Trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 in modelli murini indotti da bleomicina per studiare il loro effetto sulla fibrosi polmonare idiopatica in vivo

Summary

Questo protocollo descrive l’isolamento dei macrofagi interstiziali polmonari (IM) e il loro trasferimento adottivo dopo stimolazione IL-33 degli alveoli polmonari in un modello murino, che può facilitare lo studio in vivo della fibrosi polmonare idiopatica (IPF).

Abstract

La risposta infiammatoria causata da lesioni polmonari precoci è una delle cause importanti dello sviluppo della fibrosi polmonare idiopatica (IPF), che è accompagnata dall’attivazione di cellule infiammatorie come macrofagi e neutrofili, nonché dal rilascio di fattori infiammatori tra cui TNF-α, IL-1β e IL-6. È noto che l’infiammazione precoce causata dall’attivazione dei macrofagi interstiziali polmonari (IM) in risposta alla stimolazione di IL-33 svolge un ruolo vitale nel processo patologico dell’IPF. Questo protocollo descrive il trasferimento adottivo di IMs stimolati da IL-33 nei polmoni dei topi per studiare lo sviluppo dell’IPF. Coinvolge l’isolamento e la coltura di IM primari dai polmoni del topo ospite, seguito dal trasferimento adottivo di IM stimolati negli alveoli di topi riceventi IPF indotti da bleomicina (BLM) (che sono stati precedentemente impoveriti di macrofagi alveolari dal trattamento con liposomi clodronati) e la valutazione patologica di quei topi. I risultati rappresentativi mostrano che il trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 aggrava la fibrosi polmonare nei topi, suggerendo che l’istituzione dell’esperimento di trasferimento adottivo dei macrofagi è un buon mezzo tecnico per studiare la patologia dell’IPF.

Introduction

La fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia infiammatoria polmonare diffusa causata da molti fattori¹. Nel microambiente delle citochine della risposta immunitaria Th1 e Th2, i macrofagi possono essere polarizzati in macrofagi classicamente attivati (M1) e alternativamente attivati macrofagi (M2). I lipopolisaccaridi (LPS) o la citochina IFN- γ inducono i macrofagi M1 a polarizzarsi e produrre citochine pro-infiammatorie, tra cui iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. Al contrario, le citochine di tipo II IL-4 e IL-13 guidano la polarizzazione dei macrofagi M2, che possono produrre diversi fattori promotori della crescita dei fibroblasti, come TGF-β e PDGF, che promuovono la fibrosi polmonare². Il processo patologico dell’IPF è accompagnato dall’attivazione e dall’infiltrazione dei macrofagi. L’IPF media la riparazione delle lesioni, l’infiammazione e la fibrosi attraverso il rilascio di citochine³. Poiché sono disponibili solo opzioni terapeutiche limitate, l’esplorazione dei meccanismi patologici molecolari dell’IPF ha un grande significato per lo sviluppo di nuove strategie per la prevenzione e il trattamento dell’IPF. Precedenti studi del nostro gruppo e di altri ricercatori ^4,5 hanno confermato l’aumento del rilascio di IL-33 nei pazienti con IPF e in modelli murini con IPF indotta da bleomicina (BLM). IL-33 viene rilasciato dalle cellule epiteliali ed endoteliali durante la fibrosi ed è coinvolto nell’attivazione dei macrofagi, con conseguente proliferazione anormale dei fibroblasti, infiltrazione leucocitaria e l’eventuale perdita della funzione polmonare⁵. L’attuale protocollo descrive il trasferimento adottivo di macrofagi interstiziali stimolati da IL-33 (IM) negli alveoli come mezzo per studiare lo sviluppo dell’IPF in modelli murini. Qui, gli IM sono stati isolati dal tessuto polmonare dei topi ospiti, coltivati in vitro, stimolati con IL-33 per 24 ore e quindi trasferiti adottivamente negli alveoli dei topi riceventi mediante iniezione tracheale. La raccolta diretta di macrofagi di topo stimolati e il loro trasferimento adottivo negli alveoli riceventi è risultato aggravare il grado di fibrosi polmonare e può illustrare più chiaramente l’influenza dei fattori stimolanti sulla fibrosi rispetto agli studi precedenti⁶. La tecnica descritta in questo articolo può consentire ai ricercatori di esplorare la funzione dei macrofagi stimolati da potenziali citochine nello sviluppo dell’IPF.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico sperimentale per il benessere degli animali dell’Università di Jiangnan (JN n. 20211130m1720615[501]). NOTA: In totale, in questo studio sono stati utilizzati 10 topi maschi C57BL / 6 di età compresa tra 6-8 settimane e del peso di 20-25 g. I tre gruppi sperimentali nello studio includeva…

Representative Results

Il protocollo utilizzato qui è riepilogato nel diagramma di flusso nella Figura 1. L’inalazione di liposomi clodronati attraverso il naso (Figura 2) è stata utilizzata per esaurire i macrofagi polmonari dei topi adulti C57BL / 6, e questo ha prodotto un buon modello murino ricevente. Gli IM polmonari sono stati isolati da un altro topo non trattato (ospite) (Figura 3A,B) e coltivati in vitro. I macrofagi…

Discussion

Questo studio fornisce un metodo efficace per esaurire, isolare, coltivare e trasferire i macrofagi, che può aiutare a studiare i meccanismi della fibrosi polmonare nei topi. Esistono molti metodi per l’esaurimento dei macrofagi di topo, come la somministrazione tracheale, l’iniezione della vena caudale e l’inalazione nasale¹¹. Questo studio ha ottimizzato il metodo di inalazione nasale, che è semplice da utilizzare e può effettivamente esaurire i macrofagi polmonari <su…

Materials

DMEM	Life technologies Biotechnology,USA	1508012
Arterial indwelling needle	B Braun Melsingen AG,Germany	21G15G8393
BD Accuri C6 Plus	Becton Dickinson,USA
Bleomycin	Biotang, USA	Ab9465
Carbon dioxide incubator	Thermo Forma, USA	Thermo Forma370
CD11b	R&D Systems,USA	1124F
CD11c	R&D Systems,USA	N418
Cell culture dish	Thermo Forma, USA	174926
Clodronate liposomes	Clodronate liposomes,Netherlands	CI-150-150
Collagenase A	Sigma-Aldrich, USA	10103578001
F4/80	R&D Systems,USA	521204
Falcon Cell Strainer	Becton,Dickinson and Company, USA	352340
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies,USA	1047571
Hematoxylin Eosin	Nanjing Jiancheng Technology,China	06-570
LightCycler 480 PCR detection system	Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33	Peprotech, USA	210-33
Nikon microscope	Nikon Corporation, Japan	941185
Penicillin, streptomycin	Life technologies,USA	877113
Phosphate buffer (PBS)	Guangdong Huankai Microbial Technology ,China	1535882
RBC lysis buffer	Beyotime Biotechnology Company,China	C3702
RNA Isolater	Vazyme company,China	R401-01-AA	Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine	Shenzhen Rayward Life Technology ,China	R500
Semi-automatic paraffin slicer	Leica, Germany	LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq	Takara, Japan	410800
Trypsin 0.25%	Life Technologies, USA	1627172