Transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 en modelos de ratón inducidos por bleomicina para estudiar su efecto sobre la fibrosis pulmonar idiopática in vivo
Summary
Este protocolo describe el aislamiento de macrófagos intersticiales pulmonares (MI) y su transferencia adoptiva después de la estimulación de IL-33 de los alvéolos pulmonares en un modelo de ratón, lo que puede facilitar el estudio in vivo de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI).
Abstract
La respuesta inflamatoria causada por la lesión pulmonar temprana es una de las causas importantes del desarrollo de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), que se acompaña de la activación de células inflamatorias como macrófagos y neutrófilos, así como la liberación de factores inflamatorios como TNF-α, IL-1β e IL-6. Se sabe que la inflamación temprana causada por macrófagos intersticiales pulmonares (IM) activados en respuesta a la estimulación de IL-33 desempeña un papel vital en el proceso patológico de la FPI. Este protocolo describe la transferencia adoptiva de IMs estimulados por IL-33 a los pulmones de ratones para estudiar el desarrollo de FPI. Implica el aislamiento y cultivo de MI primarios de pulmones de ratón huésped, seguido de la transferencia adoptiva de MI estimulados a los alvéolos de ratones receptores de FPI inducidos por bleomicina (BLM) (que han sido previamente agotados de macrófagos alveolares por tratamiento con liposomas clodronatos), y la evaluación patológica de esos ratones. Los resultados representativos muestran que la transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 agrava la fibrosis pulmonar en ratones, lo que sugiere que el establecimiento del experimento de transferencia adoptiva de macrófagos es un buen medio técnico para estudiar la patología de la FPI.
Introduction
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad inflamatoria pulmonar difusa causada por muchos factores1. En el microambiente de citoquinas de la respuesta inmune Th1 y Th2, los macrófagos pueden polarizarse en macrófagos activados clásicamente (M1) y macrófagos activados alternativamente (M2). Los lipopolisacáridos (LPS) o la citoquina IFN-γ inducen a los macrófagos M1 a polarizarse y producir citoquinas proinflamatorias, incluyendo iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. En contraste, las citoquinas tipo II IL-4 e IL-13 impulsan la polarización de los macrófagos M2, que pueden producir diferentes factores promotores del crecimiento de fibroblastos, como TGF-β y PDGF, que promueven la fibrosis pulmonar2. El proceso patológico de la FPI se acompaña de activación e infiltración de macrófagos. La FPI media la reparación de lesiones, la inflamación y la fibrosis a través de la liberación de citoquinas3. Como solo se dispone de opciones terapéuticas limitadas, explorar los mecanismos patológicos moleculares de la FPI tiene gran importancia para desarrollar nuevas estrategias para la prevención y el tratamiento de la FPI. Estudios previos realizados por nuestro grupo y otros investigadores 4,5 han confirmado el aumento de la liberación de IL-33 en pacientes con FPI y en modelos de ratón con FPI inducida por bleomicina (BLM). La IL-33 es liberada por las células epiteliales y endoteliales durante la fibrosis y está involucrada en la activación de macrófagos, lo que resulta en la proliferación anormal de fibroblastos, la infiltración de leucocitos y la eventual pérdida de la función pulmonar5. El protocolo actual describe la transferencia adoptiva de macrófagos intersticiales (IM) estimulados por IL-33 en los alvéolos como un medio para estudiar el desarrollo de FPI en modelos de ratón. Aquí, los IM se aislaron del tejido pulmonar de ratones huéspedes, se cultivaron in vitro, se estimularon con IL-33 durante 24 h y luego se transfirieron adoptivamente a los alvéolos de los ratones receptores mediante inyección traqueal. Se encontró que la recolección directa de macrófagos de ratón estimulados y su transferencia adoptiva a los alvéolos receptores agrava el grado de fibrosis pulmonar y puede ilustrar más claramente la influencia de los factores estimulantes en la fibrosis en comparación con los estudios previos6. La técnica descrita en este documento puede permitir a los investigadores explorar la función de los macrófagos estimulados por citoquinas potenciales en el desarrollo de la FPI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio proporciona un método eficaz para agotar, aislar, cultivar y transferir macrófagos, lo que puede ayudar a estudiar los mecanismos de la fibrosis pulmonar en ratones. Existen muchos métodos para el agotamiento de macrófagos en ratones, como la administración traqueal, la inyección de venas de la cola y la inhalación nasal11. Este estudio optimizó el método de inhalación nasal, que es fácil de operar y puede agotar eficazmente los macrófagos pulmonares</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el tema especial de gestión de laboratorio de la Universidad de Jiangnan: construcción de una biblioteca digital basada en muestras patológicas (JDSYS202223) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81800065).
Materials
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
Riferimenti
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