Transferência Adotiva de Macrófagos Estimulados por IL-33 em Modelos de Camundongos Induzidos por Bleomicina para Estudar seu Efeito na Fibrose Pulmonar Idiopática In Vivo

Summary

Este protocolo descreve o isolamento de macrófagos intersticiais (MIs) pulmonares e sua transferência adotiva após estimulação com IL-33 dos alvéolos pulmonares em modelo murino, o que pode facilitar o estudo in vivo da fibrose pulmonar idiopática (FPI).

Abstract

A resposta inflamatória causada pela lesão pulmonar precoce é uma das causas importantes do desenvolvimento da fibrose pulmonar idiopática (FPI), que é acompanhada pela ativação de células inflamatórias, como macrófagos e neutrófilos, bem como pela liberação de fatores inflamatórios, incluindo TNF-α, IL-1β e IL-6. Sabe-se que a inflamação precoce causada por macrófagos intersticiais (MIs) pulmonares ativados em resposta à estimulação com IL-33 desempenha um papel vital no processo patológico da FPI. Este protocolo descreve a transferência adotiva de MIs estimuladas por IL-33 para os pulmões de camundongos para estudar o desenvolvimento de FPI. Envolve o isolamento e a cultura de MIs primárias de pulmões de camundongos hospedeiros, seguida pela transferência adotiva de MIs estimuladas para os alvéolos de camundongos receptores de FPI induzidos por bleomicina (BLM) (que foram previamente depletados de macrófagos alveolares pelo tratamento com lipossomas clodronatos) e a avaliação patológica desses camundongos. Os resultados representativos mostram que a transferência adotiva de macrófagos estimulados por IL-33 agrava a fibrose pulmonar em camundongos, sugerindo que o estabelecimento do experimento de transferência adotiva de macrófagos é um bom meio técnico para estudar a patologia da FPI.

Introduction

A fibrose pulmonar idiopática (FPI) é uma doença inflamatória pulmonar difusa causada por vários^fatores1. No microambiente de citocinas da resposta imune Th1 e Th2, os macrófagos podem ser polarizados em macrófagos classicamente ativados (M1) e, alternativamente, macrófagos ativados (M2). Os lipopolissacarídeos (LPS) ou a citocina IFN-γ induzem macrófagos M1 a polarizar e produzir citocinas pró-inflamatórias, incluindo iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. Em contraste, as citocinas tipo II IL-4 e IL-13 conduzem a polarização dos macrófagos M2, que podem produzir diferentes fatores promotores de crescimento de fibroblastos, como TGF-β e PDGF, que promovem fibrose pulmonar². O processo patológico da FPI é acompanhado por ativação e infiltração de macrófagos. A FPI medeia o reparo da lesão, inflamação e fibrose por meio da liberação de citocinas³. Como apenas opções terapêuticas limitadas estão disponíveis, explorar os mecanismos patológicos moleculares da FPI tem grande importância para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e tratamento da FPI. Estudos prévios realizados por nosso grupo e por outros pesquisadores ^4,5 confirmaram o aumento da liberação de IL-33 em pacientes com FPI e em modelos de camundongos com FPI induzida por bleomicina (BLM). A IL-33 é liberada pelas células epiteliais e endoteliais durante a fibrose e está envolvida na ativação de macrófagos, resultando na proliferação anormal de fibroblastos, infiltração leucocitária e eventual perda da função pulmonar⁵. O protocolo atual descreve a transferência adotiva de macrófagos intersticiais (MIs) estimulados por IL-33 para os alvéolos como um meio de estudar o desenvolvimento de FPI em modelos de camundongos. Aqui, as MIs foram isoladas do tecido pulmonar de camundongos hospedeiros, cultivadas in vitro, estimuladas com IL-33 por 24 h e, em seguida, transferidas adotivamente para os alvéolos de camundongos receptores por injeção traqueal. A coleta direta de macrófagos de camundongos estimulados e sua transferência adotiva para os alvéolos receptores agravou o grau de fibrose pulmonar e pode ilustrar mais claramente a influência dos fatores estimulantes na fibrose em comparação com os estudos anteriores⁶. A técnica descrita neste trabalho pode permitir que os pesquisadores explorem a função de macrófagos estimulados por potenciais citocinas no desenvolvimento da FPI.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Bem-Estar Animal Experimental da Universidade de Jiangnan (JN No. 20211130m1720615[501]). NOTA: No total, 10 camundongos C57BL/6 machos com idade entre 6-8 semanas e pesando 20-25 g foram usados neste estudo. Os três grupos experimentais do estudo incluíram três camundongos receptores cada, e um camund…

Representative Results

O protocolo aqui utilizado está resumido no fluxograma da Figura 1. A inalação de lipossomas clodronados pelo nariz (Figura 2) foi utilizada para esgotar os macrófagos pulmonares de camundongos adultos C57BL/6, o que produziu um bom modelo de camundongo receptor. As MIs pulmonares foram isoladas de outro camundongo (hospedeiro) não tratado (Figura 3A,B) e cultivadas in vitro. Os macrófagos isolados f…

Discussion

Este estudo fornece um método eficaz para depletar, isolar, cultivar e transferir macrófagos, o que pode ajudar no estudo dos mecanismos de fibrose pulmonar em camundongos. Existem vários métodos para a depleção de macrófagos em camundongos, como administração traqueal, injeção na veia caudal e inalação nasal¹¹. Este estudo otimizou o método de inalação nasal, que é simples de operar e pode efetivamente esgotar macrófagos^{pulmonares 8,9}<sup class…

Materials

DMEM	Life technologies Biotechnology,USA	1508012
Arterial indwelling needle	B Braun Melsingen AG,Germany	21G15G8393
BD Accuri C6 Plus	Becton Dickinson,USA
Bleomycin	Biotang, USA	Ab9465
Carbon dioxide incubator	Thermo Forma, USA	Thermo Forma370
CD11b	R&D Systems,USA	1124F
CD11c	R&D Systems,USA	N418
Cell culture dish	Thermo Forma, USA	174926
Clodronate liposomes	Clodronate liposomes,Netherlands	CI-150-150
Collagenase A	Sigma-Aldrich, USA	10103578001
F4/80	R&D Systems,USA	521204
Falcon Cell Strainer	Becton,Dickinson and Company, USA	352340
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies,USA	1047571
Hematoxylin Eosin	Nanjing Jiancheng Technology,China	06-570
LightCycler 480 PCR detection system	Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33	Peprotech, USA	210-33
Nikon microscope	Nikon Corporation, Japan	941185
Penicillin, streptomycin	Life technologies,USA	877113
Phosphate buffer (PBS)	Guangdong Huankai Microbial Technology ,China	1535882
RBC lysis buffer	Beyotime Biotechnology Company,China	C3702
RNA Isolater	Vazyme company,China	R401-01-AA	Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine	Shenzhen Rayward Life Technology ,China	R500
Semi-automatic paraffin slicer	Leica, Germany	LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq	Takara, Japan	410800
Trypsin 0.25%	Life Technologies, USA	1627172