생체 내에서 특발성 폐 섬유증에 미치는 영향을 연구하기 위해 IL-33 자극 대식세포를 블레오마이신 유도 마우스 모델로 입양 전달
Summary
이 프로토콜은 특발성 폐 섬유증(IPF)의 생체 내 연구를 용이하게 할 수 있는 마우스 모델에서 폐포의 IL-33 자극 후 폐 간질 대식세포(IM)의 분리 및 입양 전달을 설명합니다.
Abstract
조기 폐 손상으로 인한 염증 반응은 특발성 폐 섬유증 (IPF) 발병의 중요한 원인 중 하나이며, 이는 대 식세포 및 호중구와 같은 염증 세포의 활성화뿐만 아니라 TNF-α, IL-1β 및 IL-6을 포함한 염증 인자의 방출을 동반합니다. IL-33 자극에 반응하여 활성화된 폐 간질성 대식세포(IM)에 의해 유발되는 초기 염증은 IPF의 병리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 프로토콜은 IPF 발달을 연구하기 위해 IL-33에 의해 자극된 IM을 마우스의 폐로 입양 전달하는 것을 설명합니다. 여기에는 숙주 마우스 폐에서 1차 IM을 분리 및 배양한 다음, 자극된 IM을 블레오마이신(BLM) 유도 IPF 수용자 마우스(이전에 클로드로네이트 리포솜으로 처리하여 폐포 대식세포가 고갈됨)의 폐포로 이식하는 것과 해당 마우스의 병리학적 평가가 포함됩니다. 대표적인 결과는 IL-33 자극 대식세포의 입양 전이가 마우스에서 폐 섬유증을 악화시킨다는 것을 보여주며, 이는 대식세포 입양 전이 실험의 확립이 IPF 병리를 연구하기 위한 좋은 기술적 수단임을 시사한다.
Introduction
특발성 폐섬유증(IPF)은 여러 요인에 의해 유발되는 미만성 폐염증성 질환이다1. Th1 및 Th2 면역 반응의 사이토카인 미세환경에서, 대식세포는 고전적으로 활성화된 대식세포(M1) 및 대안적으로 활성화된 대식세포(M2)로 분극화될 수 있다. 지질다당류(LPS) 또는 사이토카인 IFN-γ M1 대식세포가 분극화되도록 유도하고 iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α 및 IL-12를 포함하는 전염증성 사이토카인을 생성합니다. 대조적으로, II형 사이토카인 IL-4 및 IL-13은 폐 섬유증2를 촉진하는 TGF-β 및 PDGF와 같은 다양한 섬유아세포 성장 촉진 인자를 생성할 수 있는 M2 대식세포의 분극을 유도합니다. IPF의 병리학적 과정은 대식세포 활성화 및 침윤을 동반한다. IPF는 사이토카인의 방출을 통해 손상 복구, 염증 및 섬유증을 매개한다3. 제한된 치료 옵션만 사용할 수 있기 때문에 IPF의 분자 병리학적 메커니즘을 탐색하는 것은 IPF 예방 및 치료를 위한 새로운 전략을 개발하는 데 큰 의미가 있습니다. 우리 그룹과 다른 연구자들에 의한이전 연구4,5는 IPF 환자와 블레오마이신(BLM) 유도 IPF가 있는 마우스 모델에서 IL-33의 증가된 방출을 확인했습니다. IL-33은 섬유화 과정에서 상피세포와 내피세포에서 분비되어 대식세포 활성화에 관여하여 섬유아세포의 비정상적인 증식, 백혈구 침윤 및 궁극적인 폐 기능 상실을 초래한다5. 현재 프로토콜은 마우스 모델에서 IPF 발달을 연구하기 위한 수단으로서 IL-33 자극 간질 대식세포(IM)를 폐포로 입양 전달하는 것을 설명합니다. 여기서, 숙주 마우스의 폐 조직으로부터 IM을 분리하고, 시험관 내에서 배양하고, 24시간 동안 IL-33으로 자극한 다음, 기관 주사에 의해 수용자 마우스의 폐포로 입양적으로 옮겼다. 자극된 마우스 대식세포의 직접 수집과 수용자 폐포로의 입양 전달은 폐 섬유증의 정도를 악화시키는 것으로 밝혀졌으며 이전 연구에 비해 자극 인자의 섬유증 영향을 보다 명확하게 설명할 수 있다6. 이 논문에 기술된 기술은 연구자들이 IPF의 발달에서 잠재적인 사이토카인에 의해 자극된 대식세포의 기능을 탐구할 수 있게 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 생쥐의 폐 섬유증 메커니즘을 연구하는 데 도움이 될 수 있는 대식세포를 고갈, 분리, 배양 및 전달하는 효과적인 방법을 제공합니다. 마우스 대식세포 고갈을 위한 많은 방법들이 있는데, 기관투여(tracheal administration), 꼬리 정맥 주사(tail vein injection), 비강 흡입(nasal inhalation)과 같다11. 이 연구는 작동이 간단하고 폐 대식세포를 효과적으로 고갈시킬 수 있는 비강 흡입 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Jiangnan University의 실험실 관리 특별 주제: 병리학적 표본을 기반으로 한 디지털 슬라이스 라이브러리 구축(JDSYS202223)과 중국 국립 자연 과학 재단(81800065)을 인정합니다.
Materials
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
Riferimenti
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