Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Gnagermodell av intestinal iskemi-reperfusjonsskade via okklusjon av arteria mesenterica superior

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/64314
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3
1Animal Surgery and Resources Core, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2College of Veterinary Medicine, Mississippi State University, 3Division of Veterinary Resources, Office of Research Services, National Institutes of Health

Summary

Vi beskriver hvordan man kan generere en mye brukt kirurgisk modell av intestinal iskemi-reperfusjonsskade (IRI) hos gnagere. Prosedyren innebærer okklusjon av den øvre mesenteriske arterien etterfulgt av restaurering av blodstrømmen. Denne modellen er nyttig for studier som undersøker okklusive årsaker til intestinal IRI i både veterinær- og humanmedisin.

Abstract

Intestinal iskemi-reperfusjonsskade (IRI) er forbundet med en myriade av tilstander i både veterinær- og humanmedisin. Intestinale IRI-forhold, som gastrisk dilatasjonsvolvulus (GDV), mesenterisk torsjon og kolikk, observeres hos dyr som hunder og hester. En første avbrudd av blodstrømmen fører til at vev blir iskemisk. Selv om det er nødvendig for å berge levedyktig vev, kan etterfølgende reperfusjon indusere ytterligere skade. Hovedmekanismen som er ansvarlig for IRI er dannelse av frie radikaler ved reperfusjon og gjeninnføring av oksygen i skadet vev, men det er mange andre komponenter involvert. De resulterende lokale og systemiske effektene gir ofte en dårlig prognose.

Intestinal IRI har vært gjenstand for omfattende forskning de siste 50 årene. En in vivo gnagermodell der basen av arteria mesenterica superior (SMA) er midlertidig ligert, er for tiden den vanligste metoden som brukes til å studere intestinal IRI. Her beskriver vi en modell av intestinal IRI som benytter isoflurananestesi i 21%O2 medisinsk luft som gir reproduserbar skade, som demonstrert ved konsistent histopatologi i tynntarmen. Vevsskade ble også vurdert i tykktarm, lever og nyrer.

Introduction

Iskemi-reperfusjonsskade (IRI) kan forekomme i et hvilket som helst organ og involverer to sekvensielle komponenter. En innledende opphør av blodstrømmen fører til at berørte vev blir iskemiske, og deretter induserer etterfølgende reperfusjon ytterligere celleskade. Skader fra reperfusjonen overstiger ofte det som skyldes iskemi1. Patofysiologien til IRI innebærer en kompleks kaskade av hendelser, hvorav den mest bemerkelsesverdige er dannelse av frie radikaler ved gjeninnføring av oksygen, som oppstår under reperfusjon2. Aktivering av inflammatoriske celler og cytokiner spiller også en rolle2. Ved intestinal IRI kan bakteriell translokasjon i blodet etter endotelskade føre til systemisk inflammatorisk responssyndrom2. Hvis skaden på grunn av IRI er alvorlig nok, kan resulterende systemiske effekter føre til multiorgansvikt3.

Tilfeller av intestinal IRI er assosiert med høy morbiditet og dødelighet 4,5,6. Intestinal IRI er forbundet med mange patologiske tilstander og kirurgiske prosedyrer i både veterinær- og humanmedisin. I veterinærmedisin er dyr spesielt utsatt for intestinale IRI-tilstander, som gastrisk dilatasjonsvolvulus (GDV), mesenterisk torsjon og kolikk 7,8. Hos mennesker er IRI et stort og hyppig forekommende problem ved abdominal aortaaneurismekirurgi, strangulert brokk, akutt mesenterisk iskemi, volvulus, traume, sjokk, neonatal nekrotiserende enterokolitt og tarmreseksjon eller transplantasjon9.

De fleste in vivo gnagerstudier av intestinal IRI involverer okklusjon av basen av den øvre mesenteriske arterien (SMA), grenen av abdominal aorta som leverer blod til flertallet av tynntarmen og den proksimale delen av tykktarmen 10,11,12. Til tross for denne modellens utbredte bruk og relative enkelhet, er det ikke publisert en detaljert protokoll som bruker inhalasjonsbedøvelse i 21 %O2 medisinsk luft. Mangelen på en standardprotokoll utgjør vanskeligheter for forskere som ikke er kjent med prosedyren og forhindrer konsistens på tvers av studier. Vi demonstrerer trinnene som er nødvendige for å gjennomføre den kirurgiske modellen av intestinal IRI hos 8-14 uker gamle mannlige og kvinnelige sveitsiske Webster-mus. Denne modellen av intestinal IRI gir reproduserbar skade, som demonstrert ved konsistent histopatologi.

Protocol

Prosedyrene beskrevet her ble godkjent av National Heart, Lung, and Blood Institute Animal Care and Use Committee ved National Institutes of Health og er i samsvar med retningslinjene som er beskrevet i The Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals, The Animal Welfare Act, og Guide for Care and Use of Laboratory Animals.

1. Kirurgisk oppsett

  1. Følg aseptiske prosedyrer. Ta på deg en maske, hårdeksel og ren jumpsuit / labfrakk / kirurgiske skrubber.
  2. Forbered følgende steriliserte materialer: kirurgiske instrumenter (se materialtabell), varm saltvann, bomullspinner, gasbind, kirurgiske stifter, kirurgiske gardiner og hansker. Få også kirurgisk tape, som ikke trenger å steriliseres. Steriliser materialene med enten autoklav eller etylenoksid sterilisering teknikker.
  3. Plasser et oppvarmet sirkulerende vannteppe i operasjonsområdet og dekk det med et sterilt håndkle eller drapering.
  4. Bruk en presisjons isofluran fordamper, trykksatt medisinsk luft (21% O2), og en Bain ikke-rebreathing krets med en nesekegle designet for mus for å gi kirurgisk anestesi.

2. Dyr forberedelse

  1. Bedøv musen i et induksjonskammer ved å tilføre 2%-4% isofluran med 21%O2 medisinsk luft med en hastighet på 0,5 l/min for hver liter kammervolum.
    MERK: Det er å foretrekke å bruke 21% O2 medisinsk luft over 100% O2 for denne modellen, da metning av blodet med O2 kan forstyrre IRI.
  2. Fjern musen fra kammeret og flytt den til en ren overflate atskilt fra operasjonsområdet. Monter den med en nesekjegle som gir 1,5% isofluran med 21%O2 medisinsk luft.
  3. Injiser 1 mg/kg buprenorfin subkutant inn i det dorsale cervicothoracic området.
  4. Injiser 200-600 IE / kg heparin intraperitonealt for å forhindre trombedannelse i okklusjonsperioden.
  5. Påfør oftalmisk salve på øynene for å forhindre hornhinneskader.
  6. Fjern hår fra ventral mage ved hjelp av klippemaskiner.
  7. Flytt musen på det oppvarmede vannteppet i operasjonsområdet. Igjen, pass den med en nesekegle som leverer 1,5% isofluran med 21%O2 medisinsk luft for å oppnå et kirurgisk anestesiplan.
  8. Plasser musen i dorsalleie og fest lemmer til bordet med kirurgisk tape.
  9. Overvåk dyrets kroppstemperatur rektalt ved hjelp av et gnagerspesifikt termometer. Hold kroppstemperaturen på 36,5 ± 0,5 °C under hele operasjonen.
  10. Desinfiser ventral abdomen ved hjelp av sterilt gasbind gjennomvåt i enten klorhexidinskrubb eller povidon-jodskrubb, etterfulgt av 70% alkohol. Gjenta denne sekvensen tre ganger, vekslende mellom skrubb og alkohol. Et nytt sett med skrubber og alkoholgassbind skal brukes hver gang.
    1. Påfør skrubb og alkohol i en sirkulær bevegelse, starter med små sirkler i midten av operasjonsstedet og jobber gradvis mot kantene ved å øke størrelsen på sirklene. Kast gasbindet når kanten av operasjonsstedet er nådd. Ikke skrubb bakover fra kant til midt.
  11. Utfør en tåklemmetest (pedalrefleks) for å sikre at dyret er fullt bedøvet.
  12. Ta på deg sterile hansker. Aseptisk drapere operasjonsstedet.

3. Kirurgi og iskemi

  1. Lag et 3-5 cm ventralt midtlinjesnitt i huden ved hjelp av et #15 skalpellblad, dissekere det fritt fra den underliggende muskelfascien, og reflekter det lateralt. Fortsett snittet gjennom bukveggen langs linea alba ved hjelp av enten mikrodissekerende saks eller fjærbelastet mikrosaks og plasser en retractor på plass.
  2. Plasser sterile gasbindputer fuktet med varm steril saltvann rundt operasjonsområdet.
  3. Fjern tynntarmen fra bukhulen, vend den kranialt og til dyrets venstre side, og legg den på de fuktede padsene. Plasser en annen fuktet gasbindpute over vevet for å forhindre uttørking. Drypp regelmessig varm steril saltvann på gasbindet for å holde vevet fuktig.
  4. Isoler SMA, som ligger ventral til den nedre vena cava, caudal til cøliakiarterien og kranial til nyrearterien.
    MERK: Figur 1 viser plasseringen av SMA der den er isolert under operasjonen. SMA ligger normalt ventral til den nedre vena cava og strekker seg mot høyre. Når tarmene er eksteriorisert og vendt til venstre under operasjonen, ligger SMA til venstre for den dårligere vena cava.
  5. Plasser et atraumatisk mikrovaskulært klipp over bunnen av SMA hvor det grener av abdominal aorta, slik at klippet ikke okkluderer den øvre mesenteriske venen.
  6. Bekreft iskemi i tynntarmen ved å merke fargeendringen fra rosa til blekhvit og tap av mesenterisk pulsering.
  7. Returner viskaret til sin opprinnelige posisjon i bukhulen i løpet av den iskemiske perioden. Fjern retractoren og dekk snittet med fuktig gasbind. Legg regelmessig varm steril saltvann til gasbindet for å forhindre uttørking og opprettholde kroppstemperaturen.
  8. Etter en periode på 45 minutter med iskemi (hvis begynnelse er preget av den første applikasjonen av klippet), fjern det okkluderende klippet. Bekreft restaureringen av blodstrømmen ved å observere en mesenterisk pulsering og skyllet farge.
  9. Påfør varm steril saltvann intraperitonealt like før endelig lukking for å opprettholde passende hydrering.
  10. Lukk magemusklene med en 6-0 polyglactin 910 sutur. Administrer bupivakain (opptil 2 mg/kg) langs muskelsnittslangen for smertelindring. Lukk huden med kirurgiske stifter eller sårklemmer.

4. Gjenoppretting og reperfusjon

  1. Sett musen tilbake i et varmt kammer eller bur på et sirkulerende vannteppe, håndvarmer eller annen passende varmekilde. Lever 21 %O2 ved en strømningshastighet på 0,5 l/min for hver liter kammervolum. La musen komme seg her i 90 min. Overvåk musen hvert 5-10 minutt for tegn på smerte eller nød, for eksempel bøyd holdning, mysing og motvilje mot å bevege seg.

5. Eutanasi og blodinnsamling

  1. Ved slutten av restitusjonsperioden på 90 minutter, sett musen tilbake i induksjonskammeret og lever 2%-4% isofluran med 21%O2 med en hastighet på 0,5 l/min kammervolum for å indusere full anestesi på nytt.
  2. Overfør dyret tilbake til operasjonsområdet og tilpass det med en nesekjegle som gir 2% -4% isofluran med 21%O2 for å oppnå dyp anestesi.
    MERK: CO2 er ikke en egnet metode for eutanasi for denne prosedyren, da den induserer fysiologiske endringer som kan forstyrre iskemisk skade eller vevsanalytter13.
  3. Åpne det ventrale midtlinjesnittet igjen og utfør en terminal blødning ved å samle så mye blod som mulig fra abdominal vena cava ved hjelp av en 23 G nål og sprøyte. Forvent å samle mellom 0,3-0,5 ml blod (mindre hos mus som har gjennomgått IRI, mer hos de som fikk sham laparotomi).
    MERK: Formålet med den terminale blødningen er å hjelpe til med human eutanasi og å samle inn og bevare blod for fremtidig testing (dvs. serumkjemi, PCR, ELISA).
  4. Etter blodinnsamling kuttes abdominal aorta for å tillate fullstendig ekssanguinering.
  5. Utfør enten cervikal dislokasjon eller torakotomi som et sekundært tiltak for å sikre vellykket dødshjelp.

6. Vevsbehandling for histologi

  1. Etter eutanasi, samle de ønskede vevene. Sørg for at vevsbehandlingen gjøres omgående, da autolyse begynner umiddelbart etter døden14,15.
    1. Tarmer: Samle hele lengden av tynntarmen og tykktarmen. Kast cecum.
    2. Lever: Samle venstre laterale, venstre median og høyre medianlapper.
    3. Nyrer: Samle begge nyrene. Ved konvensjon er venstre nyre kuttet i lengderetningen, og høyre er kuttet som et tverrsnitt på tidspunktet for nekropsi.
      MERK: Tykktarmen, leveren og nyrene kan brukes til å vurdere multiorgansvikt eller andre systemiske effekter av IRI. Tynntarmen brukes til å vurdere primærskaden. Det er ikke nødvendig å holde styr på individuelle deler av leverlappen og nyrene, da hvert organ vil bli analysert og scoret som en enhet. Tarmsegmentene bør imidlertid holdes separat og deretter merket og scoret individuelt.
  2. Del tarmen i fire seksjoner: tolvfingertarm, jejunum, ileum og kolon. Sørg for at de tre små tarmsegmentene er like lange. Gjør dette ved å brette tynntarmen til en "Z" -form, hvor topplinjen er tolvfingertarmen, midtlinjen er jejunum, og bunnlinjen er ileum. Det er viktig å holde styr på den proksimale versus den distale enden.
  3. Skyll lumen i tarmsegmentene med saltvann ved hjelp av en 10 ml sprøyte festet med et 20 G angiokateter.
  4. Før du lager seksjoner, legg hvert tarmsegment flatt med luminalsiden vendt oppover. Bruk en 3 ml sprøyte festet med en 27 G kanyle og påfør sjenerøst 10 % bufret formalin dråpevis for å belegge hele slimhinnens lengde. Rull deretter hvert tarmsegment individuelt og legg i separate, merkede vevskasetter.
    1. For å rulle, legg hvert segment flatt med luminalsiden vendt opp, og rull deretter omkretsende rundt en tannpirker. Den proksimale delen skal danne den indre delen av rullen. Lumen skal vende mot innsiden/senteret. Prøv å rulle så forsiktig som mulig for å unngå å komprimere villi.
    2. Når den rulles, skal tarmen se ut som en sveitsisk rulle. Plasser den sveitsiske rullespiralen med forsiden opp inne i kassetten.
  5. Plasser vevet i merkede hetteglass fylt med 10% bufret formalin for å feste dem ved romtemperatur. Overfiksing er bedre enn underfiksing. Hetteglassene skal være store med rikelig med formalin - minst 20 ganger mer fikserende enn vev.
    1. Tarmer: Legg de fire kassettene sammen i en prøvekopp. Fiks for 24-48 timer.
    2. Lever: Plasser leverlappene sammen i et 50 ml konisk rør. Fiks for 24-48 timer.
    3. Nyrer: Plasser nyrene sammen i en 50 ml konisk slange. Fiks for 48-72 timer.
      MERK: Utrimmede nyrer tar lengre tid å fikse enn trimmede nyrer. For å forkorte fikseringstiden til 24-48 timer, kan nyrene kuttes langs medianplanet, langsgående (venstre nyre) og tverrgående (høyre nyre), og plasseres i kassetter før de blir avsatt i formalin.
  6. Etter at vevet er festet i formalin i den angitte tiden, skyll med fosfatbufret saltvann (PBS) eller destillert vann og overfør til merkede hetteglass fylt med 70% EtOH. Vevet kan lagres i EtOH på ubestemt tid ved romtemperatur mens man venter på histologi.
    1. Tarmer: Legg de fire kassettene sammen i en prøvekopp.
    2. Lever: Plasser leverlappene sammen i et 50 ml konisk rør.
    3. Nyrer: Plasser nyrene sammen i en 50 ml konisk slange.
  7. Når du er klar, må vevet behandles på glassglass ved hjelp av hematoksylin og eosin (H &E) farging. Trim de formalinfaste vevene og legg dem deretter inn i parafin. Monter fem mikron seksjoner på lysbildene og beis med H&E.

7. Vev scoring

  1. Vevsskåring bør fortrinnsvis utføres av erfarent personell som er blindet for prøvegruppene.
  2. Intestinal iskemi er skåret ved hjelp av Chiu / Park scoring system17.
  3. Nyreskade skåres ved hjelp av Jablonskis poengsystem18,19.
  4. Leverskade er scoret ved hjelp av Suzuki scoring system20,21.
    MERK: Det er mange scoring systemer som for tiden brukes for å vurdere vevskader i gnagere modeller av intestinal IRI. Skåringssystemene som ble brukt i denne studien ble valgt for å minimere vilkårlig estimering og for å maksimere intensjonell kvalitativ vurdering (tabell 1).

Representative Results

Vi demonstrerte en modell av intestinal IRI hos mus som ga konsistente og reproduserbare resultater. Tynntarm, proksimal colon, nyrer og lever ble seksjonert og farget med H&E. Veterinærpatolog graderte vevsskade ved hjelp av de tidligere nevnte skåringssystemene (tab 1). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av enkeltfaktoranalyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukeys post hoc med parvise sammenligninger, som bestemte hvorvidt det var en signifikant forskjell i dataene innenfor og på tvers av grupper. En p-verdi mindre enn eller lik 0,05 ble ansett som grenseverdien for å etablere statistisk signifikans. Alle statistiske tester og grafer ble utført i et regnearkprogram (f.eks. Microsoft Excel) med tillegget Real Statistics Resource Pack. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM).

Mikroskopiske lesjonsscore for de tre små tarmsegmentene (duodenum, jejunum og ileum) var signifikant økt for dyr som gjennomgikk intestinal iskemi-reperfusjonsskade (IRI; N = 7) versus de som gjennomgikk sham laparotomi (Sham; N = 6) (figur 2 og figur 3). Standardfeilen for disse dataene var smal, noe som viste konsistens av resultatene innenfor og på tvers av grupper. Hvert tarmsegment i Sham-gruppen ga nøyaktig samme gjennomsnittlige Park/Chiu-score på 0,83. SEM for duodenum, jejunum og ileum i Sham-gruppen var henholdsvis 0,31, 0,40 og 0,31. Gjennomsnittlig Park/Chiu-skår for duodenum, jejunum og ileum i IRI-gruppen var henholdsvis 4,07 ± 0,44, 4,14 ± 0,46 og 5,14 ± 0,40.

I denne studien døde 50% (3/6) av de første musene som gjennomgikk 60 min iskemi og 120 min reperfusjon (60/120 gruppe). To av de tre musene ble sendt inn til nekropsi. Begge musene hadde epitelnekrose, overbelastning og blødning i tynntarmen. I tillegg hadde musene lymfocytolyse, en uspesifikk forandring forbundet med fysiologisk stress. Ingen av musene hadde lesjoner i hjertet, lungene, leveren eller nyrene. Ved å forkorte tiden til 45 min iskemi og 90 min reperfusjon og legge til 400 IE/kg heparin (45/90/H-gruppen) senket man mortaliteten til 20 % (1/5) uten å endre tarmskadeskårene (figur 4). Gjennomsnittlig Park/Chiu-skår for 60/120-gruppen var 4,56 ± 0,38 (N = 3), og gjennomsnittsskår for 45/90/H-gruppen var 4,375 ± 0,38 (N = 4).

Mikroskopiske funn som tydet på skade i proksimal colon, lever og nyre ble ikke sett verken hos 60/120-musene eller 45/90/H-musene.

Tabell 1: Skåringssystemer for tarm, nyrer og lever. Tarmskadene ble gradert med Chiu/Park-systemet17. Nyreskade ble gradert ved hjelp av Jablonskis scoringssystem18,19. Leverskade ble gradert ved hjelp av Suzuki-scoringssystemet20,21. Denne tabellen er tilpasset med tillatelser fra skåringssystemer presentert i Quaedackers et al.17, Du et al.19 og Behrends et al.21. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 1
Figur 1 Lokalisering og isolering av a. mesenterica superior (SMA). (A) Normalt ligger SMA ventral til vena cava inferior og strekker seg mot dyrets høyre. Den ligger mellom cøliakiarterien og nyrearterien. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra The Anatomy of the Laboratory Mouse av Margaret Cook (1965)22. (B) I denne prosedyren blir tarmene eksteriorisert og vendt til venstre (dekket med fuktet gasbind i dette bildet), slik at SMA (gul pil) ligger til venstre for den dårligere vena cava (blå pil). Forkortelser: RK = høyre nyre; D = tolvfingertarmen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Små tarmsegmenter farget med hematoksylin og eosin. Seksjoner av jejunum (A) og ileum (B) fra mus i Sham-gruppen inneholdt villi som var lange og tynne uten forvrengning. Seksjoner av jejunum (C) og ileum (D) fra mus i IRI-gruppen inneholdt områder med nekrose (stjerner) og blødning med avstumping og forvrengning av de resterende villi (piler). Bildene er fra mus som gjennomgikk 45 min iskemi og 90 min reperfusjon og fikk 400 IE/kg heparin. Bildene ble tatt med 20x forstørrelse med 10% zoom. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Park/Chiu-skår for små tarmsegmenter. Mikroskopisk skade på alle tre tarmsegmentene (duodenum, jejunum og ileum) for dyr som gjennomgikk intestinal iskemi-reperfusjonsskade (IRI) var signifikant økt sammenlignet med de som gjennomgikk narrelaparotomi (Sham). * p < 0,05 for IRI versus Sham. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4 Park/Chiu-skår for tynntarm som gjennomgikk 60 min iskemi og 120 reperfusjon versus 45 min iskemi og 90 min reperfusjon med 400 IE/kg heparin. Reduksjon av tidene fra 60 min iskemi og 120 min reperfusjon (60/120) til 45 min iskemi og 90 min reperfusjon med 400 IE/kg heparin (45/90/H) skapte ingen statistisk signifikant forskjell i Park/Chiu-skadescore for tynntarmen hos mus i IRI-gruppen. Det reduserte imidlertid dødeligheten fra 50% til 20%. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Til tross for den utbredte bruken av denne intestinale IRI-modellen, er den ikke uten begrensninger. For eksempel, eneste okklusjon av bare basen av SMA ikke helt hindre blodstrømmen til tarmen. Dette skyldes sannsynligvis omfattende sikkerhetssirkulasjon i mesenteriet, som kan trekke blod fra nærliggende grener av abdominal aorta. I en studie hos katter reduserte SMA-okklusjon blodstrømmen med 35 % i proksimale tolvfingertarmen, 61 % i distale tolvfingertarmen, 71 % i jejunum og ileum og 63 % i proksimale colon. Blodgjennomstrømningen ble ikke redusert i midtre og distale colon, som får mye av sin sirkulasjon fra a. mesenterica inferior23. Hos gnagere er jejunum og ileum oftest oppgitt som de tarmsegmentene som medfører størst vevsskade etter SMA-okklusjon9.

Et bredt spekter av iskemitider etter SMA-okklusjon har blitt sitert i litteraturen, fra 1 til 90 min eller mer. Ulike iskemiske tider resulterer i forskjellige nivåer av reperfusjonsskade; Park et al. observerte reperfusjonsskade når det iskemiske intervallet var mellom 40 og 60 min, men ikke når det iskemiske intervallet var kortere eller lengre24. Slike resultater tyder på at kortere tider ikke gir nok iskemi til å fremkalle reperfusjonsskade, mens lengre tider skader vevet så alvorlig at det er umulig å påvise reperfusjonsskaden som følger. I tillegg bærer lengre iskemiske tider risikoen for økt dødelighet. Som vist i vår studie døde 50% (3/6) av de første musene som gjennomgikk 60 min iskemi etter bare 90 minutters reperfusjon. Forkortelse av iskemitiden til 45 minutter senket dødeligheten til 20% (1/5) uten å endre vevsskadeskårene. Basert på vår studie, ser det ut til at det ideelle vinduet for iskemisk skade kan oppnås ved SMA okklusjon i ca 45 min.

En annen variabel er reperfusjonstiden før vevssamling. Som med iskemitider, varierer reperfusjonstidene mye på tvers av studier, fra 60 minutter til over 24 timer. Flere artikler har rapportert at tarmslimhinnen medfører maksimal morfologisk skade ved 2 til 3 timers reperfusjon, med fullstendig reparasjon oppnådd ved 24 timer 25,26,27. Oppsamling av vev før dette 2 til 3 timers vinduet risikerer ikke å fange opp hele omfanget av reperfusjonsskaden, mens vev høstet nærmere 24 timer allerede har startet reparasjonsprosessen. Vi valgte først en reperfusjonstid på 120 min, men endret deretter til 90 min i et forsøk på å redusere dødeligheten. Denne endringen endret ikke vevsskaderesultatene, noe som tyder på at et avvik på 30 minutter fra 2 til 3 timers vinduet er akseptabelt.

Oksygenkonsentrasjon er også en viktig variabel i utviklingen av IRI. Wilding et al. fant at, sammenlignet med mus som fikk 21%O2, opplevde de bedøvede med isofluran levert med 100% O2 ventilasjon-perfusjonsfeil på grunn av atelektase. I samme studie utviklet rotter som fikk 100% O2 akutt respiratorisk acidose og forhøyet gjennomsnittlig arterielt trykk28. Slike fysiologiske endringer unngås best når man induserer en skade som IRI, der en rekke systemiske faktorer er involvert. Dermed synes 21% O2 å være mer hensiktsmessig enn 100% O2 som bærergass for isofluran levering.

Bruken av heparin i denne protokollen er åpen for debatt. Heparin er kjent for å ha antikoagulative og antiinflammatoriske effekter29. Vi fant at endring fra 60 min iskemi og 120 min reperfusjon til 45 min iskemi og 90 min reperfusjon med 400 IE/kg heparin ikke endret mikroskopisk tarmskade, men reduserte mortalitet. En mulig forklaring er at heparin forhindret dødelig tromboembolisme til fjerne organer som lunger og hjerne, men vi fant ikke holdepunkter for dette på nekropsi ved grov eller mikroskopisk undersøkelse av de to første musene som døde. Bruk av kortere iskemi og reperfusjonstider uten heparin kan være like effektivt for å redusere dødeligheten. Hvis det var tilfelle, ville det være klokt å avstå fra bruk av heparin for å minimere interferens med IRI. Imidlertid kan det være aktuelt å inkludere heparin i protokollen for de som ønsker å modellere kirurgiske årsaker til IRI, da kirurgiske pasienter ofte får heparin perioperativt.

Isofluran er vist å ha vevsbeskyttende effekt ved tarmbetennelse og iskemi, og bruken kan interferere med en klinisk relevant IRI-modell 30,31,32. Imidlertid er organofluorinhalanter (dvs. isofluran, sevofluran) ofte brukt anestetika i både veterinær- og humanmedisin. I tillegg overstiger anestesilengden som kreves for denne protokollen 120 minutter, og dermed er et sniffestoff mer hensiktsmessig enn en korttidsvirkende injeksjon som må doseres på nytt.

Ingen mikroskopiske lesjoner var tilstede i proksimale colon, lever eller nyre. Mangelen på mikroskopiske forandringer skyldtes kanskje den relativt korte reperfusjonstiden på 90 til 120 minutter. I tillegg har den proksimale kolon blodtilførsel fra den nedre mesenteriske arterien. Mangel på synlig skade utelukker imidlertid ikke systemisk skade. Revers transkripsjon-kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) er sannsynligvis en bedre metode for å demonstrere systemisk skade ved å måle inflammatoriske cytokiner som TNF-α.

Flere varianter av denne intestinale IRI-modellen har blitt utviklet gjennom årene. I 1990 viste Megison et al. at okkludering av sikkerhetsfartøy i tillegg til SMA ga en mer konsistent reduksjon av mesenterisk blodstrøm, men en økning i dødeligheten33. En nyere studie viste at i stedet for å okkludere SMA ved basen, ga ligering av perifere og sikkerhetsgrener for å indusere iskemi i distal ileum reproduserbar skade uten dødelighet34. Okklusjon av de lokale arterielle grener sikrer maksimal iskemi og kan løse problemet med multifokale, segmentelle reduksjoner av blodstrømmen sett med ligering av SMA bare ved basen. Mens denne alternative metoden for modellering av intestinal IRI har søknad om forskning på lokale vevseffekter av intestinal IRI, er det ukjent om det nøyaktig kan modellere systemisk betennelse og multiorgansvikt som kan være forbundet med tarmskade.

SMA okklusjon er ikke en passende modell for alle typer intestinal IRI. Ikke-okklusiv mesenterisk iskemi, for eksempel, er preget av splanknisk hypoperfusjon som stammer fra redusert hjerteutgang. Derfor ville denne teknikken ikke være optimal for å studere intestinal IRI forårsaket av hjerteinfarkt, kongestiv hjertesvikt, aortainsuffisiens eller nyre- eller leversykdom35. Kozar et al. rapporterte at SMA-okklusjon imidlertid er en klinisk relevant modell for tarm-IRI indusert av sjokk36. Selv om det er mindre økonomisk, kan bruk av andre arter som griser ha fordeler over gnagere for modellering av visse tarmskadeforhold. En omfattende gjennomgang av Gonzalez et al. i 2014 beskriver dyremodeller som for tiden er i bruk for å undersøke intestinal IRI9.

Til tross for begrensningene er teknikken for å okkludere SMA ved basen fortsatt en av de mest brukte gnagermodellene av intestinal iskemi9. Siden det bare krever en vaskulær klemme og et grunnleggende oppsett, er selve operasjonen ganske enkel. Det gir også reproduserbar skade, som det fremgår av dataene som presenteres her. SMA okklusjon hos gnagere kan pålitelig modellere okklusive årsaker til intestinal IRI og kan ha praktisk anvendelse i både veterinær og humanmedisin. Som sådan er det viktig at prosedyrene vi har skissert her, utføres med konsistens.

Disclosures

Forfatterne av denne artikkelen har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Finansiering for dette prosjektet ble gitt av Divisjon for intramural forskning ved National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health.

Vi vil gjerne takke Dr. James Hawkins for hans mentorskap og støtte. Vi takker også Dr. Mihai Oltean og Robert Linford for deres hjelp med å lokalisere arteria mesenterica superior. Vi ønsker å takke Dr. Patricia Carvalho Obeid Ellrich, Claudio Correa Natalini og George Howell III for å gi sin ekspertise under utviklingen av denne protokollen. Til slutt vil vi takke Stephen Wincovitch for hans hjelp med å skaffe de vakre fotomikrografene som er omtalt i denne artikkelen, og Dr. Alicia Olivier for hennes hjelp til å merke og gjengi de endelige tallene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adson forceps Roboz RS-5236 Surgical instrument
Alm retractor Roboz RS-6510 Surgical instrument
Anesthesia machine Datex-Ohmeda Aestiva 5
Anesthesia: isoflurane Baxter Healthcare Corporation NDC 10019-360-40 Dose: 1-4%, INH
Angiocath 20 g  x 2 Smiths Medical 5057 Flushing intestines with saline and formalin
Atraumatic microvascular clip Teleflex 065100 Surgical instrument
Buffered formalin 10% Fisher Scientific 23-245684 Tissue fixation
Bupivicaine 0.25% Hospira, Inc. NDC 0409-1160-18 Dose: up to 2 mg/kg drop-wise
Buprenorphine Par Pharmaceutical NDC 42023-179-05 Dose: 1 mg/kg, SQ
Chlorhexidine scrub 2% Vet One 510083 Surgical site prep
Circulating water blanket Cincinnati Sub Zero Blanketrol 2 Body temp maintenance
Clippers - Wahl BravMini, Purple Hair clippers Lambert Vet Supply 008WA-41590-0438 Surgical site prep
Conical tubes 50 ml Fisher Scientific 14-432-22 Tissue fixation and storage
Dry ice N/A N/A PCR tissue samples
EtOH 200 proof The Warner-Graham Company 64-17-5 Tissue storage
Heparin (optional) Meitheal Pharmaceuticals NDC 71288-402-11 Dose: 200-600 IU/kg
Induction chamber VetEquip 941456
Indus Instruments THM100 Rodent Monitor Indus Instruments N/A For monitoring rodent body temperature during surgery
Isopropyl Alcohol 70% Humco NDC 0395-4202-28 For scrubbing surgical site
Microcentrifuge Tubes: 0.6mL Fisher Scientific 05-408-121 PCR tissue samples. 8 per mouse, Terminal bleed collection, serum storage
Microsoft Excel Microsoft N/A
Nose cone N/A N/A Can be homemade with syringe tube or bubble tubing
O2 medical air 21% Roberts Oxygen N/A Rate: 0.5 L/min for each L chamber volume
Ophthalmic ointment Akorn, Inc. NDC 17478-062-35 Surgical prep
PBS pH 7.4 (1x) ThermoFisher Scientific 10010-031 For tissue rinsing and making 70% EtOH
Specimen cups Cardinal Healthcare C13005 For holding tissue cassettes in formalin
Sterile Castroviejo Needle Holder Roboz RS-6412 Surgical instrument
Sterile cotton swabs Medline BXTA50002Z
Sterile gauze Medline PRM21423Z
Sterile Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5980 Surgical instrument
Sterile micro dissecting spring scissors Roboz RS-5693 Surgical instrument
Sterile micro forceps Roboz RS-5264 Surgical instrument
Sterile saline (0.9%) Braun R5201-01 Must be warmed
Sterile scalpel blade #15 Cardinal Health (Allegiance) 32295-015 Surgical instrument
Sterile scalpel handle Roboz RS-9843 Surgical instrument
Sterile surgical drape Medline DYNJSD1092
Sterile surgical gloves Medline MSG2270
Sterile surgical stapler Roboz RS-9260 Surgical instrument
Sterile surgical staples Roboz RS-9262 Abdominal skin closure
Sterile suture: Vicryl (polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Needle Ethicon J212G Closing abdominal muscle
Surgical tape Medline MMM15271Z Securing mouse in dorsal recumbancy
Syringe 10 ml x 2 Medline SYR110010 Flushing intestines with saline and formalin
Tissue cassettes Fisher Scientific 22-038-665 Rolled intestinal segments. 4 per mouse.
Towel or drape Medline GEM2140 Water blanket cover

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Digestive Diseases and Sciences. 49, 1359-1377 (2004).
  2. Minguet, G., Joris, J., Lamy, M. Preconditioning and protection against ischaemia-reperfusion in non-cardiac organs: a place for volatile anaesthetics. European Journal of Anaesthesiology. 24 (9), 733-745 (2007).
  3. Cowled, P., Fitridge, R. Pathophysiology of reperfusion injury. Mechanisms of Vascular Disease: A Reference Book for Vascular Specialists. , University of Adelaide Press. 331-350 (2011).
  4. Grootjans, J., et al. Human intestinal ischemia-reperfusion-induced inflammation characterized: Experiences from a new translational model. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2283-2291 (2010).
  5. Sharp, C. R., Rozanski, E. A., Finn, E., Borrego, E. J. The pattern of mortality in dogs with gastric dilatation and volvulus. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 30 (2), 232-238 (2020).
  6. Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Veterinary Journal. 29 (6), 448-453 (1997).
  7. McMichael, M., Moore, R. M. Ischemia-reperfusion injury pathophysiology, part I. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 14 (4), 231-241 (2004).
  8. Kaneene, J. B., Ross, W. A., Miller, R. A. The Michigan equine monitoring system. II. Frequencies and impact of selected health problems. Preventive Veterinary Medicine. 29 (4), 277-292 (1997).
  9. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  10. Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D'Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane post-conditioning protects against intestinal ischemia-reperfusion injury and multiorgan dysfunction via transforming growth factor-β1 generation. Annals of Surgery. 255 (3), 492-503 (2012).
  11. García, E. M. S. N., Taylor, J. H., Cenizo, N., Vaquero, C. Beneficial effects of intra-arterial and intravenous prostaglandin E1 in intestinal ischaemia-reperfusion injury. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 18 (4), 466-474 (2014).
  12. Liu, C., et al. Sevoflurane protects against intestinal ischemia-reperfusion injury partly by phosphatidylinositol 3 kinases/Akt pathway in rats. Surgery. 157 (5), 924-933 (2015).
  13. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (3), 242-253 (2020).
  14. Diagnostic Necropsy and Tissue Harvest in Rodents. Lab Animal Research. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/v/10294/diagnostic-necropsy-and-tissue-harvest (2023).
  15. Scudamore, C. L. A Practical Guide to the Histology of the Mouse. , John Wiley and Sons. (2014).
  16. Scicchitano, M. S., et al. Preliminary comparison of quantity, quality, and microarray performance of RNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded, and unfixed frozen tissue samples. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (11), 1229-1237 (2006).
  17. Quaedackers, J. S. L. T., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplantation Proceedings. 32 (6), 1307-1310 (2000).
  18. Jablonski, P., et al. An experimental model for assessment of renal recovery from warm ischemia. Transplantation. 35 (3), 198-204 (1983).
  19. Du, H., et al. Hydrogen-rich saline attenuates acute kidney injury after liver transplantation via activating p53-mediated autophagy. Transplantation. 100 (3), 563-570 (2016).
  20. Suzuki, S., et al. The beneficial effect of a prostaglandin 12 analog on ischemic rat liver. Transplantation. 52 (6), 978-983 (1991).
  21. Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
  22. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Elsevier. (1965).
  23. Premen, A. J., et al. Importance of collateral circulation in the vascularly occluded feline intestine. Gastroenterology. 92 (5), 1215-1219 (1987).
  24. Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107 (5), 574-580 (1990).
  25. Guzmán-de La Garza, F. J., et al. Different patterns of intestinal response to injury after arterial, venous or arteriovenous occlusion in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (31), 3901-3907 (2009).
  26. Chang, J. X. Functional and morphological changes of the gut barrier during the restitution process after hemorrhagic shock. World Journal of Gastroenterology. 11 (35), 5485-5491 (2005).
  27. Illyes, G., Hamar, J. Sequence of morphological alterations in a small intestinal ischaemia/reperfusion model of the anesthetized rat. A light microscopy study. International Journal of Experimental Pathology. 73 (2), 161-172 (1992).
  28. Wilding, L. A., et al. Benefits of 21% oxygen compared with 100% oxygen for delivery of isoflurane to mice (Mus musculus) and rats (Rattus norvegicus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (2), 148-154 (2017).
  29. Ding, R., Zhao, D., Guo, R., Zhang, Z., Ma, X. Treatment with unfractionated heparin attenuates coagulation and inflammation in endotoxemic mice. Thrombosis Research. 128 (6), 160-165 (2011).
  30. Hayes, J. K., Havaleshko, D. M., Plachinta, R. V., Rich, G. F. Isoflurane pretreatment supports hemodynamics and leukocyte rolling velocities in rat mesentery during lipopolysaccharide-induced inflammation. Anesthesia and Analgesia. 98 (4), 999-1006 (2004).
  31. Miller, L. S., et al. Suppression of cytokine-lnduced neutrophil accumulation in rat mesenteric venules in vivo by general anesthesia. International Journal of Microcirculation. 16 (3), 147-154 (1996).
  32. Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D'Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane activates intestinal sphingosine kinase to protect against bilateral nephrectomy-induced liver and intestine dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 300 (1), 167-176 (2011).
  33. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. The Journal of Surgical Research. 49 (2), 168-173 (1990).
  34. Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments. (111), 53881 (2016).
  35. Trompeter, M., Brazda, T., Remy, C. T., Vestring, T., Reimer, P. Non-occlusive mesenteric ischemia: Etiology, diagnosis, and interventional therapy. European Radiology. 12 (5), 1179-1187 (2002).
  36. Kozar, R. A., et al. Superior mesenteric artery occlusion models shock-induced gut ischemia-reperfusion. The Journal of Surgical Research. 116 (1), 145-150 (2004).

Tags

Intestinal iskemi-reperfusjonsskade gnagermodell okklusjon av mesenterisk arterie gastrisk dilatasjonsvolvulus mesenterisk torsjon kolikk friradikaldannelse oksygengjeninnføring dårlig prognose in vivo-modell isoflurananestesi reproduserbar skade histopatologi tynntarm tykktarm lever nyrer
Gnagermodell av intestinal iskemi-reperfusjonsskade via okklusjon av arteria mesenterica superior
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Henein, L., Clevenger, R., Keeran,… More

Henein, L., Clevenger, R., Keeran, K., Brinster, L. Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery. J. Vis. Exp. (200), e64314, doi:10.3791/64314 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter