העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 למודלים של עכברים הנגרמים על ידי בלומיצין כדי לחקור את השפעתם על פיברוזיס ריאתי אידיופתי in vivo

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של מקרופאגים אינטרסטיציאליים ריאתיים (IMs) ואת העברתם המאומצת לאחר גירוי IL-33 של נאדיות הריאה במודל עכבר, אשר יכול להקל על מחקר in vivo של פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF).

Abstract

התגובה הדלקתית הנגרמת על ידי פגיעה ריאתית מוקדמת היא אחד הגורמים החשובים להתפתחות פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF), המלווה בהפעלת תאים דלקתיים כגון מקרופאגים ונויטרופילים, כמו גם שחרור של גורמים דלקתיים כולל TNF-α, IL-1β ו- IL-6. דלקת מוקדמת הנגרמת על ידי מקרופאגים אינטרסטיציאליים ריאתיים פעילים (IMs) בתגובה לגירוי IL-33 ידועה כממלאת תפקיד חיוני בתהליך הפתולוגי של IPF. פרוטוקול זה מתאר העברה מאומצת של IMs שעוררו IL-33 לריאות של עכברים כדי לחקור את התפתחות IPF. היא כוללת בידוד ותרבית של IMs ראשוניים מריאות עכבר מארח, ולאחר מכן העברה מאומצת של IMs מעוררים לתוך alveoli של עכברים מושתלי IPF המושרה על ידי בלומיצין (BLM) (אשר כבר רוקנו בעבר מקרופאגים alveolar על ידי טיפול עם ליפוזומים clodronate), ואת ההערכה הפתולוגית של עכברים אלה. התוצאות המייצגות מראות כי העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 מחמירה פיברוזיס ריאתי בעכברים, דבר המצביע על כך שהקמת ניסוי העברת המקרופאגים המאמצת היא אמצעי טכני טוב לחקר פתולוגיה של IPF.

Introduction

פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF) היא מחלה דלקתית ריאתית מפושטת הנגרמת על ידי גורמים רבים¹. במיקרו-סביבה הציטוקינים של התגובה החיסונית Th1 ו-Th2, מקרופאגים יכולים להיות מקוטבים למקרופאגים המופעלים באופן קלאסי (M1) ולמקרופאגים מופעלים לחלופין (M2). ליפופוליסכרידים (LPS) או הציטוקין IFN- γ גורמים למקרופאגים M1 לקטב ולייצר ציטוקינים מעודדי דלקת, כולל iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α ו-IL-12. לעומת זאת, ציטוקינים מסוג II IL-4 ו-IL-13 מניעים את הקיטוב של מקרופאגים M2, אשר יכולים לייצר גורמים שונים המעודדים גדילה של פיברובלסטים, כגון TGF-β ו-PDGF, המקדמים פיברוזיס ריאתי². התהליך הפתולוגי של IPF מלווה בהפעלת מקרופאגים וחדירה. IPF מתווך תיקון פציעות, דלקת ופיברוזיס באמצעות שחרור ציטוקינים³. מכיוון שרק אפשרויות טיפוליות מוגבלות זמינות, חקירת המנגנונים הפתולוגיים המולקולריים של IPF היא בעלת משמעות רבה לפיתוח אסטרטגיות חדשות למניעה וטיפול ב- IPF. מחקרים קודמים של הקבוצה שלנו וחוקרים אחרים ^4,5 אישרו את השחרור המוגבר של IL-33 בחולי IPF ובמודלים של עכברים עם IPF המושרה על ידי בלומיצין (BLM). IL-33 משתחרר על-ידי תאי אפיתל ואנדותל במהלך פיברוזיס ומעורב בהפעלת מקרופאגים, מה שגורם להתרבות חריגה של פיברובלסטים, הסננת לויקוציטים, ובסופו של דבר אובדן תפקוד ריאות⁵. הפרוטוקול הנוכחי מתאר העברה מאומצת של מקרופאגים אינטרסטיציאליים (IMs) מעוררי IL-33 לתוך הנאדיות כאמצעי לחקר התפתחות IPF במודלים של עכברים. כאן, IMs בודדו מרקמת הריאה של עכברים מארחים, גודלו בתרבית במבחנה, עוררו עם IL-33 במשך 24 שעות, ולאחר מכן הועברו באופן מאומץ לנאדיות של עכברים מושתלים על ידי הזרקת קנה הנשימה. האיסוף הישיר של מקרופאגים עכבריים מעוררים והעברתם המאומצת לנאדיות המקבל נמצא כמחמיר את מידת הפיברוזיס הריאתי ויכול להמחיש בצורה ברורה יותר את ההשפעה של גורמים מעוררים על פיברוזיס בהשוואה למחקרים קודמים⁶. הטכניקה המתוארת במאמר זה יכולה לאפשר לחוקרים לחקור את תפקודם של מקרופאגים המעוררים על ידי ציטוקינים פוטנציאליים בהתפתחות IPF.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה הניסויית לרווחת בעלי חיים באוניברסיטת ג’יאנגנאן (JN No. 20211130m1720615[501]). הערה: במחקר זה נעשה שימוש בסך הכל ב-10 עכברים זכרים מסוג C57BL/6 בגילאי 6-8 שבועות ובמשקל 20-25 גרם. שלוש …

Representative Results

הפרוטוקול המשמש כאן מסוכם בתרשים הזרימה באיור 1. שאיפת ליפוזומים קלודרונט דרך האף (איור 2) שימשה לדלדול המקרופאגים הריאתיים של עכברי C57BL/6 בוגרים, וזה יצר מודל טוב של עכבר מושתל. בדיקות מיידיות ריאתיות בודדו מעכבר אחר (מארח) שלא טופל (איור 3A,B) ו?…

Discussion

מחקר זה מספק שיטה יעילה לדלדול, בידוד, תרבית והעברת מקרופאגים, אשר יכולה לסייע בחקר המנגנונים של פיברוזיס ריאתי בעכברים. ישנן שיטות רבות לדלדול מקרופאגים בעכברים, כגון ניהול קנה הנשימה, הזרקת ורידים בזנב ושאיפת אף¹¹. מחקר זה ייעל את שיטת שאיפת האף, שהיא פשוטה לתפעול ויכולה לרוק?…

Materials

DMEM	Life technologies Biotechnology,USA	1508012
Arterial indwelling needle	B Braun Melsingen AG,Germany	21G15G8393
BD Accuri C6 Plus	Becton Dickinson,USA
Bleomycin	Biotang, USA	Ab9465
Carbon dioxide incubator	Thermo Forma, USA	Thermo Forma370
CD11b	R&D Systems,USA	1124F
CD11c	R&D Systems,USA	N418
Cell culture dish	Thermo Forma, USA	174926
Clodronate liposomes	Clodronate liposomes,Netherlands	CI-150-150
Collagenase A	Sigma-Aldrich, USA	10103578001
F4/80	R&D Systems,USA	521204
Falcon Cell Strainer	Becton,Dickinson and Company, USA	352340
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies,USA	1047571
Hematoxylin Eosin	Nanjing Jiancheng Technology,China	06-570
LightCycler 480 PCR detection system	Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33	Peprotech, USA	210-33
Nikon microscope	Nikon Corporation, Japan	941185
Penicillin, streptomycin	Life technologies,USA	877113
Phosphate buffer (PBS)	Guangdong Huankai Microbial Technology ,China	1535882
RBC lysis buffer	Beyotime Biotechnology Company,China	C3702
RNA Isolater	Vazyme company,China	R401-01-AA	Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine	Shenzhen Rayward Life Technology ,China	R500
Semi-automatic paraffin slicer	Leica, Germany	LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq	Takara, Japan	410800
Trypsin 0.25%	Life Technologies, USA	1627172