Summary
I samkultursystemet af dorsale rodganglier og Schwann-celler kan myelinering af det perifere nervesystem undersøges. Denne model giver eksperimentelle muligheder for at observere og kvantificere perifer myelinering og studere virkningerne af forbindelser af interesse på myelinskeden.
Abstract
Myelineringsprocessen er afgørende for at muliggøre hurtig og tilstrækkelig signaltransduktion i nervesystemet. I det perifere nervesystem engagerer neuroner og Schwann-celler sig i en kompleks interaktion for at kontrollere myelinering af axoner. Forstyrrelser af denne interaktion og nedbrydning af myelinskeden er kendetegnende for inflammatoriske neuropatier og forekommer sekundært i neurodegenerative lidelser. Her præsenterer vi en samkulturmodel af dorsalrodganglioneksplanter og Schwann-celler, som udvikler en robust myelinering af perifere axoner for at undersøge myelineringsprocessen i det perifere nervesystem, studere axon-Schwann-celleinteraktioner og evaluere de potentielle virkninger af terapeutiske midler på hver celletype separat. Metodisk blev dorsale rodganglioner af embryonale rotter (E13.5) høstet, adskilt fra deres omgivende væv og dyrket som hele eksplanter i 3 dage. Schwann-celler blev isoleret fra 3 uger gamle voksne rotter, og iskiasnerverne blev enzymatisk fordøjet. De resulterende Schwann-celler blev renset ved magnetisk aktiveret cellesortering og dyrket under neuregulin- og forskolin-berigede betingelser. Efter 3 dages dorsal rodganglion explant kultur blev 30.000 Schwann-celler tilsat til en dorsal rodganglion explant i et medium indeholdende ascorbinsyre. De første tegn på myelinisering blev påvist på dag 10 af cokultur gennem spredte signaler for myelinbasisk protein i immunocytokemisk farvning. Fra dag 14 og fremefter blev myelinskeder dannet og formeret langs axonerne. Myelinering kan kvantificeres ved myelinbasisk proteinfarvning som et forhold mellem myelineringsområdet og axonarealet for at tage højde for forskellene i aksonal densitet. Denne model giver eksperimentelle muligheder for at studere forskellige aspekter af perifer myelinering in vitro, hvilket er afgørende for at forstå patologien og mulige behandlingsmuligheder for demyelinering og neurodegeneration i inflammatoriske og neurodegenerative sygdomme i det perifere nervesystem.
Introduction
I det perifere nervesystem (PNS) medieres hurtig informationstransduktion af myelinindpakkede axoner. Myelinering af axoner er afgørende for at muliggøre hurtig udbredelse af elektriske impulser, da ledningshastigheden af nervefibrene korrelerer med axondiameteren og myelintykkelsen1. Sensorisk signalering fra periferien til centralnervesystemet (CNS) er afhængig af aktiveringen af førsteordens sensoriske neuroner, der befinder sig i udvidelser af dorsalroden, kaldet dorsale rodganglier (DRG). Til dannelse og vedligeholdelse af myelin er kontinuerlig kommunikation mellem axoner og Schwann-celler, som er de myeliniserende gliaceller i PNS, obligatorisk2.
Mange sygdomme i PNS forstyrrer transduktionen af information ved enten primær aksonal eller demyeliniserende skade, hvilket resulterer i hypestesi eller dysestesi. Førsteordens sensoriske neuroner har evnen til at regenerere i et omfang efter neuronal skade ved en kompleks interaktion mellem neuronen og omgivende Schwann-celler3. I dette tilfælde kan Schwann-celler gennemgå cellulær omprogrammering for at rydde aksonalt såvel som myelinaffald og fremme aksonal regenerering, hvilket resulterer i remyelinering4. Det er vigtigt at forstå mekanismerne for myelinering i sundhed og sygdom for at finde mulige behandlingsmuligheder for demyeliniserende lidelser i PNS. Myelin kan også blive beskadiget af akut neurotrauma, og tilgange til at fremme myelinering for at fremme funktionel genopretning efter perifer nerveskade er under undersøgelse5.
Vores viden om perifer myelinering har i høj grad haft gavn af myeliniserende cokulturer af Schwann-celler og sensoriske neuroner. Siden de første metoder blev anvendt 6,7,8, er myelinering blevet undersøgt intenst ved brug af forskellige samkultursystemer9,10,11. Her leverer vi en hurtig og let protokol til robust in vitro myelinering af dorsale rodganglionaxoner. Protokollen for Schwann-celleforberedelse er baseret på protokollen af Andersen et al.12, tidligere offentliggjort i Pitarokoili et al.13. Vi bruger Schwann-celler fra unge rotter og embryonale DRG-eksplantatkulturer til samkulturen, hvor myelinering forekommer omkring dag 14. Målet med metoden er at tilvejebringe et system til at undersøge dannelsen af myelin som følge af direkte axon-Schwann-celleinteraktion og at studere modulatorer af PNS-myelinisering. I sammenligning med dissocierede neuronale cellekulturer er DRG-eksplanter mere anatomisk bevaret og danner lange aksonale processer. Kvantificering af det myelinerede axonområde giver en tilstrækkelig aflæsning til myelinering i samkulturen. Metoden er et værdifuldt værktøj til at screene terapeutiske forbindelser for deres potentielle virkning på PNS-myelinering og kan også anvendes som supplement til in vivo-undersøgelser i dyremodeller14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers rådsdirektiv om pasning og anvendelse af forsøgsdyr.
1. Schwann-cellekultur
- Belægning til Schwann-cellekultur
- Overtræk cellekulturskålene under sterile forhold. Påfør 2 ml 0,01% poly-L-lysin (PLL) på to 60 mm vævskultur (TC) skåle hver og inkuber natten over ved 4 °C.
- PLL'en fjernes, TC-skålene vaskes 2x med destilleret vand, og der inkuberes med 2 ml 1 μg/cm2 laminin natten over ved 4 °C. Vask TC-skålene 2x med aqua dest, og lad pladerne lufttørre.
- Medium forberedelse til Schwann-cellekultur
- Forbered 50 ml Schwann-cellemedium ved at tilsætte 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS), 2 μM forskolin, 10 nM neuregulin og 50 μg / ml gentamycin til Dulbeccos modificerede ørns medium (DMEM) / F-12 (høj glukose) under sterile forhold.
- Forbered 70 ml Leibovitz's L-15 medium med 50 μg/ml gentamycin under sterile forhold.
- Forberedelse af iskiasnerven
BEMÆRK: Alle trin til forberedelse af iskiasnerven udføres under en ren bænk.- Tilbered en 100 mm TC-skål med 5 ml iskold Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) uden Ca 2+ og Mg2+, en 100 mm TC-skål med 5 ml iskold Leibovitz' L-15-medium og en 100 mm TC-skål med 5 ml iskold Leibovitz' L-15-medium og 50 μg/ml gentamycin.
- Rengør alle instrumenter ved hjælp af autoklavering. Sprøjt instrumenterne og arbejdsområdet med 70% ethanol.
- Aflive fem 3 uger gamle Sprague Dawley-hanrotter ved hjælp af CO2 indånding og halshugning. Sprøjt rottens torso med 70% ethanol.
- Åbn den dorsale nederste venstre lem med en saks og fjern biceps femoris-musklen forsigtigt. Løsn iskiasnerven ved glat højde med buede tang, og sørg for ikke at blå mærker nerven.
- Hold den mest proksimale del af nerven med de buede tang for at rette nerven, og klip nerven så højt som muligt ved hjælp af en saks. Klip derefter nerven tæt på den sakrale plexus og poten med en saks. Gentag trin 1.3.4-1.3.5 for højre side.
BEMÆRK: Mens du åbner lemmet, skal du passe på ikke at blå mærker blodkar. - Brug tang til at sætte venstre og højre iskiasnerver i en 100 mm TC-skål med iskold DPBS.
- Renovering af iskiasnerven
- Brug tang til at overføre alle nerverne til en 100 mm TC-skål med iskold Leibovitz's L-15 medium og 50 μg/ml gentamycin. Fortsæt med at bruge et stereomikroskop og fjern fedt, muskler og blodkar fra nerverne med to par fine tang. Tag fat i nerverne med tang og overfør dem til en 100 mm TC-skål med iskold Leibovitzs L-15-medium.
- Identificer de proksimale og distale ender af iskiasnerven. Fjern epineurium med et par fine tang i en proksimal til distal retning, mens du holder den proksimale nerveende med det andet par fine tang.
- Overfør de rensede nerver til en 100 mm TC-skål med iskold Leibovitz's L-15 medium og 50 μg/ml gentamycin. Drille de isolerede nervefascikler for at adskille og isolere enkelte nervefibre ved hjælp af to par fine tang.
- Overfør nervefibrene til et 50 ml rør ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette og tag så lidt medium som muligt. Tilsæt 50 ml Leibovitz's L-15 medium med 50 μg / ml gentamycin til nervefibrene og slew et par gange i 50 ml røret.
- Enzymatisk fordøjelse af iskiasnerven
BEMÆRK: De næste trin (trin 1.5-1.8, 2.1 og 2.2) udføres under sterile forhold.- Forbered den enzymatiske fordøjelsesopløsning indeholdende 0,25% dispase II, 0,05% type I collagenase og 50 μg/ml gentamycin i 10 ml DMEM (høj glucose).
- Centrifuger røret ved 188 x g i 5 minutter ved 4 °C, fjern supernatanten med en 25 ml serologisk pipette, og overfør pellet med det resterende Leibovitz's L-15-medium til en 60 mm TC-skål ved hjælp af en 1.000 ml pipette.
- Skyl 50 ml røret med 10 ml af den enzymatiske fordøjelsesopløsning og tilsæt det til skålen indeholdende nervefibrene. Fordel vævet i skålen forsigtigt med spidsen af en pipette for at maksimere den tilgængelige overflade til fordøjelse.
- Inkuber ved 37 °C og 5% CO 2 i 18 timer, og stop fordøjelsen ved at tilsætte 10 ml 40% FCS i Hanks' afbalancerede saltopløsning uden Ca2 og Mg2+ (HBSS).
- Celleseparation
- De fordøjede nerver overføres til et 50 ml glas ved hjælp af en serologisk pipette og centrifugeres ved 188 x g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 10 ml DMEM indeholdende 10 % FCS og 50 μg/ml gentamycin. Resuspender pellet 20 gange efterfølgende ved hjælp af en 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml og 200 μL pipettespids.
- Cellesuspensionen filtreres gennem en 100 μm cellesi, og centrifugeres ved 188 x g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes med 4 ml DMEM indeholdende 10 % FCS og 50 μg/ml gentamycin.
- Der tilsættes 2 ml cellesuspension til hver af de to PLL- og laminincoatede 60 mm TC-skåle, og der inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2. Lad pladerne være uberørte i 2 dage i inkubatoren for at beskytte cellerne mod mekanisk belastning og for at understøtte vedhæftning.
- Schwann-celledifferentiering
- Efter 2 dage fjernes mediet og pladerne skylles forsigtigt 2x med DMEM (høj glukose), 10% FCS og 50 μg/ml gentamycin. Derefter tilsættes 2 ml Schwann-cellemedium. Udskift Schwann-cellemediet hver 2. dag, og observer cellens udseende og sammenløb ved hjælp af et mikroskop.
BEMÆRK: Schwann-celler og DRG-eksplanter skal forberedes rettidigt og koordineret til samkulturen. Sørg for, at en rotte med embryoner på E 13,5 er tilgængelig til DRG-forberedelse, når Schwann-cellerne er tæt på et sammenløb på 80%.
- Efter 2 dage fjernes mediet og pladerne skylles forsigtigt 2x med DMEM (høj glukose), 10% FCS og 50 μg/ml gentamycin. Derefter tilsættes 2 ml Schwann-cellemedium. Udskift Schwann-cellemediet hver 2. dag, og observer cellens udseende og sammenløb ved hjælp af et mikroskop.
- Celle trypsinisering og magnetisk adskillelse
BEMÆRK: For eksempler på billeder af forskellige Schwann-cellekulturstadier, se supplerende figur 1.- Når cellerne når et sammenløb på ca. 80% (6-12 dages dyrkning), vaskes pladerne forsigtigt 2x med 3 ml DPBS og inkuberes med 2 ml 0,05% trypsin / EDTA (forvarmet til 37 ° C) i 3 minutter. Når cellerne løsner sig fra pladebunden, inaktiveres fordøjelsen ved tilsætning af 2 ml DMEM med 10% FCS og 50 μg/ml gentamycin.
BEMÆRK: Hold dig til en trypsiniseringstid på strengt 3 minutter, og fortsæt hurtigt bagefter. - Resuspender cellepelleten i 2 ml magnetisk celleseparationsbuffer indeholdende DPBS med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 2 nM EDTA. Kombiner 10 μL af cellesuspensionen med 10 μL trypanblåt, og tæl cellerne ved hjælp af et farvningskammer.
- Cellesuspensionen centrifugeres ved 188 x g i 10 minutter ved 4 °C, og cellepelletsen resuspenderes i 90 μL magnetisk celleseparationsbuffer pr. 1 x 107 celler. Tilsæt 10 μL Thy-1 mikroperler pr. 1 x 107 celler. Opløsningen resuspenderes et par gange og inkuberes i 15 minutter i mørke ved 8 °C.
- Der tilsættes 2 ml magnetcelleseparationsbuffer til cellesuspensionen, og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og pelletsen resuspenderes i 500 μl magnetisk celleseparationsbuffer.
- Fugt den magnetiske celleseparationskolonne med 1 ml magnetisk celleseparationsbuffer. Placer magnetcelleseparationskolonnen i magnetcelleseparatoren. Påfør cellerne på den magnetiske celleseparationskolonne. Gennemstrømningen opsamles og centrifugeres ved 300 x g ved 4 °C i 10 minutter.
BEMÆRK: Fibroblaster vælges positivt og forbliver i kolonnen, mens Schwann-celler passerer søjlen. Fibroblaster kan indsamles med et stempel (fx som en negativ kontrol for Schwann-cellefarvningsprotokoller). - Supernatanten kasseres, og pellets resuspenderes i 1 ml af kokultursubstratet (se trin 3.1.1). Tæl cellerne efter farvning med trypanblå og et farvningskammer.
- Når cellerne når et sammenløb på ca. 80% (6-12 dages dyrkning), vaskes pladerne forsigtigt 2x med 3 ml DPBS og inkuberes med 2 ml 0,05% trypsin / EDTA (forvarmet til 37 ° C) i 3 minutter. Når cellerne løsner sig fra pladebunden, inaktiveres fordøjelsen ved tilsætning af 2 ml DMEM med 10% FCS og 50 μg/ml gentamycin.
2. DRG explant kultur
- DRG vækstmedium forberedelse
- Forbered DRG-vækstmedium ved at tilføje 2% B27, 2% hesteserum, 1% L-glutamin, 0,5% penicillin / streptomycin og 10 ng / ml nervevækstfaktor (NGF) til neurobasalmediet. Opbevar vækstmediet ved 4 °C.
BEMÆRK: Vækstmediet kan bruges i 2 dage.
- Forbered DRG-vækstmedium ved at tilføje 2% B27, 2% hesteserum, 1% L-glutamin, 0,5% penicillin / streptomycin og 10 ng / ml nervevækstfaktor (NGF) til neurobasalmediet. Opbevar vækstmediet ved 4 °C.
- Belægning til DRG-eksplanter
- Inkuber dækslerne i 70% ethanol i 1 time og læg dem i brøndene med 4-brøndskåle ved hjælp af buede tang. Når ethanolen er tørret, påføres 300 μL 0,2 mg/ml poly-D-lysin (PDL) pr. brønd og inkuberes natten over ved 37 °C og 5% CO2.
- Vask dækslerne 3x i 5 minutter hver med DPBS fortløbende. DPBS tages af, påføres 300 μL 1 μg/ml laminin på dæksedlerne, og der inkuberes natten over ved 37 °C og 5 % CO2.
- Efter tre vasketrin med DPBS i 5 minutter udskiftes DPBS med 190 μL DRG-vækstmedium. 4-brøndspladerne anbringes i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2.
- DRG forberedelse
BEMÆRK: Høst DRG af embryonale rotter under en ren bænk.- Før tilberedning skal du rengøre alle instrumenter med 70% ethanol. Fyld 10 (to pr. embryo) 35 mm TC-skåle med 2 ml iskold HBSS pr. skål og to 100 mm TC-skåle med 5 ml iskold HBSS pr. skål.
- Aflive de drægtige rotter (voksne hunrotter fra Sprague Dawley, E13.5) ved CO2 indånding og halshugning.
- Sprøjt kroppen med 70% ethanol og åbn rottens ventrale torso. Fjern forsigtigt livmoderen og læg den i en 100 mm TC-skål med iskold HBSS.
- Hold livmoderen ved hjælp af buede tang og åbn livmodervæggen med fine tang. Fjern en fostervand og åbn den forsigtigt ved at klemme et hul med fine tang.
- Fjern embryoet fra det omgivende væv, skær navlestrengen og halshug embryoet ved hjælp af fine tang. Placer torsoen i en 100 mm TC-skål fyldt med HBSS ved hjælp af buet tang og en spatel.
- Fjern hurtigt alle embryoner fra livmoderen og overfør dem til en 100 mm TC-skål fyldt med HBSS. Hvis der er mere end fem embryoner, fremstilles en yderligere 35 mm TC-skål med 2 ml HBSS i henhold til trin 2.3.1.
- Anbring forsigtigt en embryotorso i en 35 mm TC-skål fyldt med HBSS ved hjælp af en spatel og buet tang. Under et stereomikroskop skal du åbne den dorsale del af torsoen for at opdele embryoet i to halvdele ved hjælp af fine tang og mikrosaks. Drej den ene halvdel til siden og identificer DRG-strengen placeret i en linje ved den dorsale del af embryoet.
- Klip DRG ud som en hel streng ved hjælp af fine tang og mikrosaks. Anbring DRG i en frisk 35 mm TC-skål fyldt med 2 ml HBSS, og adskil en enkelt DRG fra det resterende væv ved hjælp af fin pincet og mikrosaks.
- DRG-cellekultur
- Udtag 4-brøndsplader indeholdende 190 μL DRG-vækstmedium fra inkubatoren til den rene bænk, hvor DRG skal fremstilles. Overfør forsigtigt en enkelt DRG til en brønd i en 4-brønds kulturplade ved hjælp af fine pincet og en spatel. Placer DRG i midten af hver brønd, da en central position er vigtig for fastgørelsen af DRG.
- Arbejd under sterile forhold fra nu af. Explant-kulturerne anbringes i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2. Den næste dag tilsættes 50 μL DRG-vækstmediet forsigtigt til hvert hul ved hjælp af en 100 ml pipette.
- Overhold DRG-udplantningsvedhæftning og axonudvækst ved hjælp af et mikroskop dagligt, og kassér DRG-eksplanter, der har løsnet sig fra dæksedlen eller undladt at vokse axoner på dag 3 i kulturen.
BEMÆRK: DRG-eksplanter er meget skrøbelige i de første dage af kulturen og skal håndteres med forsigtighed, især når pladerne flyttes ind og ud af inkubatoren, når mediet skiftes, eller endda når inkubatordøren lukkes. Det nøjagtige volumen på 190 μL medium pr. brønd er afgørende for at holde DRG-eksplanterne på plads i løbet af den første kulturdag. Løse DRG-eksplanter kan let identificeres under den daglige kontrol, da de svømmer i mediet i stedet for at klæbe til dæksedlen.
3. Samkultur
- Overførsel af Schwann-celler til DRG-eksplantatkulturen
- Forbered cokulturmediet ved at tilsætte 0,1% ascorbinsyre til DRG-vækstmediet.
- På dag 3 i DRG-eksplantatkulturen udskiftes forsigtigt DRG-vækstmediet med 250 μL af cokulturmediet indeholdende 30.000 Schwann-celler (fra trin 1.8) pr. Brønd.
- Opbevar samkulturen mellem DRG-eksplanter og Schwann-celler i op til 22 dage. Udskift 250 μL af samkulturmediet omhyggeligt hver anden dag, og observer cellernes udseende ved hjælp af et mikroskop.
BEMÆRK: For et eksempel på DRG-axoner og Schwann-celler i samkulturen i de første dage af kulturen, se figur 1.
- Immunocytokemisk farvning
BEMÆRK: Håndter samkulturprøverne ekstremt forsigtigt under farvningsproceduren, da de let kan beskadiges.- For at fastgøre cellerne på dæksedlerne skal du fjerne mediet langsomt, vaske 3x med DPBS omhyggeligt og inkubere i 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter. Udskift PFA med DPBS, og opbevar de faste celler ved 4 °C i op til 1 uge.
FORSIGTIG: Ved håndtering af 4% PFA skal du bære de anbefalede personlige værnemidler. - Vask dækslerne 3x med DPBS i 5 minutter, og bloker derefter med blokeringsopløsning (10% gedeskerum, 10% bovint serumalbumin [BSA], 0,1% gelatine og 0,05% Triton X-100) i DPBS i 1 time. De primære antistoffer βIII-tubulin (1:7.500) og myelinbasisk protein (MBP) (1:750) fortyndes i den blokerende opløsning og inkuberes natten over ved 4 °C.
- Vask cellerne 3x med DPBS i 5 min. Der anvendes fluorescerende farvestofkonjugerede sekundære antistoffer i en fortynding på 1:1.000 i blokerende opløsning, og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur (RT).
- Vask cellerne 3x med DPBS i 5 min, og monter cellerne på mikroskopiske dias med fluorescensmonteringsmedium, inklusive 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Opbevar diasene i mørke ved 4 °C indtil mikroskopisk dokumentation.
FORSIGTIG: Brug det anbefalede personlige beskyttelsesudstyr ved håndtering af fluorescensmonteringsmediet.
- For at fastgøre cellerne på dæksedlerne skal du fjerne mediet langsomt, vaske 3x med DPBS omhyggeligt og inkubere i 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter. Udskift PFA med DPBS, og opbevar de faste celler ved 4 °C i op til 1 uge.
- Analyse
- Tag billeder af otte definerede regioner omkring DRG-eksplantatet i midten ved hjælp af et omvendt mikroskop.
- Brug et billedanalyseprogram til at kvantificere områderne af βIII-tubulinpositive axoner og myelinering farvet af MBP.
- Beregn procentdelen af myelinering som et forhold mellem de myelinerede axoner og ikke-myelinerede axoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myelinering i samkulturen blev vurderet på dag 10, 12, 14, 16, 18 og 20. DRG-eksplanterne og Schwann-cellerne blev farvet for MBP, βIII-tubulin og DAPI. Det aksonale netværk i samkulturen var tæt og ændrede sig ikke synligt i observationsforløbet. De første tegn på myelin, i form af små fragmenter, kunne påvises på dag 10 og steg på dag 12 (figur 2). De MBP-positive områder steg over tid indtil dag 20 af kulturen. Myeliniseringen blev kvantificeret som forholdet mellem MBP- og βIII-tubulin-positive områder. Myelinering steg signifikant på dag 18 og 20 sammenlignet med dag 10 (figur 3; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001).
Figur 1: Udseende af Schwann-celler og axoner i samkulturen. Eksemplarisk billede af samkulturen på dag 3. Sorte pile viser tynde DRG-axoner, og den hvide pil peger på en Schwann-celle med en langstrakt og spindelformet morfologi fastgjort til en axon. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Myelinering i en samkultur af DRG-eksplanter og Schwann-celler. Farvning for neuronmarkøren βIII-tubulin og MBP blev udført på dag 10, 12, 14, 16, 18 og 20 efter at have sluttet sig til begge kulturer for at undersøge udviklingen af myelinering i cokulturen. De første tegn på myelinering var synlige på dag 10 og 12 af samkultur. Fra dag 14 var MBP-signalet mere udtalt, og myelinindpakkede axoner blev detekteret. Myeliniseringen steg med tidspunktet for samkultur indtil dag 20. Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvantificering af myelinisering. På dag 10, 12, 14, 16, 18 og 20 af samkultur blev myelinering vurderet ved farvning af axoner med βIII-tubulin og myelin med MBP. Procentdelen af myelinerede axoner blev bestemt ved beregning af forholdet mellem de MBP-positive og βIII-tubulinfarvede områder. Der blev påvist signifikante forskelle på dag 18 og 20 i forhold til dag 10 i samkultur. Data udtrykkes som gennemsnit ± SEM; n = 3. Envejs ANOVA med Kruskal-Wallis og Dunns multiple sammenligning post-hoc test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Stadier af Schwann-cellekultur. Eksemplariske brightfield-billeder af dyrkede Schwann-celler (A) før og (B) efter magnetisk celleseparation. Før magnetisk celleseparation indbefatter kulturen Schwann-celler med en langstrakt og spindelformet morfologi, flade og spredte fibroblaster og rester af bindevæv. For at opnå en renere kultur af Schwann-celler udføres magnetisk celleseparation. Skalabjælker: 200 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Myelinering af DRG-eksplanter med og uden yderligere Schwann-celler. Det MBP-farvede område blev brugt til at måle myelinering i samkulturen på dag 14. Myeliniseringen af DRG-eksplanter blev signifikant øget, hvis Schwann-celler blev tilsat til kulturen (uparret t-test, **p ≤ 0,01). n = 3. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Genekspressionsanalyse i samkulturen. Relative genekspressionsniveauer af MBP, PMP22, MAG, Oct6, Egr2 og Olig1 blev analyseret i cokulturprøver på dag 22 af qPCR (A). MBP og PMP22 var målene med de højeste genekspressionsniveauer i samkulturen. Et eksemplarisk billede af qPCR-amplifikationsprodukter anvendt på en agarosegel demonstrerer den kvalitative overflod af målene (B). De første og sidste baner på gelen repræsenterer en DNA-stige (100 basepar). n = 5. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en hurtig og let protokol til generering af in vitro-myelinering ved at fusionere to separate celletypekulturer, Schwann-celler og dorsalrodganglion-eksplanter.
Et kritisk trin i protokollen er dyrkning af DRG-eksplanter, især i de første dage af kulturen. DRG er meget skrøbelige, før et stærkt aksonalt netværk er bygget og skal håndteres meget omhyggeligt, for eksempel når de tages ud af inkubatoren eller under skift af medium. DRG, der løsner sig fra bunden af brønden og findes svømmende i mediet, viser mislykket dyrkning. For Schwann-celler kan skiftende spredningshastigheder på grund af forskellige dyrkningsbetingelser og kosttilskud (f.eks. Serum i mediet) udgøre en udfordring for samkulturen. Hvis kulturen er overgroet af et for stort antal Schwann-celler, løsnes den fra bunden af brønden og bliver ubrugelig. En titrering af Schwann-cellenummeret i kulturen anbefales derfor. Under etableringen af Schwann-celleprotokollen skal renhedstest udføres under anvendelse af SOX10- eller S100-immunfarvning. Generelt skal håndtering af kulturen, herunder skift af medie samt vaske- og fikseringstrin, udføres omhyggeligt for at sikre et vellykket resultat. Det er vigtigt at vælge observationstidspunktet i henhold til forskningsinteressen; Dag 14 repræsenterer udgangspunktet for de første tætte myelinerede axoner og kan derfor vælges som observationstidspunkt for initiering af myelinisering, mens senere tidspunkter tilbyder mere komplette myelinskeder.
Da denne in vitro-myeliniseringsmetode kun omfatter DRG- og Schwann-celler, ligner den ikke nøjagtigt myelineringsprocessen i organismen. Andre medvirkende faktorer, såsom omgivende væv, mikromiljøet, immunceller og signalering fra fjerne strukturer, er ikke repræsenteret i denne model. Denne metode giver imidlertid en passende model til undersøgelse af myelinering af PNS ved separat analyse og manipulation af begge celletyper 9,15,16. Schwann-celler eller DRG til samkulturen kan høstes fra syge eller behandlede dyr for at dechiffrere bidraget fra den specifikke celletype17,18. Når du bruger de sene stadier af denne opsætning, anbefales det stærkt at inkludere en kontrolbetingelse uden yderligere at tilføje Schwann-celler for at udelukke de mulige virkninger af DRG-afledte Schwann-celler. Det er vores erfaring, at myelinering i DRG-eksplanter uden Schwann-celler påvises i signifikant mindre grad end i samkulturen (supplerende figur 2).
Brugen af DRG-eksplanter giver fordelen ved intakt strukturel arkitektur sammenlignet med dissocierede neuronale kulturer. Immunofluorescerende farvning af myelinbasisk protein (MBP) muliggør kvantificering af det myelinerede axonområde og giver en tilstrækkelig aflæsning for myelinering i samkulturen. Genekspressionsanalyse af cokulturprøver på dag 22 afslørede tilstedeværelsen af MBP, perifert myelinprotein (PMP22), myelinassocieret glycoprotein (MAG), octamerbindende faktor 6 (okt6), ETS-relateret gen 2 (Erg2) og oligodendrocyttranskriptionsfaktor 1 (Olig1) med de højeste ekspressionsniveauer for MBP og PMP22 (supplerende figur 3). Derfor giver den beskrevne protokol en metode med flere målmuligheder for myelineringsmarkører i samkulturen.
Potentielle anvendelser af denne metode omfatter grundlæggende forskningsmetoder til myelineringsprocessen i periferien samt validering af terapeutiske forbindelser til sygdomme i PNS, herunder skade på myelin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke at have nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Prof. Dr. Ralf Gold og PD Dr. Gisa Ellrichmann for deres råd og støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
- Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).
- Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
- Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
- Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
- Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
- Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
- Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781 (2016).
- Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).
- Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).
- Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
- Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).
- Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
- Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).
