e sistemici che ne derivano spesso impartiscono una prognosi infausta.

L'IRI intestinale è stata oggetto di ricerche approfondite negli ultimi 50 anni. Un modello di roditore in vivo in cui la base dell'arteria mesenterica superiore (SMA) è temporaneamente legata è attualmente il metodo più comune utilizzato per studiare l'IRI intestinale. Qui, descriviamo un modello di IRI intestinale che utilizza l'anestesia con isoflurano in aria medica al 21% di O2 che produce lesioni riproducibili, come dimostrato da un'istopatologia coerente dell'intestino tenue. Il danno tissutale è stato valutato anche nel colon, nel fegato e nei reni.

Introduction

Il danno da ischemia-riperfusione (IRI) può verificarsi in qualsiasi organo e coinvolge due componenti sequenziali. Un'iniziale cessazione del flusso sanguigno fa sì che i tessuti colpiti diventino ischemici e quindi la successiva riperfusione induce ulteriori lesioni cellulari. Il danno da riperfusione spesso supera quello causato dall'ischemia1. La fisiopatologia dell'IRI coinvolge una complessa cascata di eventi, il più notevole dei quali è la formazione di radicali liberi in seguito alla reintroduzione dell'ossigeno, che si verifica durante la riperfusione2. Anche l'attivazione delle cellule infiammatorie e delle citochine svolge un ruolo2. Nei casi di IRI intestinale, la traslocazione batterica nel flusso sanguigno a seguito di un danno endoteliale può portare alla sindrome da risposta infiammatoria sistemica2. Se il danno dovuto all'IRI è abbastanza grave, gli effetti sistemici risultanti possono portare a insufficienza multiorgano3.

I casi di IRI intestinale sono associati ad elevata morbilità e mortalità 4,5,6. L'IRI intestinale è associata a molte condizioni patologiche e procedure chirurgiche sia in medicina veterinaria che umana. In medicina veterinaria, gli animali sono particolarmente inclini a condizioni IRI intestinali, come il volvolo di dilatazione gastrica (GDV), la torsione mesenterica e le coliche 7,8. Nell'uomo, l'IRI è un problema importante e frequente nella chirurgia dell'aneurisma dell'aorta addominale, nelle ernie strozzate, nell'ischemia mesenterica acuta, nel volvolo, nel trauma, nello shock, nell'enterocolite necrotizzante neonatale e nella resezione o trapianto dell'intestino tenue9.

La maggior parte degli studi in vivo sui roditori dell'IRI intestinale comporta l'occlusione della base dell'arteria mesenterica superiore (SMA), il ramo dell'aorta addominale che fornisce sangue alla maggior parte dell'intestino tenue e alla porzione prossimale dell'intestino crasso 10,11,12. Nonostante l'uso diffuso e la relativa semplicità di questo modello, non è stato pubblicato un protocollo dettagliato che utilizza l'anestesia inalante in aria medicale al 21% di O2 . La mancanza di un protocollo standard pone difficoltà ai ricercatori che non hanno familiarità con la procedura e impedisce la coerenza tra gli studi. Dimostriamo i passaggi necessari per condurre il modello chirurgico di IRI intestinale in topi Webster maschi e femmine di 8-14 settimane. Questo modello di IRI intestinale produce lesioni riproducibili, come dimostrato da un'istopatologia coerente.

Protocol

Le procedure qui descritte sono state approvate dal National Heart, Lung, and Blood Institute Animal Care and Use Committee presso il National Institutes of Health e sono conformi alle politiche delineate nella Politica del Servizio Sanitario Pubblico sulla Cura e l'Uso Umano degli Animali da Laboratorio, dalla Legge sul Benessere degli Animali e dalla Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio.

1. Configurazione chirurgica

  1. Seguire procedure asettiche. Indossa una maschera, una copertura per capelli e una tuta/camice da laboratorio/camice chirurgico puliti.
  2. Preparare i seguenti materiali sterilizzati: strumenti chirurgici (vedi Tabella dei materiali), soluzione salina calda, cotton fioc, garze, graffette chirurgiche, teli chirurgici e guanti. Procurati anche del nastro chirurgico, che non ha bisogno di essere sterilizzato. Sterilizzare i materiali con tecniche di sterilizzazione in autoclave o con ossido di etilene.
  3. Posizionare una coperta riscaldata per la circolazione dell'acqua nell'area chirurgica e coprirla con un asciugamano o un telo sterile.
  4. Utilizzare un vaporizzatore di precisione per isoflurano, aria medicale pressurizzata (21% O2 ) e un circuito di non respirazione Bain con un cono nasale progettato per i topi per fornire l'anestesia chirurgica.

2. Preparazione dell'animale

  1. Anestetizzare il topo in una camera a induzione erogando isoflurano al 2%-4% con il 21% di O2 aria medicale alla velocità di 0,5 L/min per ogni litro di volume della camera.
    NOTA: È preferibile utilizzare aria medicale al 21% di O2 rispetto al 100% di O2 per questo particolare modello, poiché saturare il sangue con O2 può interferire con l'IRI.
  2. Rimuovere il mouse dalla camera e spostarlo su una superficie pulita separata dall'area chirurgica. Dotato di un cono nasale che eroga l'1,5% di isoflurano con il 21% di aria medicale O2 .
  3. Iniettare 1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea nell'area cervico-toracica dorsale.
  4. Iniettare 200-600 UI/kg di eparina per via intraperitoneale per prevenire la formazione di trombi durante il periodo di occlusione.
  5. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire danni alla cornea.
  6. Rimuovere i peli dall'addome ventrale usando un tagliacapelli.
  7. Sposta il mouse sulla coperta d'acqua riscaldata nell'area chirurgica. Ancora una volta, montalo con un cono nasale che eroga l'1,5% di isoflurano con il 21% di aria medica O2 per ottenere un piano chirurgico di anestesia.
  8. Posizionare il topo in decubito dorsale e fissare gli arti al tavolo con del nastro chirurgico.
  9. Monitora la temperatura corporea dell'animale per via rettale utilizzando un termometro specifico per roditori. Mantenere la temperatura corporea a 36,5 ± 0,5 °C per tutta la durata dell'intervento.
  10. Disinfettare l'addome ventrale utilizzando una garza sterile imbevuta di scrub alla clorexidina o scrub allo iodio povidone, seguita da alcol al 70%. Ripeti questa sequenza tre volte, alternando lo scrub e l'alcool. Ogni volta è necessario utilizzare un nuovo set di scrub e garze imbevute di alcol.
    1. Applicare lo scrub e l'alcool con movimenti circolari, iniziando con piccoli cerchi al centro del sito chirurgico e procedendo gradualmente verso i bordi aumentando le dimensioni dei cerchi. Scartare la garza una volta raggiunto il bordo del sito chirurgico. Non strofinare all'indietro dal bordo al centro.
  11. Eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi (riflesso del pedale) per assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato.
  12. Indossare guanti sterili. Drappeggiare asetticamente il sito chirurgico.

3. Chirurgia e ischemia

  1. Praticare un'incisione addominale ventrale di 3-5 cm sulla linea mediana nella pelle utilizzando una lama di bisturi #15, sezionarla per liberarla dalla fascia muscolare sottostante e rifletterla lateralmente. Continuare l'incisione attraverso la parete addominale lungo la linea alba utilizzando forbici da micro dissezione o microforbici a molla e posizionare un divaricatore.
  2. Posizionare garze sterili inumidite con soluzione salina sterile calda intorno all'area operatoria.
  3. Rimuovere l'intestino tenue dalla cavità addominale, capovolgerlo cranialmente e alla sinistra dell'animale e posizionarlo sui cuscinetti inumiditi. Metti un'altra garza inumidita sui tessuti per evitare l'essiccazione. Far gocciolare periodicamente una soluzione salina sterile calda sulla garza per mantenere umidi i tessuti.
  4. Isolare la SMA, che si trova ventrale alla vena cava inferiore, caudale all'arteria celiaca e craniale all'arteria renale.
    NOTA: La Figura 1 mostra la posizione della SMA in cui è isolata durante l'intervento chirurgico. La SMA si trova normalmente ventrale alla vena cava inferiore e si estende verso destra. Quando l'intestino viene esteriorizzato e capovolto a sinistra durante l'intervento chirurgico, la SMA si trova a sinistra della vena cava inferiore.
  5. Posizionare una clip microvascolare atraumatica attraverso la base della SMA nel punto in cui si dirama dall'aorta addominale, assicurandosi che la clip non occluda la vena mesenterica superiore.
  6. Verificare l'ischemia dell'intestino tenue notando il cambiamento di colore dal rosa al bianco pallido e la perdita di pulsazione mesenterica.
  7. Riportare i visceri nella loro posizione originale all'interno della cavità addominale per tutta la durata del periodo ischemico. Rimuovere il divaricatore e coprire l'incisione con una garza umida. Aggiungere periodicamente soluzione salina sterile calda alla garza per prevenire l'essiccazione e mantenere la temperatura corporea.
  8. Dopo un periodo di ischemia di 45 minuti (il cui inizio è segnato dall'applicazione iniziale della clip), rimuovere la clip occludente. Verificare il ripristino del flusso sanguigno osservando una pulsazione mesenterica e un colore arrossato.
  9. Applicare soluzione salina sterile calda per via intraperitoneale appena prima della chiusura finale per mantenere un'adeguata idratazione.
  10. Chiudere i muscoli addominali con una sutura 6-0 polyglactin 910. Somministrare bupivacaina (fino a 2 mg/kg) lungo la linea di incisione muscolare per alleviare il dolore. Chiudere la pelle con graffette chirurgiche o clip per ferite.

4. Recupero e riperfusione

  1. Rimetti il mouse in una camera calda o in una gabbia su una coperta d'acqua circolante, uno scaldamani o un'altra fonte di calore appropriata. Erogare il 21% di O2 a una portata di 0,5 L/min per ogni litro di volume della camera. Lascia che il mouse si riprenda qui per 90 min. Monitora il mouse ogni 5-10 minuti per segni di dolore o angoscia, come postura curva, strabismo e riluttanza a muoversi.

5. Eutanasia e prelievo di sangue

  1. Al termine del periodo di recupero di 90 minuti, riportare il topo nella camera di induzione e somministrare isoflurano al 2%-4% con O21 % 2 a una velocità di 0,5 L/min di volume della camera per indurre nuovamente l'anestesia completa.
  2. Trasferire l'animale nell'area chirurgica e adattarlo con un cono nasale che eroga isoflurano al 2%-4% con il 21% di O2 per ottenere un'anestesia profonda.
    NOTA: La CO2 non è un metodo di eutanasia appropriato per questa procedura, in quanto induce cambiamenti fisiologici che possono interferire con il danno ischemico o gli analiti tissutali13.
  3. Riaprire l'incisione della linea mediana ventrale ed eseguire un'emorragia terminale raccogliendo quanto più sangue possibile dalla vena cava addominale utilizzando un ago da 23 G e una siringa. Aspettatevi di raccogliere tra 0,3 e 0,5 mL di sangue (meno nei topi che hanno subito IRI, di più in quelli che hanno ricevuto una laparotomia fittizia).
    NOTA: Lo scopo dell'emorragia terminale è quello di favorire l'eutanasia umana e di raccogliere e conservare il sangue per test futuri (ad esempio, chimica del siero, PCR, ELISA).
  4. Dopo il prelievo di sangue, l'aorta addominale viene recisa per consentire il dissanguamento completo.
  5. Eseguire la lussazione cervicale o la toracotomia come misura secondaria per garantire il successo dell'eutanasia.

6. Processamento tissutale per istologia

  1. Dopo l'eutanasia, raccogliere i tessuti desiderati. Assicurarsi che l'elaborazione dei tessuti sia eseguita tempestivamente, poiché l'autolisi inizia immediatamente dopo la morte14,15.
    1. Intestino: Raccogli l'intera lunghezza dell'intestino tenue e dell'intestino crasso. Scartare l'intestino cieco.
    2. Fegato: raccogli i lobi laterale sinistro, mediano sinistro e mediano destro.
    3. Reni: raccogli entrambi i reni. Per convenzione, il rene sinistro viene tagliato longitudinalmente e il destro viene tagliato come sezione trasversale al momento dell'autopsia.
      NOTA: Il colon, il fegato e i reni possono essere utilizzati per valutare l'insufficienza multiorgano o altri effetti sistemici dell'IRI. L'intestino tenue viene utilizzato per valutare la lesione primaria. Non è necessario tenere traccia delle singole sezioni del lobo epatico e dei reni, poiché ogni organo verrà analizzato e valutato come un'unità. I segmenti intestinali, tuttavia, devono essere tenuti separati e quindi etichettati e valutati individualmente.
  2. Dividi l'intestino in quattro sezioni: duodeno, digiuno, ileo e colon. Assicurarsi che i tre segmenti dell'intestino tenue siano della stessa lunghezza. Fallo piegando l'intestino tenue a forma di "Z", dove la linea superiore è il duodeno, la linea centrale è il digiuno e la linea inferiore è l'ileo. È importante tenere traccia dell'estremità prossimale rispetto a quella distale.
  3. Sciacquare il lume dei segmenti intestinali con soluzione fisiologica utilizzando una siringa da 10 mL applicata con un angio-catetere da 20 G.
  4. Prima di fare le sezioni, appoggiare ogni segmento intestinale in piano con il lato luminale rivolto verso l'alto. Utilizzando una siringa da 3 ml fissata con un ago da 27 G e applicare generosamente formalina tamponata al 10% goccia a goccia per rivestire l'intera lunghezza della mucosa. Quindi, arrotolare ogni segmento intestinale individualmente e posizionarlo in cassette di tessuto separate ed etichettate.
    1. Per arrotolare, stendere ogni segmento con il lato luminale rivolto verso l'alto, quindi arrotolare circonferenzialmente attorno a uno stuzzicadenti. La porzione prossimale dovrebbe formare la parte interna del rotolo. Il lume deve essere rivolto verso l'interno/il centro. Cerca di arrotolare il più delicatamente possibile per evitare di comprimere i villi.
    2. Una volta arrotolato, l'intestino dovrebbe assomigliare a un rotolo svizzero. Posizionare la spirale del rotolo svizzero rivolta verso l'alto all'interno della cassetta.
  5. Mettere i fazzoletti in fiale etichettate riempite con formalina tamponata al 10% per fissarli a temperatura ambiente. Fissare troppo è meglio che fissare poco. Le fiale devono essere grandi con molta formalina, almeno 20 volte più fissativa del tessuto.
    1. Intestino: Mettere le quattro cassette insieme in una coppetta per campioni. Fissare per 24-48 h.
    2. Fegato: Mettere insieme i lobi del fegato in una provetta conica da 50 ml. Fissare per 24-48 h.
    3. Reni: Mettere i reni insieme in una provetta conica da 50 ml. Fissare per 48-72 h.
      NOTA: I reni non tagliati richiedono più tempo per essere riparati rispetto ai reni tagliati. Per ridurre il tempo di fissazione a 24-48 ore, i reni possono essere tagliati lungo il piano mediano, longitudinalmente (rene sinistro) e trasversalmente (rene destro), e posti in cassette prima di essere depositati nella formalina.
  6. Dopo che i tessuti sono stati fissati in formalina per il tempo designato, risciacquare con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o acqua distillata e trasferire in flaconcini etichettati riempiti con EtOH al 70%. Il tessuto può essere conservato nell'EtOH a tempo indeterminato a temperatura ambiente in attesa dell'istologia.
    1. Intestino: Mettere le quattro cassette insieme in una coppetta per campioni.
    2. Fegato: Mettere insieme i lobi del fegato in una provetta conica da 50 ml.
    3. Reni: Mettere i reni insieme in una provetta conica da 50 ml.
  7. Una volta pronti, i tessuti vengono trattati su vetrini utilizzando la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E). Tagliare i tessuti fissati in formalina e poi incorporarli nella paraffina. Montare sezioni da cinque micron sui vetrini e colorare con H&E.

7. Punteggio tissutale

  1. Il punteggio tissutale deve essere eseguito preferibilmente da personale esperto che non è in grado di riconoscere i gruppi di campioni.
  2. L'ischemia intestinale viene valutata utilizzando il sistema di punteggio di Chiu/Park17.
  3. Il danno renale viene valutato utilizzando il sistema di punteggio Jablonski 18,19.
  4. Il danno epatico viene valutato utilizzando il sistema di punteggio Suzuki20,21.
    NOTA: Ci sono molti sistemi di punteggio attualmente in uso per valutare il danno tissutale nei modelli di IRI intestinale dei roditori. I sistemi di punteggio utilizzati in questo studio sono stati selezionati per ridurre al minimo le stime arbitrarie e per massimizzare la valutazione qualitativa intenzionale (Tabella 1).

Representative Results

Abbiamo dimostrato un modello di IRI intestinale nei topi che ha prodotto risultati coerenti e riproducibili. L'intestino tenue, il colon prossimale, i reni e il fegato sono stati sezionati e colorati con H&E. Un patologo veterinario ha classificato la lesione tissutale utilizzando i sistemi di punteggio precedentemente menzionati (Tabella 1). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando l'analisi a fattore singolo della varianza (ANOVA) seguita dal post hoc di Tukey con confronti a coppie, che ha determinato se c'era o meno una differenza significativa nei dati all'interno e tra i gruppi. Un valore p inferiore o uguale a 0,05 è stato considerato il limite per stabilire la significatività statistica. Tutti i test statistici e i grafici sono stati eseguiti in un software per fogli di calcolo (ad esempio, Microsoft Excel) con l'add-on Real Statistics Resource Pack. I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM).

I punteggi microscopici delle lesioni dei tre segmenti intestinali tenue (duodeno, digiuno e ileo) sono risultati significativamente aumentati per gli animali sottoposti a danno da ischemia-riperfusione intestinale (IRI; N = 7) rispetto a quelli sottoposti a laparotomia fittizia (Sham; N = 6) (Figura 2 e Figura 3). L'errore standard per questi dati è stato limitato, dimostrando la coerenza dei risultati all'interno e tra i gruppi. Ogni segmento intestinale nel gruppo Sham ha prodotto lo stesso identico punteggio medio di Park/Chiu di 0,83. Il SEM per il duodeno, il digiuno e l'ileo nel gruppo Sham era rispettivamente 0,31, 0,40 e 0,31. I punteggi medi di Park/Chiu per il duodeno, il digiuno e l'ileo nel gruppo IRI erano rispettivamente 4,07 ± 0,44, 4,14 ± 0,46 e 5,14 ± 0,40.

In questo studio, il 50% (3/6) dei topi iniziali sottoposti a ischemia di 60 minuti e riperfusione di 120 minuti (gruppo 60/120) è morto. Due dei tre topi sono stati sottoposti a necroscopia. Entrambi i topi presentavano necrosi epiteliale, congestione ed emorragia dell'intestino tenue. Inoltre, i topi presentavano linfocitolisi, un cambiamento non specifico associato allo stress fisiologico. Nessuno dei due topi presentava lesioni al cuore, ai polmoni, al fegato o ai reni. Accorciando i tempi a 45 minuti di ischemia e 90 minuti di riperfusione e aggiungendo 400 UI/kg di eparina (gruppo 45/90/H) si è abbassata la mortalità al 20% (1/5) senza modificare i punteggi di danno intestinale (Figura 4). Il punteggio medio di Park/Chiu per il gruppo 60/120 è stato di 4,56 ± 0,38 (N = 3) e il punteggio medio per il gruppo 45/90/H è stato di 4,375 ± 0,38 (N = 4).

Risultati microscopici indicativi di lesioni nel colon prossimale, nel fegato e nei reni non sono stati osservati né nei topi 60/120 né nei topi 45/90/H.

Tabella 1: Sistemi di punteggio per l'intestino, i reni e il fegato. Il danno intestinale è stato classificato utilizzando il sistema Chiu/Park17. Il danno renale è stato classificato utilizzando il sistema di punteggio Jablonski 18,19. Il danno epatico è stato classificato utilizzando il sistema di punteggio Suzuki20,21. Questa tabella è adattata con i permessi dei sistemi di punteggio presentati in Quaedackers et al.17, Du et al.19 e Behrends et al.21. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figure 1
Figura 1: Localizzazione e isolamento dell'arteria mesenterica superiore (SMA). (A) Normalmente, la SMA si trova ventrale alla vena cava inferiore e si estende verso la destra dell'animale. Si trova tra l'arteria celiaca e l'arteria renale. Questa figura è adattata con il permesso di The Anatomy of the Laboratory Mouse di Margaret Cook (1965)22. (B) In questa procedura, l'intestino viene esteriorizzato e capovolto a sinistra (coperto con una garza inumidita in questa immagine), quindi la SMA (freccia gialla) si trova a sinistra della vena cava inferiore (freccia blu). Abbreviazioni: RK = rene destro; D = duodeno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Segmenti dell'intestino tenue colorati con ematossilina ed eosina. Sezioni di digiuno (A) e ileo (B) di topi del gruppo Sham presentavano villi lunghi e sottili senza distorsioni. Le sezioni di digiuno (C) e ileo (D) dei topi del gruppo IRI presentavano aree di necrosi (asterischi) ed emorragia con ottundimento e distorsione dei villi rimanenti (frecce). Le foto provengono da topi sottoposti a 45 minuti di ischemia e 90 minuti di riperfusione e hanno ricevuto 400 UI/kg di eparina. Le foto sono state scattate con un ingrandimento di 20x con uno zoom del 10%. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Punteggi di Park/Chiu per i segmenti dell'intestino tenue. Il danno microscopico a tutti e tre i segmenti intestinali (duodeno, digiuno e ileo) per gli animali sottoposti a danno da ischemia-riperfusione intestinale (IRI) è stato significativamente aumentato rispetto a quelli sottoposti a laparotomia fittizia (Sham). * p < 0,05 per IRI rispetto a Sham. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Punteggi di Park/Chiu per l'intestino tenue sottoposto a ischemia di 60 minuti e riperfusione di 120 minuti rispetto a ischemia di 45 minuti e riperfusione di 90 minuti con 400 UI/kg di eparina. La riduzione dei tempi da 60 minuti di ischemia e 120 minuti di riperfusione (60/120) a 45 minuti di ischemia e 90 minuti di riperfusione con 400 UI/kg di eparina (45/90/H) non ha creato una differenza statisticamente significativa nei punteggi di Park/Chiu delle lesioni dell'intestino tenue dei topi nel gruppo IRI. Tuttavia, ha ridotto la mortalità dal 50% al 20%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Nonostante l'uso diffuso di questo modello IRI intestinale, non è privo di limiti. Ad esempio, la sola occlusione della sola base della SMA non ostruisce completamente il flusso sanguigno all'intestino. Ciò è probabilmente dovuto all'ampia circolazione collaterale nel mesentere, che può prelevare sangue dai rami vicini dell'aorta addominale. In uno studio sui gatti, l'occlusione della SMA ha ridotto il flusso sanguigno del 35% nel duodeno prossimale, del 61% nel duodeno distale, del 71% nel digiuno e nell'ileo e del 63% nel colon prossimale. Il flusso sanguigno non è stato ridotto nel colon medio e distale, che ricevono gran parte della loro circolazione dall'arteria mesenterica inferiore23. Nei roditori, il digiuno e l'ileo sono spesso citati come i segmenti intestinali che subiscono la lesione tissutale più significativa a seguito dell'occlusione della SMA9.

In letteratura è stato citato un ampio intervallo di tempi di ischemia dopo l'occlusione della SMA, da 1 a 90 minuti o più. Diversi tempi ischemici determinano diversi livelli di danno da riperfusione; Park et al. hanno osservato lesioni da riperfusione quando l'intervallo ischemico era compreso tra 40 e 60 minuti, ma non quando l'intervallo ischemico era più breve o più lungo24. Tali risultati suggeriscono che tempi più brevi non producono abbastanza ischemia per incitare il danno da riperfusione, mentre tempi più lunghi danneggiano il tessuto in modo così grave che è impossibile dimostrare il danno da riperfusione che ne consegue. Inoltre, tempi ischemici più lunghi comportano il rischio di un aumento della mortalità. Come si è visto nel nostro studio, il 50% (3/6) dei topi iniziali sottoposti a ischemia di 60 minuti è morto dopo soli 90 minuti di riperfusione. La riduzione del tempo di ischemia a 45 minuti ha ridotto la mortalità al 20% (1/5) senza modificare i punteggi di danno tissutale. Sulla base del nostro studio, sembra che la finestra ideale di danno ischemico possa essere raggiunta con l'occlusione della SMA per circa 45 minuti.

Un'altra variabile è il tempo di riperfusione prima del prelievo del tessuto. Come per i tempi di ischemia, i tempi di riperfusione variano ampiamente tra gli studi, da 60 minuti a oltre 24 ore. Diversi lavori hanno riportato che la mucosa intestinale subisce il massimo danno morfologico a 2-3 ore di riperfusione, con riparazione completa raggiunta a 24 ore 25,26,27. La raccolta del tessuto prima di questa finestra di 2 o 3 ore rischia di non catturare l'intera estensione della lesione da riperfusione, mentre i tessuti raccolti più vicino a 24 ore avranno già iniziato il processo di riparazione. Inizialmente abbiamo optato per un tempo di riperfusione di 120 minuti, ma poi siamo passati a 90 minuti nel tentativo di ridurre la mortalità. Questo cambiamento non ha modificato i risultati del danno tissutale, suggerendo che una deviazione di 30 minuti dalla finestra di 2-3 ore è accettabile.

Anche la concentrazione di ossigeno è una variabile importante nello sviluppo dell'IRI. Wilding et al. hanno scoperto che, rispetto ai topi che ricevevano il 21% di O2 , quelli anestetizzati con isoflurano somministrato con il 100% di O2 hanno sperimentato una mancata corrispondenza ventilazione-perfusione a causa dell'atelettasia. Nello stesso studio, i ratti trattati con il 100% di O2 hanno sviluppato acidosi respiratoria acuta e pressione arteriosa mediaelevata 28. Tali cambiamenti fisiologici sono meglio evitati quando si induce una lesione come l'IRI, in cui sono coinvolti una serie di fattori sistemici. Pertanto, il 21% di O2 sembra essere più appropriato del 100% di O2 come gas di trasporto per il rilascio di isoflurano.

L'uso dell'eparina in questo protocollo è aperto al dibattito. L'eparina è nota per avere effetti anticoagulanti e antinfiammatori29. Abbiamo scoperto che passare da 60 minuti di ischemia e 120 minuti di riperfusione a 45 minuti di ischemia e 90 minuti di riperfusione con 400 UI/kg di eparina non ha modificato il danno intestinale microscopico ma ha ridotto la mortalità. Una possibile spiegazione è che l'eparina ha impedito il tromboembolismo fatale a organi distanti come i polmoni e il cervello, tuttavia non abbiamo trovato prove di questo durante l'autopsia mediante esame macroscopico o microscopico dei primi due topi che sono morti. L'uso di tempi di ischemia e riperfusione più brevi senza eparina può essere altrettanto efficace nel ridurre la mortalità. Se così fosse, sarebbe prudente rinunciare all'uso dell'eparina per ridurre al minimo l'interferenza con l'IRI. Tuttavia, l'inclusione dell'eparina nel protocollo può essere appropriata per coloro che desiderano modellare le cause chirurgiche dell'IRI, poiché i pazienti chirurgici spesso ricevono l'eparina perioperatoriamente.

È stato dimostrato che l'isoflurano ha effetti protettivi sui tessuti in caso di infiammazione intestinale e ischemia e il suo uso può interferire con un modello IRIclinicamente rilevante 30,31,32. Tuttavia, gli inalanti organofluorurati (cioè isoflurano, sevoflurano) sono anestetici comunemente usati sia in medicina veterinaria che umana. Inoltre, la durata dell'anestesia richiesta per questo protocollo supera i 120 minuti, e quindi un inalante è più appropriato di un iniettabile ad azione più breve che dovrebbe essere ridosato.

Non erano presenti lesioni microscopiche nel colon prossimale, nel fegato o nel rene. La mancanza di cambiamenti microscopici era forse dovuta al tempo di riperfusione relativamente breve di 90-120 minuti. Inoltre, il colon prossimale ha un afflusso di sangue dall'arteria mesenterica inferiore. Tuttavia, la mancanza di danni visibili non esclude un danno sistemico. La reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR) è probabilmente una metodologia migliore per dimostrare il danno sistemico misurando le citochine infiammatorie come il TNF-α.

Nel corso degli anni sono state sviluppate diverse varianti di questo modello IRI intestinale. Nel 1990, Megison et al. hanno dimostrato che l'occlusione dei vasi collaterali in aggiunta alla SMA produceva una riduzione più consistente del flusso sanguigno mesenterico ma un aumento del tasso di mortalità33. Uno studio più recente ha dimostrato che, invece di occludere la SMA alla sua base, legare i suoi rami periferici e collaterali per indurre l'ischemia nell'ileo distale ha prodotto un danno riproducibile senza mortalità34. L'occlusione dei rami arteriosi locali garantisce la massima ischemia e può risolvere il problema delle riduzioni multifocali e segmentali del flusso sanguigno osservate con la legatura della SMA proprio alla sua base. Mentre questo metodo alternativo di modellazione dell'IRI intestinale ha un'applicazione per la ricerca sugli effetti tissutali locali dell'IRI intestinale, non è noto se possa modellare con precisione l'infiammazione sistemica e l'insufficienza multiorgano che possono essere associate a lesioni intestinali.

L'occlusione della SMA non è un modello appropriato per tutti i tipi di IRI intestinale. L'ischemia mesenterica non occlusiva, ad esempio, è caratterizzata da ipoperfusione splancnica derivante da una ridotta gittata cardiaca. Pertanto, questa tecnica non sarebbe ottimale per studiare l'IRI intestinale causata da infarto miocardico, insufficienza cardiaca congestizia, insufficienza aortica o malattia renale o epatica35. Kozar et al. hanno riportato che l'occlusione della SMA è, tuttavia, un modello clinicamente rilevante per l'IRI intestinale indotta dallo shock36. Sebbene meno economico, l'uso di altre specie come i maiali può avere benefici rispetto ai roditori per modellare determinate condizioni di lesioni intestinali. Una revisione completa di Gonzalez et al. nel 2014 descrive i modelli animali attualmente in uso per studiare l'IRI9 intestinale.

Nonostante i suoi limiti, la tecnica di occludere la SMA alla sua base rimane uno dei modelli di ischemia intestinale dei roditori più comunemente utilizzati9. Poiché richiede solo una pinza vascolare e una configurazione di base, l'intervento chirurgico in sé è abbastanza semplice. Produce anche un danno riproducibile, come evidenziato dai dati qui presentati. L'occlusione della SMA nei roditori può modellare in modo affidabile le cause occlusive dell'IRI intestinale e può avere un'applicazione pratica sia in medicina veterinaria che umana. Pertanto, è importante che le procedure che abbiamo delineato in questa sede siano attuate con coerenza.

Disclosures

Gli autori di questo articolo non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Il finanziamento per questo progetto è stato fornito dalla Divisione di Ricerca Intramurale del National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health.

Vorremmo ringraziare il Dr. James Hawkins per il suo mentore e supporto. Ringraziamo anche i dottori Mihai Oltean e Robert Linford per la loro assistenza nella localizzazione dell'arteria mesenterica superiore. Vorremmo estendere i nostri ringraziamenti ai dottori Patricia Carvalho Obeid Ellrich, Claudio Correa Natalini e George Howell III per aver fornito la loro esperienza durante lo sviluppo di questo protocollo. Infine, vorremmo ringraziare Stephen Wincovitch per la sua assistenza nell'acquisizione delle bellissime micrografie fotografiche presenti in questo articolo e la dottoressa Alicia Olivier per il suo aiuto nell'etichettatura e nel rendering delle figure finali.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adson forceps Roboz RS-5236 Surgical instrument
Alm retractor Roboz RS-6510 Surgical instrument
Anesthesia machine Datex-Ohmeda Aestiva 5
Anesthesia: isoflurane Baxter Healthcare Corporation NDC 10019-360-40 Dose: 1-4%, INH
Angiocath 20 g  x 2 Smiths Medical 5057 Flushing intestines with saline and formalin
Atraumatic microvascular clip Teleflex 065100 Surgical instrument
Buffered formalin 10% Fisher Scientific 23-245684 Tissue fixation
Bupivicaine 0.25% Hospira, Inc. NDC 0409-1160-18 Dose: up to 2 mg/kg drop-wise
Buprenorphine Par Pharmaceutical NDC 42023-179-05 Dose: 1 mg/kg, SQ
Chlorhexidine scrub 2% Vet One 510083 Surgical site prep
Circulating water blanket Cincinnati Sub Zero Blanketrol 2 Body temp maintenance
Clippers - Wahl BravMini, Purple Hair clippers Lambert Vet Supply 008WA-41590-0438 Surgical site prep
Conical tubes 50 ml Fisher Scientific 14-432-22 Tissue fixation and storage
Dry ice N/A N/A PCR tissue samples
EtOH 200 proof The Warner-Graham Company 64-17-5 Tissue storage
Heparin (optional) Meitheal Pharmaceuticals NDC 71288-402-11 Dose: 200-600 IU/kg
Induction chamber VetEquip 941456
Indus Instruments THM100 Rodent Monitor Indus Instruments N/A For monitoring rodent body temperature during surgery
Isopropyl Alcohol 70% Humco NDC 0395-4202-28 For scrubbing surgical site
Microcentrifuge Tubes: 0.6mL Fisher Scientific 05-408-121 PCR tissue samples. 8 per mouse, Terminal bleed collection, serum storage
Microsoft Excel Microsoft N/A
Nose cone N/A N/A Can be homemade with syringe tube or bubble tubing
O2 medical air 21% Roberts Oxygen N/A Rate: 0.5 L/min for each L chamber volume
Ophthalmic ointment Akorn, Inc. NDC 17478-062-35 Surgical prep
PBS pH 7.4 (1x) ThermoFisher Scientific 10010-031 For tissue rinsing and making 70% EtOH
Specimen cups Cardinal Healthcare C13005 For holding tissue cassettes in formalin
Sterile Castroviejo Needle Holder Roboz RS-6412 Surgical instrument
Sterile cotton swabs Medline BXTA50002Z
Sterile gauze Medline PRM21423Z
Sterile Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5980 Surgical instrument
Sterile micro dissecting spring scissors Roboz RS-5693 Surgical instrument
Sterile micro forceps Roboz RS-5264 Surgical instrument
Sterile saline (0.9%) Braun R5201-01 Must be warmed
Sterile scalpel blade #15 Cardinal Health (Allegiance) 32295-015 Surgical instrument
Sterile scalpel handle Roboz RS-9843 Surgical instrument
Sterile surgical drape Medline DYNJSD1092
Sterile surgical gloves Medline MSG2270
Sterile surgical stapler Roboz RS-9260 Surgical instrument
Sterile surgical staples Roboz RS-9262 Abdominal skin closure
Sterile suture: Vicryl (polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Needle Ethicon J212G Closing abdominal muscle
Surgical tape Medline MMM15271Z Securing mouse in dorsal recumbancy
Syringe 10 ml x 2 Medline SYR110010 Flushing intestines with saline and formalin
Tissue cassettes Fisher Scientific 22-038-665 Rolled intestinal segments. 4 per mouse.
Towel or drape Medline GEM2140 Water blanket cover

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References

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Henein, L., Clevenger, R., Keeran, K., Brinster, L. Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery. J. Vis. Exp. (200), e64314, doi:10.3791/64314 (2023).

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