Адоптивный перенос IL-33-стимулированных макрофагов в блеомицин-индуцированные мышиные модели для изучения их влияния на идиопатический легочный фиброз in vivo

Summary

Этот протокол описывает выделение легочных интерстициальных макрофагов (ИМ) и их адоптивный перенос после стимуляции IL-33 альвеол легких на мышиной модели, что может облегчить исследование идиопатического легочного фиброза (IPF) in vivo .

Abstract

Воспалительная реакция, вызванная ранним повреждением легких, является одной из важных причин развития идиопатического легочного фиброза (ИЛФ), который сопровождается активацией воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы, а также высвобождением воспалительных факторов, включая TNF-α, IL-1β и IL-6. Известно, что раннее воспаление, вызванное активированными легочными интерстициальными макрофагами (ИМ) в ответ на стимуляцию IL-33, играет жизненно важную роль в патологическом процессе IPF. Этот протокол описывает адоптивный перенос IM, стимулированных IL-33, в легкие мышей для изучения развития IPF. Он включает в себя выделение и культивирование первичных IM из легких мыши-хозяина с последующим приемным переносом стимулированных IM в альвеолы мышей-реципиентов IPF, индуцированных блеомицином (BLM) (которые ранее были истощены альвеолярными макрофагами путем лечения клодронатными липосомами) и патологическую оценку этих мышей. Репрезентативные результаты показывают, что адоптивный перенос макрофагов, стимулированных IL-33, усугубляет легочный фиброз у мышей, что позволяет предположить, что проведение эксперимента по адоптивному переносу макрофагов является хорошим техническим средством для изучения патологии IPF.

Introduction

Идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) – это диффузное воспалительное заболевание легких, вызванное многими факторами¹. В цитокиновом микроокружении иммунного ответа Th1 и Th2 макрофаги могут быть поляризованы на классически активированные макрофаги (M1) и альтернативно активированные макрофаги (M2). Липополисахариды (ЛПС) или цитокин ИФН-γ индуцируют макрофаги М1 поляризоваться и продуцировать провоспалительные цитокины, включая iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α и IL-12. Напротив, цитокины II типа IL-4 и IL-13 управляют поляризацией макрофагов M2, которые могут продуцировать различные факторы, стимулирующие рост фибробластов, такие как TGF-β и PDGF, которые способствуют легочному фиброзу². Патологический процесс ИЛФ сопровождается активацией и инфильтрацией макрофагов. IPF опосредует восстановление травмы, воспаление и фиброз за счет высвобождения цитокинов³. Поскольку доступны лишь ограниченные терапевтические возможности, изучение молекулярных патологических механизмов ИЛФ имеет большое значение для разработки новых стратегий профилактики и лечения ИЛФ. Предыдущие исследования, проведенные нашей группой и другими исследователями ^4,5, подтвердили повышенное высвобождение IL-33 у пациентов с IPF и на мышиных моделях с блеомицином (BLM)-индуцированным IPF. IL-33 высвобождается эпителиальными и эндотелиальными клетками во время фиброза и участвует в активации макрофагов, что приводит к аномальной пролиферации фибробластов, инфильтрации лейкоцитов и, в конечном итоге, к потере функции легких⁵. Текущий протокол описывает адоптивный перенос IL-33-стимулированных интерстициальных макрофагов (IM) в альвеолы в качестве средства изучения развития IPF на мышиных моделях. Здесь IM выделяли из легочной ткани мышей-хозяев, культивировали in vitro, стимулировали IL-33 в течение 24 ч, а затем адоптивно переносили в альвеолы мышей-реципиентов путем инъекции в трахею. Было обнаружено, что прямой сбор стимулированных макрофагов мыши и их адаптационный перенос в альвеолы реципиента усугубляет степень легочного фиброза и может более наглядно проиллюстрировать влияние стимулирующих факторов на фиброз по сравнению с предыдущими исследованиями⁶. Метод, описанный в этой статье, может позволить исследователям изучить функцию макрофагов, стимулируемых потенциальными цитокинами, в развитии IPF.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментального благополучия животных Университета Цзяннань (JN No 20211,130m1720615[501]). ПРИМЕЧАНИ?…

Representative Results

Используемый здесь протокол кратко изложен на блок-схеме на рисунке 1. Вдыхание клодронатных липосом через нос (рис. 2) использовалось для истощения легочных макрофагов взрослых мышей C57BL / 6, и это дало хорошую модель мыши-реципиента. Легочные IM были выдел?…

Discussion

Это исследование предоставляет эффективный метод истощения, изоляции, культивирования и переноса макрофагов, который может помочь в изучении механизмов легочного фиброза у мышей. Существует множество методов истощения макрофагов мыши, таких как введение в трахею, инъекция в хвостову…

Materials

DMEM	Life technologies Biotechnology,USA	1508012
Arterial indwelling needle	B Braun Melsingen AG,Germany	21G15G8393
BD Accuri C6 Plus	Becton Dickinson,USA
Bleomycin	Biotang, USA	Ab9465
Carbon dioxide incubator	Thermo Forma, USA	Thermo Forma370
CD11b	R&D Systems,USA	1124F
CD11c	R&D Systems,USA	N418
Cell culture dish	Thermo Forma, USA	174926
Clodronate liposomes	Clodronate liposomes,Netherlands	CI-150-150
Collagenase A	Sigma-Aldrich, USA	10103578001
F4/80	R&D Systems,USA	521204
Falcon Cell Strainer	Becton,Dickinson and Company, USA	352340
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies,USA	1047571
Hematoxylin Eosin	Nanjing Jiancheng Technology,China	06-570
LightCycler 480 PCR detection system	Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33	Peprotech, USA	210-33
Nikon microscope	Nikon Corporation, Japan	941185
Penicillin, streptomycin	Life technologies,USA	877113
Phosphate buffer (PBS)	Guangdong Huankai Microbial Technology ,China	1535882
RBC lysis buffer	Beyotime Biotechnology Company,China	C3702
RNA Isolater	Vazyme company,China	R401-01-AA	Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine	Shenzhen Rayward Life Technology ,China	R500
Semi-automatic paraffin slicer	Leica, Germany	LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq	Takara, Japan	410800
Trypsin 0.25%	Life Technologies, USA	1627172