Summary
Vi beskriver hur man kan generera en allmänt använd kirurgisk modell av intestinal ischemi-reperfusionsskada (IRI) hos gnagare. Ingreppet innebär ocklusion av den övre tarmkäxartären följt av återställande av blodflödet. Denna modell är användbar för studier som undersöker ocklusiva orsaker till intestinal IRI inom både veterinärmedicin och humanmedicin.
Abstract
Intestinal ischemi-reperfusionsskada (IRI) är förknippad med en myriad av tillstånd inom både veterinärmedicin och humanmedicin. Intestinala IRI-tillstånd, såsom gastrisk dilatation volvulus (GDV), mesenterisk torsion och kolik, observeras hos djur som hundar och hästar. Ett initialt avbrott i blodflödet gör att vävnader blir ischemiska. Även om det är nödvändigt för att rädda livskraftig vävnad, kan efterföljande reperfusion orsaka ytterligare skada. Den huvudsakliga mekanismen som är ansvarig för IRI är bildandet av fria radikaler vid reperfusion och återinförande av syre i skadad vävnad, men det finns många andra komponenter inblandade. De lokala och systemiska effekter som blir följden ger ofta en dålig prognos.
Intestinal IRI har varit föremål för omfattande forskning under de senaste 50 åren. En in vivo-modell av gnagare där basen av den övre tarmkäxartären (SMA) tillfälligt ligeras är för närvarande den vanligaste metoden som används för att studera tarmens IRI. Här beskriver vi en modell av intestinal IRI som använder isofluranbedövning i 21% O2 medicinsk luft som ger reproducerbar skada, vilket visas av konsekvent histopatologi i tunntarmen. Vävnadsskador bedömdes också i tjocktarmen, levern och njurarna.
Introduction
Ischemi-reperfusionsskada (IRI) kan uppstå i vilket organ som helst och involverar två sekventiella komponenter. Ett initialt upphörande av blodflödet gör att drabbade vävnader blir ischemiska och sedan inducerar efterföljande reperfusion ytterligare cellskada. Skadorna från reperfusionen överstiger ofta de som orsakas av ischemi1. Patofysiologin vid IRI involverar en komplex kaskad av händelser, varav den mest anmärkningsvärda är bildandet av fria radikaler vid återinförandet av syre, vilket sker under reperfusion2. Aktivering av de inflammatoriska cellerna och cytokinerna spelar också en roll2. I fall av intestinal iri kan bakteriell translokation till blodomloppet efter endotelskada leda till systemiskt inflammatoriskt responssyndrom2. Om skadan på grund av IRI är tillräckligt allvarlig kan resulterande systemiska effekter leda till multiorgansvikt3.
Fall av IRI i tarmen är förknippade med hög sjuklighet och mortalitet 4,5,6. Intestinal IRI är förknippad med många patologiska tillstånd och kirurgiska ingrepp inom både veterinärmedicin och humanmedicin. Inom veterinärmedicinen är djur särskilt benägna att drabbas av IRI-tillstånd i tarmen, t.ex. gastrisk dilatation volvulus (GDV), mesenterisk torsion och kolik 7,8. Hos människor är IRI ett stort och ofta förekommande problem vid bukaortaaneurysmkirurgi, strypt bråck, akut mesenterisk ischemi, volvulus, trauma, chock, neonatal nekrotiserande enterokolit och tunntarmsresektion eller transplantation9.
De flesta in vivo-studier av IRI på gnagare involverar ocklusion av basen av den övre tarmkäxartären (SMA), den gren av bukaortan som förser majoriteten av tunntarmen med blod och den proximala delen av tjocktarmen 10,11,12. Trots modellens utbredda användning och relativa enkelhet har ett detaljerat protokoll med inhalationsanestesi i 21 %O2 medicinsk luft inte publicerats. Avsaknaden av ett standardprotokoll innebär svårigheter för forskare som inte är bekanta med förfarandet och förhindrar enhetlighet mellan studierna. Vi demonstrerar de steg som krävs för att genomföra den kirurgiska modellen av intestinal IRI i 8-14 veckor gamla han- och honmöss av schweizisk Webster. Denna modell av intestinal IRI ger reproducerbar skada, vilket visas genom konsekvent histopatologi.
Protocol
Procedurerna som beskrivs här har godkänts av National Heart, Lung, and Blood Institute Animal Care and Use Committee vid National Institutes of Health och överensstämmer med de riktlinjer som beskrivs i The Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals, The Animal Welfare Act och Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Kirurgisk inställning
- Följ aseptiska procedurer. Ta på dig en mask, hårskydd och ren jumpsuit/labbrock/kirurgisk skrubb.
- Förbered följande steriliserade material: kirurgiska instrument (se materialförteckning), varm koksaltlösning, bomullspinnar, gasbinda, kirurgiska häftklamrar, kirurgiska draperier och handskar. Skaffa också kirurgtejp som inte behöver steriliseras. Sterilisera materialen med antingen autoklav eller etylenoxidsteriliseringstekniker.
- Placera en uppvärmd cirkulerande vattenfilt i operationsområdet och täck den med en steril handduk eller draperi.
- Använd en precisionsförångare av isofluran, trycksatt medicinsk luft (21 %O2) och en Bain-krets utan återandning med en näskon avsedd för möss för att ge kirurgisk anestesi.
2. Beredning av djur
- Bedöva musen i en induktionskammare genom att tillföra 2%-4% isofluran med 21% O2 medicinsk luft med en hastighet av 0,5 L/min för varje liter kammarvolym.
OBS: Det är att föredra att använda 21 % O2 medicinsk luft över 100 % O2 för just denna modell, eftersom mättnad av blodet med O2 kan störa IRI. - Ta bort musen från kammaren och flytta den till en ren yta som är separerad från operationsområdet. Utrusta den med en noskon som levererar 1,5 % isofluran med 21 %O2 medicinsk luft.
- Injicera 1 mg/kg buprenorfin subkutant i det dorsala cervikothorakala området.
- Injicera 200-600 IE/kg heparin intraperitonealt för att förhindra trombbildning under ocklusionsperioden.
- Applicera ögonsalva på ögonen för att förhindra skador på hornhinnan.
- Ta bort hår från buken med hjälp av en klippare.
- Flytta musen till den uppvärmda vattenfilten i operationsområdet. Återigen, utrusta den med en näskon som levererar 1,5 % isofluran med 21 %O2 medicinsk luft för att uppnå ett kirurgiskt anestesiplan.
- Placera musen i ryggläge och fäst lemmarna på bordet med kirurgtejp.
- Övervaka djurets kroppstemperatur rektalt med en gnagarspecifik termometer. Håll kroppstemperaturen på 36,5 ± 0,5 °C under hela operationen.
- Desinficera buken med steril gasväv indränkt i antingen klorhexidinskrubb eller povidonjodskrubb, följt av 70 % alkohol. Upprepa denna sekvens tre gånger, omväxlande mellan skrubben och alkoholen. En ny uppsättning scrubs och alkoholgasbindor bör användas varje gång.
- Applicera skrubben och alkoholen i en cirkulär rörelse, börja med små cirklar i mitten av operationsområdet och arbeta gradvis mot kanterna genom att öka storleken på cirklarna. Kassera gasbindan när kanten på operationsstället har nåtts. Skrubba inte bakåt från kant till mitt.
- Utför ett tånyptest (pedalreflex) för att säkerställa att djuret är helt sövt.
- Ta på dig sterila handskar. Drapera operationsområdet aseptiskt.
3. Kirurgi och ischemi
- Gör ett 3-5 cm ventralt mittlinjesnitt i buken i huden med hjälp av ett skalpellblad #15, dissekera det fritt från den underliggande muskelfascian och reflektera det i sidled. Fortsätt snittet genom bukväggen längs linea alba med antingen mikrodissekerande sax eller fjäderbelastad mikrosax och placera en upprullningsdon på plats.
- Placera sterila gasbindor fuktade med varm steril koksaltlösning runt operationsområdet.
- Ta bort tunntarmen från bukhålan, vänd den kraniellt och till vänster om djuret och placera den på de fuktade dynorna. Placera en annan fuktad gasbinda över vävnaderna för att förhindra uttorkning. Droppa med jämna mellanrum varm steril koksaltlösning på gasbindan för att hålla vävnaderna fuktiga.
- Isolera SMA, som ligger ventralt till den nedre hålvenen, kaudalt till celiakiartären och kranialt till njurartären.
OBS: Figur 1 visar platsen för SMA där den är isolerad under operationen. SMA ligger normalt ventralt till den nedre hålvenen och sträcker sig åt höger. När tarmarna exterioriseras och vänds åt vänster under operationen ligger SMA till vänster om den nedre hålvenen. - Placera en atraumatisk mikrovaskulär klämma över basen av SMA där den förgrenar sig från bukaortan, och se till att klämman inte täpper till den övre tarmkäxvenen.
- Verifiera ischemi i tunntarmen genom att notera färgförändringen från rosa till blekvit och förlusten av mesenterisk pulsering.
- Återställ inälvorna till sin ursprungliga position i bukhålan under den ischemiska perioden. Ta bort upprullningsdonet och täck snittet med fuktig gasbinda. Tillsätt med jämna mellanrum varm steril koksaltlösning till gasbindan för att förhindra uttorkning och bibehålla kroppstemperaturen.
- Efter en 45 minuters period av ischemi (vars början markeras av den första appliceringen av klämman), ta bort den ocklusionerande klämman. Verifiera återställandet av blodflödet genom att observera en mesenterisk pulsering och rodnad färg.
- Applicera varm steril koksaltlösning intraperitonealt strax före slutlig stängning för att bibehålla lämplig återfuktning.
- Stäng magmusklerna med en 6-0 polyglaktin 910-sutur. Administrera bupivakain (upp till 2 mg/kg) längs muskelsnittslinjen för smärtlindring. Stäng huden med kirurgiska häftklamrar eller sårklämmor.
4. Återhämtning och reperfusion
- Sätt tillbaka musen i en varm kammare eller bur på en cirkulerande vattenfilt, handvärmare eller annan lämplig värmekälla. Leverera 21 % O2 vid en flödeshastighet på 0,5 l/min för varje liter kammarvolym. Låt musen återhämta sig här i 90 min. Övervaka musen var 5-10:e minut för tecken på smärta eller ångest, såsom böjd hållning, kisning och ovilja att röra sig.
5. Eutanasi och blodprovstagning
- I slutet av återhämtningsperioden på 90 minuter återförs musen till induktionskammaren och 2%-4% isofluran med 21% O2 med en hastighet av 0,5 l/min kammarvolym för att återinducera full anestesi.
- Överför djuret tillbaka till operationsområdet och förse det med en noskon, som levererar 2%-4% isofluran med 21%O2 för att uppnå djup anestesi.
OBS: CO2 är inte en lämplig metod för avlivning för denna procedur, eftersom den inducerar fysiologiska förändringar som kan störa ischemisk skada eller vävnadsanalyter13. - Öppna det ventrala mittlinjesnittet igen och utför en terminal blödning genom att samla upp så mycket blod som möjligt från bukhålvenen med hjälp av en 23 G nål och spruta. Räkna med att samla in mellan 0,3-0,5 ml blod (mindre hos möss som har genomgått IRI, mer hos dem som fått skenlaparotomi).
OBS: Syftet med den terminala blödningen är att hjälpa till med human dödshjälp och att samla in och bevara blod för framtida tester (dvs. serumkemi, PCR, ELISA). - Efter blodprovstagning skärs bukaortan av för att möjliggöra fullständig blodförgiftning.
- Utför antingen cervikal luxation eller torakotomi som en sekundär åtgärd för att säkerställa framgångsrik dödshjälp.
6. Vävnadsbearbetning för histologi
- Efter avlivning samlar du in de önskade vävnaderna. Se till att vävnadsbearbetningen sker snabbt, eftersom autolysen börjar omedelbart efter döden 14,15.
- Tarmar: Samla in hela längden av tunntarmen och tjocktarmen. Kassera blindtarmen.
- Lever: Samla in vänster laterala, vänstra medianlober och höger medianlober.
- Njurar: Samla båda njurarna. Enligt konvention skärs den vänstra njuren i längdriktningen och den högra skärs som ett tvärsnitt vid obduktionen.
OBS: Tjocktarmen, levern och njurarna kan användas för att bedöma multiorgansvikt eller andra systemiska effekter av IRI. Tunntarmen används för att bedöma den primära skadan. Det är inte nödvändigt att hålla reda på enskilda delar av leverloben och njurarna, eftersom varje organ kommer att analyseras och poängsättas som en enhet. Tarmsegmenten bör dock hållas åtskilda och sedan märkas och poängsättas individuellt.
- Dela upp tarmen i fyra sektioner: tolvfingertarmen, jejunum, ileum och tjocktarmen. Se till att de tre tunntarmssegmenten är lika långa. Gör detta genom att vika tunntarmen till en "Z"-form, där den översta linjen är tolvfingertarmen, den mellersta linjen är jejunum och den nedre linjen är ileum. Det är viktigt att hålla reda på den proximala kontra den distala änden.
- Spola tarmsegmentens lumen med koksaltlösning med en 10 ml spruta fäst med en 20 G angiokateter.
- Innan du gör sektioner, lägg varje tarmsegment platt med den luminala sidan uppåt. Använd en 3 ml spruta fäst med en 27 G nål och applicera generöst 10 % buffrat formalin droppvis för att täcka hela slemhinnans längd. Rulla sedan varje tarmsegment individuellt och placera i separata, märkta vävnadskassetter.
- För att rulla, lägg varje segment platt med den luminala sidan uppåt och rulla sedan runt en tandpetare. Den proximala delen ska utgöra den inre delen av rullen. Lumen ska vara vänd mot insidan/mitten. Försök att rulla så försiktigt som möjligt för att undvika att trycka ihop villi.
- När tarmen rullas ska den se ut som en rulltårta. Placera rullspiralen med framsidan uppåt inuti kassetten.
- Placera servetterna i märkta injektionsflaskor fyllda med 10 % buffrat formalin för att fixera dem i rumstemperatur. Överfixering är bättre än underfixering. Injektionsflaskorna ska vara stora med mycket formalin - minst 20 gånger mer fixeringsmedel än vävnad.
- Tarmar: Placera de fyra kassetterna tillsammans i en provkopp. Fix för 24-48 h.
- Lever: Placera leverloberna tillsammans i ett 50 ml koniskt rör. Fix för 24-48 h.
- Njurar: Placera njurarna tillsammans i ett 50 ml koniskt rör. Fix för 48-72 h.
OBS: Otrimmade njurar tar längre tid att fixa än trimmade njurar. För att förkorta fixationstiden till 24-48 timmar kan njurarna skäras längs medianusplanet, längsgående (vänster njure) och tvärgående (höger njure), och placeras i kassetter innan de deponeras i formalin.
- Efter att vävnaderna har fixerats i formalin under den angivna tiden, skölj med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) eller destillerat vatten och överför till märkta injektionsflaskor fyllda med 70 % EtOH. Vävnaden kan förvaras i EtOH på obestämd tid vid rumstemperatur i väntan på histologi.
- Tarmar: Placera de fyra kassetterna tillsammans i en provkopp.
- Lever: Placera leverloberna tillsammans i ett 50 ml koniskt rör.
- Njurar: Placera njurarna tillsammans i ett 50 ml koniskt rör.
- När du är klar, bearbeta vävnaderna på glasskivor med hematoxylin och eosin (H&E) färgning. Trimma de formalinfixerade vävnaderna och bädda sedan in dem i paraffin. Montera femmikronsektioner på objektglasen och betsa med H&E.
7. Bedömning av vävnader
- Vävnadsbedömning bör företrädesvis utföras av erfaren personal som är blindad för provgrupperna.
- Tarmischemi poängsätts med hjälp av Chiu/Park-poängsystemet17.
- Njurskador poängsätts med hjälp av Jablonskis poängsystem18,19.
- Leverskador poängsätts med hjälp av Suzuki-poängsystemet20,21.
OBS: Det finns många poängsystem som för närvarande används för att bedöma vävnadsskador i gnagarmodeller av intestinal IRI. De poängsystem som användes i denna studie valdes för att minimera godtycklig skattning och för att maximera avsiktlig kvalitativ bedömning (Tabell 1).
Representative Results
Vi demonstrerade en modell av intestinal IRI i möss som gav konsekventa och reproducerbara resultat. Tunntarmen, den proximala tjocktarmen, njurarna och levern snittades och färgades med H&E. En veterinärpatolog graderade vävnadsskador med hjälp av de poängsystem som tidigare nämnts (tabell 1). Statistisk analys utfördes med hjälp av enfaktoranalys av varians (ANOVA) följt av Tukeys post hoc med parvisa jämförelser, som fastställde om det fanns en signifikant skillnad i data inom och mellan grupper. Ett p-värde som är mindre än eller lika med 0,05 ansågs vara brytpunkten för att fastställa statistisk signifikans. Alla statistiska tester och grafer utfördes i ett kalkylprogram (t.ex. Microsoft Excel) med tillägget Real Statistics Resource Pack. Data presenteras som medelvärdet ± medelfelet för medelvärdet (SEM).
Mikroskopiska lesionspoäng för de tre tunntarmssegmenten (tolvfingertarmen, jejunum och ileum) ökade signifikant för djur som genomgick intestinal ischemi-reperfusionsskada (IRI; N = 7) jämfört med de som genomgick skenlaparotomi (Sham; N = 6) (figur 2 och figur 3). Standardfelet för dessa data var snävt, vilket visar att resultaten var konsekventa inom och mellan grupper. Varje tarmsegment i Sham-gruppen gav exakt samma genomsnittliga Park/Chiu-poäng på 0,83. SEM för tolvfingertarmen, jejunum och ileum i Sham-gruppen var 0,31, 0,40 respektive 0,31. De genomsnittliga Park/Chiu-poängen för tolvfingertarmen, jejunum och ileum i IRI-gruppen var 4,07 ± 0,44, 4,14 ± 0,46 respektive 5,14 ± 0,40.
I denna studie dog 50 % (3/6) av de ursprungliga mössen som genomgick 60 minuters ischemi och 120 minuters reperfusion (60/120-gruppen). Två av de tre mössen obducerades. Båda mössen hade epitelnekros, trängsel och blödning i tunntarmen. Dessutom fick mössen lymfocytolys, en ospecifik förändring förknippad med fysiologisk stress. Ingen av mössen hade skador i hjärta, lungor, lever eller njurar. Genom att förkorta tiderna till 45 min ischemi och 90 min reperfusion och lägga till 400 IE/kg heparin (45/90/H-gruppen) sänktes mortaliteten till 20 % (1/5) utan att tarmskadepoängen förändrades (Figur 4). Den genomsnittliga Park/Chiu-poängen för 60/120-gruppen var 4,56 ± 0,38 (N = 3), och medelpoängen för 45/90/H-gruppen var 4,375 ± 0,38 (N = 4).
Mikroskopiska fynd som tyder på skada i proximal tjocktarm, lever och njure sågs inte hos vare sig 60/120-mössen eller 45/90/H-mössen.
Tabell 1: Poängsystem för tarmar, njurar och lever. Tarmskador graderades med hjälp av Chiu/Park-systemet17. Njurskador graderades med hjälp av Jablonskis poängsystem18,19. Leverskadan graderades med hjälp av Suzuki-poängsystemet20,21. Denna tabell är anpassad med behörigheter från poängsystem som presenteras i Quaedackers et al.17, Du et al.19 och Behrends et al.21. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Figur 1: Lokalisering och isolering av den övre tarmkäxartären (SMA). (A) Normalt ligger SMA ventralt till den nedre hålvenen och sträcker sig mot djurets högra sida. Den ligger mellan celiaki artären och njurartären. Denna figur är anpassad med tillstånd från The Anatomy of the Laboratory Mouse av Margaret Cook (1965)22. (B) I denna procedur exterioriseras tarmarna och vänds åt vänster (täckt med fuktad gasväv på denna bild), så SMA (gul pil) ligger till vänster om den nedre hålvenen (blå pil). Förkortningar: RK = höger njure; D = tolvfingertarmen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Tunntarmssegment färgade med hematoxylin och eosin. Sektioner av jejunum (A) och ileum (B) från möss i Sham-gruppen innehöll villi som var långa och smala utan förvrängning. Sektioner av jejunum (C) och ileum (D) från möss i IRI-gruppen hade områden med nekros (asterisker) och blödningar med avtrubbning och förvrängning av de återstående villi (pilarna). Bilderna är från möss som genomgick 45 min ischemi och 90 min reperfusion och fick 400 IE/kg heparin. Bilderna är tagna i 20x förstoring med 10% zoom. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Park/Chiu-poäng för tunntarmssegment. Mikroskopisk skada på alla tre tarmsegmenten (tolvfingertarmen, jejunum och ileum) hos djur som genomgick tarmischemi-reperfusionsskada (IRI) var signifikant förhöjd jämfört med de som genomgick skenlaparotomi (Sham). * p < 0,05 för IRI mot Sham. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Park/Chiu-poäng för tunntarm som genomgår 60 min ischemi och 120 reperfusion jämfört med 45 min ischemi och 90 min reperfusion med 400 IE/kg heparin. Att minska tiderna från 60 min ischemi och 120 min reperfusion (60/120) till 45 min ischemi och 90 min reperfusion med 400 IE/kg heparin (45/90/h) skapade ingen statistiskt signifikant skillnad i Park/Chiu-skadepoäng för tunntarmen hos möss i IRI-gruppen. Det minskade dock dödligheten från 50 % till 20 %. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Trots den utbredda användningen av denna IRI-modell för tarmen är den inte utan sina begränsningar. Till exempel hindrar inte enbart ocklusion av basen av SMA helt blodflödet till tarmen. Detta beror sannolikt på omfattande kollateral cirkulation i tarmkäxet, som kan dra blod från närliggande grenar av bukaortan. I en studie på katter minskade SMA-ocklusion blodflödet med 35 % i den proximala tolvfingertarmen, 61 % i den distala tolvfingertarmen, 71 % i jejunum och ileum och 63 % i den proximala tjocktarmen. Blodflödet minskade inte i mellersta och distala tjocktarmen, som får mycket av sin cirkulation från den nedre tarmkäxartären. Hos gnagare anges jejunum och ileum oftast som de tarmsegment som ådrar sig den mest betydande vävnadsskadan efter SMA-ocklusion9.
Ett brett spektrum av ischemitider efter SMA-ocklusion har citerats i litteraturen, från 1 till 90 minuter eller mer. Olika ischemiska tider resulterar i olika nivåer av reperfusionsskada; Park et al. observerade reperfusionsskada när det ischemiska intervallet var mellan 40 och 60 minuter, men inte när det ischemiska intervallet var kortare eller längre24. Sådana resultat tyder på att kortare tider inte ger tillräckligt med ischemi för att framkalla reperfusionsskada, medan längre tider skadar vävnaden så allvarligt att det är omöjligt att påvisa den reperfusionsskada som följer. Dessutom medför längre ischemiska tider risk för ökad dödlighet. Som framgår av vår studie dog 50 % (3/6) av de första mössen som genomgick 60 minuters ischemi efter bara 90 minuters reperfusion. Att förkorta ischemitiden till 45 minuter sänkte dödligheten till 20 % (1/5) utan att ändra vävnadsskadepoängen. Baserat på vår studie verkar det som att det ideala fönstret för ischemisk skada kan uppnås genom SMA-ocklusion i cirka 45 minuter.
En annan variabel är reperfusionstiden före vävnadsinsamling. Precis som med ischemi varierar reperfusionstiderna kraftigt mellan olika studier, från 60 minuter till över 24 timmar. Flera artiklar har rapporterat att tarmslemhinnan ådrar sig maximal morfologisk skada vid 2 till 3 timmars reperfusion, med fullständig reparation uppnådd vid 24 timmar 25,26,27. Att samla in vävnad före detta fönster på 2 till 3 timmar riskerar att inte fånga upp den fulla omfattningen av reperfusionsskadan, medan vävnader som skördas närmare 24 timmar redan har påbörjat reparationsprocessen. Vi valde först en reperfusionstid på 120 minuter, men ändrade sedan till 90 minuter i ett försök att minska dödligheten. Denna förändring förändrade inte vävnadsskaderesultaten, vilket tyder på att en avvikelse på 30 minuter från 2 till 3 timmars fönster är acceptabel.
Syrekoncentrationen är också en viktig variabel i utvecklingen av IRI. Wilding et al. fann att, jämfört med möss som fick 21 % O2, upplevde de som var sövda med isofluran som fick 100 % O2 ventilation-perfusionsfel på grund av atelektas. I samma studie utvecklade råttor som fick 100 %O2 akut respiratorisk acidos och förhöjt medelartärtryck28. Sådana fysiologiska förändringar undviks bäst när man inducerar en skada som IRI, där ett antal systemiska faktorer är inblandade. Således verkar 21 % O2 vara mer lämpligt än 100 % O2 som bärgas för leverans av isofluran.
Användningen av heparin i detta protokoll är öppen för debatt. Heparin är känt för att ha antikoagulativa och antiinflammatoriska effekter29. Vi fann att byte från 60 min ischemi och 120 min reperfusion till 45 min ischemi och 90 min reperfusion med 400 IE/kg heparin inte förändrade mikroskopisk tarmskada men minskade dödligheten. En möjlig förklaring är att heparin förhindrade dödlig tromboembolism till avlägsna organ som lungor och hjärna, men vi fann inga bevis för detta vid obduktion genom grov eller mikroskopisk undersökning av de två första mössen som dog. Att använda kortare ischemi och reperfusionstider utan heparin kan vara lika effektivt för att minska dödligheten. Om så vore fallet skulle det vara klokt att avstå från användning av heparin för att minimera interferens med IRI. Att inkludera heparin i protokollet kan dock vara lämpligt för dem som vill modellera kirurgiska orsaker till IRI, eftersom kirurgiska patienter ofta får heparin perioperativt.
Isofluran har visat sig ha vävnadsskyddande effekter i fall av tarminflammation och ischemi, och dess användning kan störa en kliniskt relevant IRI modell 30,31,32. Organofluorinhalationsmedel (dvs. isofluran, sevofluran) används dock ofta inom både veterinärmedicin och humanmedicin. Dessutom överstiger den anestesilängd som krävs för detta protokoll 120 minuter, och därför är ett inhalationsmedel lämpligare än ett kortverkande injicerbart som skulle behöva doseras på nytt.
Inga mikroskopiska lesioner fanns i den proximala tjocktarmen, levern eller njuren. Avsaknaden av mikroskopiska förändringar berodde kanske på den relativt korta reperfusionstiden på 90 till 120 minuter. Dessutom har den proximala tjocktarmen en blodtillförsel från den nedre tarmkäxartären. Avsaknad av synliga skador utesluter dock inte systemisk skada. Omvänd transkription-kvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) är sannolikt en bättre metod för att påvisa systemisk skada genom att mäta inflammatoriska cytokiner såsom TNF-α.
Flera varianter av denna IRI-modell har utvecklats under åren. År 1990 visade Megison et al. att ocklusion kollateralkärl utöver SMA gav en mer konsekvent minskning av mesenteriskt blodflöde men en ökning av dödligheten33. En nyare studie visade att, i stället för att täppa till SMA vid dess bas, ligerade dess perifera och laterala grenar för att inducera ischemi i distala ileum gav reproducerbar skada utan dödlighet34. Ocklusion av de lokala artärgrenarna säkerställer maximal ischemi och kan ta itu med problemet med multifokala, segmentella minskningar av blodflödet som ses med ligering av SMA precis vid basen. Även om denna alternativa metod för modellering av IRI i tarmen har tillämpning för forskning om de lokala vävnadseffekterna av intestinal IRI, är det okänt om den exakt kan modellera den systemiska inflammation och multiorgansvikt som kan associeras med tarmskada.
SMA-ocklusion är inte en lämplig modell för alla typer av IRI. Icke-ocklusiv mesenterisk ischemi, till exempel, kännetecknas av splanchnisk hypoperfusion som härrör från minskad hjärtminutvolym. Därför skulle denna teknik inte vara optimal för att studera IRI i tarmen orsakad av hjärtinfarkt, hjärtsvikt, aortainsufficiens eller njur- eller leversjukdom35. Kozar et al. rapporterade att SMA-ocklusion dock är en kliniskt relevant modell för tarm-IRI inducerad av chock36. Även om det är mindre ekonomiskt kan användningen av andra arter, t.ex. grisar, ha fördelar jämfört med gnagare för att modellera vissa tarmskadetillstånd. En omfattande granskning av Gonzalez et al. 2014 beskriver djurmodeller som för närvarande används för att undersöka intestinal IRI9.
Trots sina begränsningar är tekniken att ockludera SMA vid basen fortfarande en av de mest använda gnagarmodellerna för tarmischemi9. Eftersom det bara krävs en kärlklämma och en grundläggande installation är själva operationen ganska enkel. Det leder också till reproducerbar skada, vilket framgår av de uppgifter som presenteras här. SMA-ocklusion hos gnagare kan på ett tillförlitligt sätt modellera ocklusiva orsaker till IRI i tarmen och kan ha praktisk tillämpning inom både veterinärmedicin och humanmedicin. Därför är det viktigt att de förfaranden som vi har beskrivit här genomförs på ett konsekvent sätt.
Disclosures
Författarna till denna uppsats har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Finansieringen av detta projekt tillhandahölls av avdelningen för intramural forskning vid National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health.
Vi vill tacka Dr. James Hawkins för hans mentorskap och stöd. Vi tackar också doktorerna Mihai Oltean och Robert Linford för deras hjälp med att lokalisera den övre tarmkäxartären. Vi vill framföra vårt tack till Drs. Patricia Carvalho Obeid Ellrich, Claudio Correa Natalini och George Howell III för att ha bidragit med sin expertis under utvecklingen av detta protokoll. Slutligen vill vi tacka Stephen Wincovitch för hans hjälp med att skaffa de vackra mikrofotografierna i denna artikel och Dr. Alicia Olivier för hennes hjälp med att märka och återge de slutliga siffrorna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adson forceps | Roboz | RS-5236 | Surgical instrument |
| Alm retractor | Roboz | RS-6510 | Surgical instrument |
| Anesthesia machine | Datex-Ohmeda | Aestiva 5 | |
| Anesthesia: isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | Dose: 1-4%, INH |
| Angiocath 20 g x 2 | Smiths Medical | 5057 | Flushing intestines with saline and formalin |
| Atraumatic microvascular clip | Teleflex | 065100 | Surgical instrument |
| Buffered formalin 10% | Fisher Scientific | 23-245684 | Tissue fixation |
| Bupivicaine 0.25% | Hospira, Inc. | NDC 0409-1160-18 | Dose: up to 2 mg/kg drop-wise |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Dose: 1 mg/kg, SQ |
| Chlorhexidine scrub 2% | Vet One | 510083 | Surgical site prep |
| Circulating water blanket | Cincinnati Sub Zero | Blanketrol 2 | Body temp maintenance |
| Clippers - Wahl BravMini, Purple Hair clippers | Lambert Vet Supply | 008WA-41590-0438 | Surgical site prep |
| Conical tubes 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 | Tissue fixation and storage |
| Dry ice | N/A | N/A | PCR tissue samples |
| EtOH 200 proof | The Warner-Graham Company | 64-17-5 | Tissue storage |
| Heparin (optional) | Meitheal Pharmaceuticals | NDC 71288-402-11 | Dose: 200-600 IU/kg |
| Induction chamber | VetEquip | 941456 | |
| Indus Instruments THM100 Rodent Monitor | Indus Instruments | N/A | For monitoring rodent body temperature during surgery |
| Isopropyl Alcohol 70% | Humco | NDC 0395-4202-28 | For scrubbing surgical site |
| Microcentrifuge Tubes: 0.6mL | Fisher Scientific | 05-408-121 | PCR tissue samples. 8 per mouse, Terminal bleed collection, serum storage |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Nose cone | N/A | N/A | Can be homemade with syringe tube or bubble tubing |
| O2 medical air 21% | Roberts Oxygen | N/A | Rate: 0.5 L/min for each L chamber volume |
| Ophthalmic ointment | Akorn, Inc. | NDC 17478-062-35 | Surgical prep |
| PBS pH 7.4 (1x) | ThermoFisher Scientific | 10010-031 | For tissue rinsing and making 70% EtOH |
| Specimen cups | Cardinal Healthcare | C13005 | For holding tissue cassettes in formalin |
| Sterile Castroviejo Needle Holder | Roboz | RS-6412 | Surgical instrument |
| Sterile cotton swabs | Medline | BXTA50002Z | |
| Sterile gauze | Medline | PRM21423Z | |
| Sterile Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5980 | Surgical instrument |
| Sterile micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5693 | Surgical instrument |
| Sterile micro forceps | Roboz | RS-5264 | Surgical instrument |
| Sterile saline (0.9%) | Braun | R5201-01 | Must be warmed |
| Sterile scalpel blade #15 | Cardinal Health (Allegiance) | 32295-015 | Surgical instrument |
| Sterile scalpel handle | Roboz | RS-9843 | Surgical instrument |
| Sterile surgical drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Sterile surgical gloves | Medline | MSG2270 | |
| Sterile surgical stapler | Roboz | RS-9260 | Surgical instrument |
| Sterile surgical staples | Roboz | RS-9262 | Abdominal skin closure |
| Sterile suture: Vicryl (polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Needle | Ethicon | J212G | Closing abdominal muscle |
| Surgical tape | Medline | MMM15271Z | Securing mouse in dorsal recumbancy |
| Syringe 10 ml x 2 | Medline | SYR110010 | Flushing intestines with saline and formalin |
| Tissue cassettes | Fisher Scientific | 22-038-665 | Rolled intestinal segments. 4 per mouse. |
| Towel or drape | Medline | GEM2140 | Water blanket cover |
References
- Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Digestive Diseases and Sciences. 49, 1359-1377 (2004).
- Minguet, G., Joris, J., Lamy, M. Preconditioning and protection against ischaemia-reperfusion in non-cardiac organs: a place for volatile anaesthetics. European Journal of Anaesthesiology. 24 (9), 733-745 (2007).
- Cowled, P., Fitridge, R. Pathophysiology of reperfusion injury. Mechanisms of Vascular Disease: A Reference Book for Vascular Specialists. , University of Adelaide Press. 331-350 (2011).
- Grootjans, J., et al. Human intestinal ischemia-reperfusion-induced inflammation characterized: Experiences from a new translational model. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2283-2291 (2010).
- Sharp, C. R., Rozanski, E. A., Finn, E., Borrego, E. J. The pattern of mortality in dogs with gastric dilatation and volvulus. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 30 (2), 232-238 (2020).
- Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Veterinary Journal. 29 (6), 448-453 (1997).
- McMichael, M., Moore, R. M. Ischemia-reperfusion injury pathophysiology, part I. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 14 (4), 231-241 (2004).
- Kaneene, J. B., Ross, W. A., Miller, R. A. The Michigan equine monitoring system. II. Frequencies and impact of selected health problems. Preventive Veterinary Medicine. 29 (4), 277-292 (1997).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
- Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D'Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane post-conditioning protects against intestinal ischemia-reperfusion injury and multiorgan dysfunction via transforming growth factor-β1 generation. Annals of Surgery. 255 (3), 492-503 (2012).
- García, E. M. S. N., Taylor, J. H., Cenizo, N., Vaquero, C. Beneficial effects of intra-arterial and intravenous prostaglandin E1 in intestinal ischaemia-reperfusion injury. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 18 (4), 466-474 (2014).
- Liu, C., et al. Sevoflurane protects against intestinal ischemia-reperfusion injury partly by phosphatidylinositol 3 kinases/Akt pathway in rats. Surgery. 157 (5), 924-933 (2015).
- Shomer, N. H., et al.
- Diagnostic Necropsy and Tissue Harvest in Rodents. Lab Animal Research. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/v/10294/diagnostic-necropsy-and-tissue-harvest (2023).
- Scudamore, C. L. A Practical Guide to the Histology of the Mouse. , John Wiley and Sons. (2014).
- Scicchitano, M. S., et al. Preliminary comparison of quantity, quality, and microarray performance of RNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded, and unfixed frozen tissue samples. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (11), 1229-1237 (2006).
- Quaedackers, J. S. L. T., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplantation Proceedings. 32 (6), 1307-1310 (2000).
- Jablonski, P., et al. An experimental model for assessment of renal recovery from warm ischemia. Transplantation. 35 (3), 198-204 (1983).
- Du, H., et al. Hydrogen-rich saline attenuates acute kidney injury after liver transplantation via activating p53-mediated autophagy. Transplantation. 100 (3), 563-570 (2016).
- Suzuki, S., et al. The beneficial effect of a prostaglandin 12 analog on ischemic rat liver. Transplantation. 52 (6), 978-983 (1991).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Elsevier. (1965).
- Premen, A. J., et al. Importance of collateral circulation in the vascularly occluded feline intestine. Gastroenterology. 92 (5), 1215-1219 (1987).
- Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107 (5), 574-580 (1990).
- Guzmán-de La Garza, F. J., et al. Different patterns of intestinal response to injury after arterial, venous or arteriovenous occlusion in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (31), 3901-3907 (2009).
- Chang, J. X. Functional and morphological changes of the gut barrier during the restitution process after hemorrhagic shock. World Journal of Gastroenterology. 11 (35), 5485-5491 (2005).
- Illyes, G., Hamar, J. Sequence of morphological alterations in a small intestinal ischaemia/reperfusion model of the anesthetized rat. A light microscopy study. International Journal of Experimental Pathology. 73 (2), 161-172 (1992).
- Wilding, L. A., et al. Benefits of 21% oxygen compared with 100% oxygen for delivery of isoflurane to mice (Mus musculus) and rats (Rattus norvegicus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (2), 148-154 (2017).
- Ding, R., Zhao, D., Guo, R., Zhang, Z., Ma, X. Treatment with unfractionated heparin attenuates coagulation and inflammation in endotoxemic mice. Thrombosis Research. 128 (6), 160-165 (2011).
- Hayes, J. K., Havaleshko, D. M., Plachinta, R. V., Rich, G. F. Isoflurane pretreatment supports hemodynamics and leukocyte rolling velocities in rat mesentery during lipopolysaccharide-induced inflammation. Anesthesia and Analgesia. 98 (4), 999-1006 (2004).
- Miller, L. S., et al. Suppression of cytokine-lnduced neutrophil accumulation in rat mesenteric venules in vivo by general anesthesia. International Journal of Microcirculation. 16 (3), 147-154 (1996).
- Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D'Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane activates intestinal sphingosine kinase to protect against bilateral nephrectomy-induced liver and intestine dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 300 (1), 167-176 (2011).
- Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. The Journal of Surgical Research. 49 (2), 168-173 (1990).
- Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments. (111), 53881 (2016).
- Trompeter, M., Brazda, T., Remy, C. T., Vestring, T., Reimer, P. Non-occlusive mesenteric ischemia: Etiology, diagnosis, and interventional therapy. European Radiology. 12 (5), 1179-1187 (2002).
- Kozar, R. A., et al. Superior mesenteric artery occlusion models shock-induced gut ischemia-reperfusion. The Journal of Surgical Research. 116 (1), 145-150 (2004).
