Summary
I kokultursystemet av dorsale rotganglier og Schwann-celler kan myelinisering av det perifere nervesystemet studeres. Denne modellen gir eksperimentelle muligheter til å observere og kvantifisere perifer myelinisering og å studere effekten av forbindelser av interesse på myelinskjeden.
Abstract
Myeliniseringsprosessen er avgjørende for å muliggjøre rask og tilstrekkelig signaltransduksjon i nervesystemet. I det perifere nervesystemet engasjerer nevroner og Schwann-celler seg i en kompleks interaksjon for å kontrollere myeliniseringen av axoner. Forstyrrelser av denne interaksjonen og nedbrytningen av myelinskjeden er kjennetegn ved inflammatoriske nevropatier og forekommer sekundært i nevrodegenerative lidelser. Her presenterer vi en kokulturmodell av dorsale rotganglioneksplanter og Schwann-celler, som utvikler en robust myelinisering av perifere aksoner for å undersøke myeliniseringsprosessen i det perifere nervesystemet, studere akson-Schwann-celleinteraksjoner og evaluere potensielle effekter av terapeutiske midler på hver celletype separat. Metodologisk ble dorsale rotganglioner av embryonale rotter (E13.5) høstet, dissosiert fra deres omkringliggende vev og dyrket som hele eksplanter i 3 dager. Schwann-celler ble isolert fra 3 uker gamle voksne rotter, og isjiasnervene ble enzymatisk fordøyd. De resulterende Schwann-cellene ble renset ved magnetisk aktivert cellesortering og dyrket under neuregulin og forskolinberikede forhold. Etter 3 dager med dorsalrotganglion-eksplantkultur ble 30 000 Schwann-celler tilsatt til en dorsalrotganglion-eksplant i et medium inneholdende askorbinsyre. De første tegn til myelinisering ble påvist dag 10 i kokultur, gjennom spredte signaler for myelinbasisk protein i immuncytokjemisk farging. Fra dag 14 og fremover ble myelinskjede dannet og forplantet langs aksonene. Myelinisering kan kvantifiseres ved myelinbasisk proteinfarging som et forhold mellom myeliniseringsområdet og aksonområdet, for å ta hensyn til forskjellene i aksonal tetthet. Denne modellen gir eksperimentelle muligheter til å studere ulike aspekter ved perifer myelinisering in vitro, noe som er avgjørende for å forstå patologien til og mulige behandlingsmuligheter for demyelinisering og nevrodegenerasjon ved inflammatoriske og nevrodegenerative sykdommer i det perifere nervesystemet.
Introduction
I det perifere nervesystemet (PNS) medieres rask informasjonstransduksjon av myelininnpakkede aksoner. Myeliniseringen av aksoner er avgjørende for å muliggjøre rask forplantning av elektriske impulser, siden ledningshastigheten til nervefibrene korrelerer med aksondiameteren og myelintykkelsen1. Sensorisk signalering fra periferien til sentralnervesystemet (CNS) er avhengig av aktivering av førsteordens sensoriske nevroner som ligger i utvidelser av dorsalroten, kalt dorsalrotganglier (DRG). For dannelse og vedlikehold av myelin, er kontinuerlig kommunikasjon mellom aksoner og Schwann-celler, som er de myeliniserende Glia-cellene i PNS, obligatorisk2.
Mange sykdommer i PNS forstyrrer transduksjonen av informasjon ved enten primær aksonal eller demyeliniserende skade, noe som resulterer i hypestesi eller dysestesi. Førsteordens sensoriske nevroner har evnen til å regenerere i en grad etter nevronskader, ved et komplekst samspill mellom nevronet og omkringliggende Schwann-celler3. I dette tilfellet kan Schwann-celler gjennomgå cellulær omprogrammering for å fjerne aksonalt så vel som myelinrester og fremme aksonal regenerering, noe som resulterer i remyelinisering4. Å forstå mekanismene for myelinisering i helse og sykdom er viktig for å finne mulige behandlingsalternativer for demyeliniserende lidelser i PNS. Myelin kan også bli skadet av akutt nevrotrauma, og tilnærminger for å fremme myelinisering for å fremme funksjonell gjenoppretting etter perifer nerveskade er under utredning5.
Vår kunnskap om perifer myelinisering har i stor grad dratt nytte av myeliniserende kokulturer av Schwann-celler og sensoriske nevroner. Siden de første tilnærmingene ble brukt 6,7,8, har myelinisering blitt studert intenst med bruk av forskjellige kokultursystemer9,10,11. Her gir vi en rask og enkel protokoll for robust in vitro myelinisering av dorsale ganglionaksoner. Protokollen for Schwann-cellepreparering er basert på protokollen til Andersen et al.12, tidligere publisert i Pitarokoili et al.13. Vi bruker Schwann-celler avledet fra unge rotter og embryonale DRG-eksplantkulturer for kokulturen, der myelinisering skjer rundt dag 14. Målet med metoden er å gi et system for å undersøke dannelsen av myelin som et resultat av direkte akson-Schwann-celleinteraksjon, og å studere modulatorer av PNS myelinisering. I forhold til dissosierte nevroncellekulturer er DRG-eksplanter mer anatomisk bevart og danner lange aksonale prosesser. Kvantifisering av det myeliniserte aksonarealet gir en tilstrekkelig avlesning for myelinisering i kokulturen. Metoden er et verdifullt verktøy for å screene terapeutiske forbindelser for deres potensielle effekt på PNS-myelinisering, og kan også brukes i tillegg til in vivo-studier i dyremodeller14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med De europeiske fellesskaps rådsdirektiv for stell og bruk av forsøksdyr.
1. Schwann cellekultur
- Belegg for Schwann cellekultur
- Belegg cellekulturfatene under sterile forhold. Påfør 2 ml 0,01 % poly-L-lysin (PLL) på to 60 mm vevskulturretter (TC) hver og rug over natten ved 4 °C.
- Fjern PLL, vask TC-oppvasken 2x med destillert vann og inkuber med 2 ml 1 μg/cm2 laminin over natten ved 4 °C. Vask TC-oppvasken 2x med aqua dest, og la platene lufttørke.
- Middels forberedelse for Schwann-cellekultur
- Forbered 50 ml Schwann-cellemedium ved å tilsette 10% varmeinaktivert føtalkalveserum (FCS), 2 μM forskolin, 10 nM neuregulin og 50 μg / ml gentamycin til Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) / F-12 (høy glukose) under sterile forhold.
- Tilbered 70 ml Leibovitz' L-15 medium med 50 μg/ml gentamycin under sterile forhold.
- Isjiasnervepreparasjon
MERK: Alle trinn for isjiasnerveforberedelse utføres under en ren benk.- Forbered en 100 mm TC-tallerken med 5 ml iskald Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) uten Ca 2+ og Mg2+, en 100 mm TC-tallerken med 5 ml iskald Leibovitz' L-15 medium, og en 100 mm TC-tallerken med 5 ml iskald Leibovitz' L-15 medium og 50 μg/ml gentamycin.
- Rengjør alle instrumentene med autoklavering. Spray instrumentene og arbeidsområdet med 70% etanol.
- Avlive fem 3 uker gamle mannlige Sprague Dawley-rotter ved hjelp av CO2 -innånding og halshugging. Spray rottens torso med 70% etanol.
- Åpne den dorsale nedre venstre lemmen med saks og fjern biceps femoris muskelen forsiktig. Løsne isjiasnerven ved jevn høyde med buede tang, og sørg for ikke å blåse nerven.
- Hold den mest proksimale delen av nerven med de buede tangene for å rette nerven, og klipp nerven så høyt som mulig ved hjelp av saks. Deretter klipper du nerven nær sakral plexus og poten med saks. Gjenta trinn 1.3.4-1.3.5 for høyre side.
MERK: Mens du åpner lemmen, pass på at du ikke blåser noen blodårer. - Bruk tang, legg venstre og høyre isjiasnerve i en 100 mm TC-tallerken med iskald DPBS.
- Oppussing av isjiasnerven
- Bruk tang til å overføre alle nervene til en 100 mm TC-tallerken med iskald Leibovitz L-15 medium og 50 μg/ml gentamycin. Fortsett å bruke et stereomikroskop og fjern fett, muskler og blodkar fra nervene med to par fine tang. Ta tak i nervene med tang og overfør dem til en 100 mm TC-tallerken med iskaldt Leibovitz' L-15-medium.
- Identifiser de proksimale og distale endene av isjiasnerven. Fjern epineurium med ett par fine tang i proksimal til distal retning, mens du holder den proksimale nerveenden med det andre paret fine tang.
- Overfør de rensede nervene til en 100 mm TC-tallerken med iskald Leibovitz' L-15 medium og 50 μg/ml gentamycin. Erte de isolerte nervefasciklene for å skille og isolere enkle nervefibre ved hjelp av to par fine tang.
- Overfør nervefibrene til et 50 ml rør ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette og ta opp så lite medium som mulig. Tilsett 50 ml Leibovitz' L-15 medium med 50 μg/ml gentamycin til nervefibrene og drep noen ganger i 50 ml røret.
- Enzymatisk fordøyelse av nervesystemet
MERK: De neste trinnene (trinn 1.5–1.8, 2.1 og 2.2) utføres under sterile forhold.- Klargjør den enzymatiske fordøyelsesoppløsningen som inneholder 0,25 % dispase II, 0,05 % type I kollagenase og 50 μg/ml gentamycin i 10 ml DMEM (høy glukose).
- Sentrifuger røret ved 188 x g i 5 minutter ved 4 °C, fjern supernatanten med en 25 ml serologisk pipette, og overfør pelleten med det gjenværende Leibovitz' L-15-medium til en 60 mm TC-tallerken ved hjelp av en 1000 ml pipette.
- Skyll 50 ml røret med 10 ml av den enzymatiske fordøyelsesløsningen og legg den til fatet som inneholder nervefibrene. Fordel vevet i fatet forsiktig med spissen av en pipette for å maksimere den tilgjengelige overflaten for fordøyelsen.
- Inkuber ved 37 °C og 5 % CO 2 i 18 timer, og stopp fordøyelsen ved å tilsette 10 ml 40 % FCS i Hanks balanserte saltløsning, uten Ca2 og Mg2+ (HBSS).
- Celle separasjon
- Overfør de fordøyde nervene til et 50 ml rør ved hjelp av en serologisk pipette og sentrifuge ved 188 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml DMEM inneholdende 10 % FCS og 50 mikrogram/ml gentamycin. Deretter resuspenderes pelleten 20 ganger ved hjelp av en pipettespiss på 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml og 200 μl.
- Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 100 μm cellesil og sentrifuge ved 188 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspender pelleten med 4 ml DMEM inneholdende 10 % FCS og 50 mikrogram/ml gentamycin.
- Tilsett 2 ml cellesuspensjon i hver av de to PLL- og lamininbelagte 60 mm TC-fatene, og rug ved 37 °C og 5 % CO2. La platene være uberørt i 2 dager i inkubatoren for å beskytte cellene mot mekanisk stress og for å støtte adherens.
- Schwann-celledifferensiering
- Etter 2 dager, fjern mediet og skyll platene forsiktig 2x med DMEM (høy glukose), 10% FCS og 50 μg / ml gentamycin. Etterpå legger du til 2 ml Schwann-cellemedium. Bytt ut Schwann-cellemediet hver 2. dag, og observer celleutseendet og sammenløpet ved hjelp av et mikroskop.
MERK: Schwann-celler og DRG-eksplanter må utarbeides på en rettidig og koordinert måte for kokulturen. Sørg for at en rotte med embryoer ved E 13,5 er tilgjengelig for DRG-forberedelse når Schwann-cellene er nær en konfluens på 80%.
- Etter 2 dager, fjern mediet og skyll platene forsiktig 2x med DMEM (høy glukose), 10% FCS og 50 μg / ml gentamycin. Etterpå legger du til 2 ml Schwann-cellemedium. Bytt ut Schwann-cellemediet hver 2. dag, og observer celleutseendet og sammenløpet ved hjelp av et mikroskop.
- Celletrypsinisering og magnetisk separasjon
MERK: For eksemplariske bilder av forskjellige Schwann-cellekulturstadier, se tilleggsfigur 1.- Når cellene når en konfluens på ca. 80% (6-12 dager med kultur), vask platene forsiktig 2x med 3 ml DPBS og inkuber med 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA (forvarmet til 37 ° C) i 3 minutter. Når cellene løsner fra platebunnen, inaktiverer fordøyelsen ved tilsetning av 2 ml DMEM med 10% FCS og 50 μg / ml gentamycin.
MERK: Hold deg til en trypsiniseringstid på strengt 3 min, og fortsett raskt etterpå. - Resuspender cellepelleten i 2 ml magnetisk celleseparasjonsbuffer inneholdende DPBS med 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) og 2 nM EDTA. Kombiner 10 μL av cellesuspensjonen med 10 μL trypanblått og tell cellene ved hjelp av et fargekammer.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 188 x g i 10 minutter ved 4 °C og resuspender cellepelleten i 90 μL magnetisk celleseparasjonsbuffer per 1 x 107 celler. Tilsett 10 μL Thy-1 mikroperler per 1 x 107 celler. Resuspender oppløsningen noen ganger og rug i 15 minutter i mørket ved 8 °C.
- Tilsett 2 ml av magnetcelleseparasjonsbufferen til cellesuspensjonen og sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 500 mikrol magnetisk celleseparasjonsbuffer.
- Fukt den magnetiske celleseparasjonskolonnen med 1 ml av den magnetiske celleseparasjonsbufferen. Plasser kolonnen for magnetisk celleseparasjon i magnetcelleseparatoren. Påfør cellene på kolonnen for magnetisk celleseparasjon. Samle gjennomstrømningen og sentrifuger ved 300 x g ved 4 °C i 10 minutter.
MERK: Fibroblaster er positivt valgt og forblir i kolonnen, mens Schwann-celler passerer kolonnen. Fibroblaster kan samles med et stempel (f.eks. som en negativ kontroll for Schwann-cellefargingsprotokoller). - Kast supernatanten og sett pelleten godt i 1 ml av kokulturmediet (se trinn 3.1.1). Tell cellene etter farging med trypanblå og et fargekammer.
- Når cellene når en konfluens på ca. 80% (6-12 dager med kultur), vask platene forsiktig 2x med 3 ml DPBS og inkuber med 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA (forvarmet til 37 ° C) i 3 minutter. Når cellene løsner fra platebunnen, inaktiverer fordøyelsen ved tilsetning av 2 ml DMEM med 10% FCS og 50 μg / ml gentamycin.
2. DRG explant kultur
- DRG vekst medium forberedelse
- Forbered DRG-vekstmedium ved å tilsette 2% B27, 2% hesteserum, 1% L-glutamin, 0,5% penicillin / streptomycin og 10 ng / ml nervevekstfaktor (NGF) til nevrobasalmediet. Oppbevar vekstmediet ved 4 °C.
MERK: Vekstmediet kan brukes i 2 dager.
- Forbered DRG-vekstmedium ved å tilsette 2% B27, 2% hesteserum, 1% L-glutamin, 0,5% penicillin / streptomycin og 10 ng / ml nervevekstfaktor (NGF) til nevrobasalmediet. Oppbevar vekstmediet ved 4 °C.
- Belegg for DRG-eksplanter
- Inkuber dekslene i 70% etanol i 1 time og sett i brønnene til 4-brønns retter ved hjelp av buede tang. Etter at etanolen har tørket, påfør 300 μL 0,2 mg / ml poly-D-lysin (PDL) per brønn og inkuber over natten ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vask dekslene 3x i 5 min hver med DPBS etter hverandre. Ta av DPBS, påfør 300 μL 1 μg/ml laminin på dekslene og inkuber over natten ved 37 °C og 5 % CO2.
- Etter tre vasketrinn med DPBS i 5 minutter, erstatt DPBS med 190 μL DRG-vekstmedium. Plasser 4-brønnsplatene i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2.
- DRG-forberedelse
MERK: Høst DRG av embryonale rotter under en ren benk.- Før klargjøring, rengjør alle instrumentene med 70% etanol. Fyll 10 (to per embryo) 35 mm TC-fat med 2 ml iskald HBSS per tallerken, og to 100 mm TC-fat med 5 ml iskald HBSS per rett.
- Avlive de drektige rottene (voksne hunnrotter av typen Sprague Dawley, E13.5) ved innånding og halshogging av CO2 .
- Spray kroppen med 70% etanol og åpne rottens ventrale torso. Fjern forsiktig livmoren og legg den i en 100 mm TC-tallerken med iskald HBSS.
- Hold livmoren med buede tang og åpne livmorveggen med fine tang. Fjern en fostersekk og åpne den forsiktig ved å klemme et hull med fine tang.
- Fjern embryoet fra det omkringliggende vevet, kutt navlestrengen og halshugg embryoet med fine tang. Plasser overkroppen i en 100 mm TC-tallerken fylt med HBSS ved hjelp av buet tang og en slikkepott.
- Fjern raskt alle embryoer fra livmoren og overfør dem til en 100 mm TC-tallerken fylt med HBSS. Hvis det er mer enn fem embryoer, tilbered en ekstra 35 mm TC-tallerken med 2 ml HBSS, i henhold til trinn 2.3.1.
- Legg forsiktig en embryotorso i en 35 mm TC-tallerken fylt med HBSS ved hjelp av en slikkepott og buede tang. Under et stereomikroskop, åpne den dorsale delen av torso for å dele embryoet i to halvdeler ved hjelp av fine tang og mikrosaks. Vri den ene halvdelen til siden og identifiser DRG-strengen som ligger i en linje ved den dorsale delen av embryoet.
- Klipp ut DRG som en hel tråd ved hjelp av fin tang og mikrosaks. Legg DRG i en frisk 35 mm TC-tallerken fylt med 2 ml HBSS, og skill en enkelt DRG fra det gjenværende vevet ved hjelp av fin tang og mikrosaks.
- DRG-cellekultur
- Ta 4-brønnsplater som inneholder 190 μL DRG-vekstmedium fra inkubatoren til den rene benken der DRG skal tilberedes. Overfør en enkelt DRG forsiktig til en brønn på en 4-brønns kulturplate ved hjelp av fin tang og en slikkepott. Plasser DRG i midten av hver brønn, siden en sentral posisjon er viktig for vedlegget av DRG.
- Arbeid under sterile forhold fra nå av. Plasser eksplantekulturene i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2. Neste dag tilsettes 50 μL av DRG-vekstmediet forsiktig til hver brønn ved hjelp av en 100 ml pipette.
- Observer DRG-eksplantadherens og aksonutvekst ved hjelp av et mikroskop daglig, og kast DRG-eksplanter som har løsnet fra dekkslippet eller ikke klart å vokse ut aksoner på dag 3 av kulturen.
MERK: DRG-eksplanter er svært skjøre i de første dagene av kulturen og må håndteres med forsiktighet, spesielt når du flytter platene inn og ut av inkubatoren når mediet endres, eller til og med når du lukker inkubatordøren. Det nøyaktige volumet på 190 μL medium per brønn er avgjørende for å holde DRG-eksplantene på plass i løpet av den første kulturdagen. Løse DRG-eksplanter kan lett identifiseres under den daglige kontrollen, da de svømmer i mediet i stedet for å feste seg til dekselet.
3. Kokultur
- Overføring av Schwann-celler til DRG-eksplantkulturen
- Forbered kokulturmediet ved å tilsette 0,1% askorbinsyre til DRG-vekstmediet.
- På dag 3 av DRG-eksplantekulturen, erstatt forsiktig DRG-vekstmediet med 250 μL av kokulturmediet som inneholder 30 000 Schwann-celler (fra trinn 1,8) per brønn.
- Hold kokulturen til DRG-eksplanter og Schwann-celler i opptil 22 dager. Bytt 250 μL av kokulturmediet nøye annenhver dag, og observer utseendet til cellene ved hjelp av et mikroskop.
MERK: For et eksempel på DRG-aksoner og Schwann-celler i kokulturen i de første kulturdagene, se figur 1.
- Immuncytokjemisk farging
NOTAT: Håndter kokulturprøvene ekstremt nøye under fargeprosedyren, siden de lett kan bli skadet.- For å fikse cellene på dekslene, fjern mediet sakte, vask 3x med DPBS forsiktig og inkuber i 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter. Bytt ut PFA med DPBS, og oppbevar de faste cellene ved 4 °C i opptil 1 uke.
FORSIKTIG: Ved håndtering av 4% PFA, bruk anbefalt personlig verneutstyr. - Vask dekslene 3x med DPBS i 5 minutter, og blokker deretter med blokkeringsløsning (10% geiteserum, 10% bovint serumalbumin [BSA], 0,1% gelatin og 0,05% Triton X-100) i DPBS i 1 time. Fortynn de primære antistoffene βIII-tubulin (1:7 500) og myelinbasisk protein (MBP) (1:750) i blokkeringsoppløsningen, og inkuber over natten ved 4 °C.
- Vask cellene 3x med DPBS i 5 minutter. Bruk fluorescerende fargestoff-konjugerte sekundære antistoffer i en fortynning på 1:1,000 i blokkeringsløsning, og inkuber i 2 timer ved romtemperatur (RT).
- Vask cellene 3x med DPBS i 5 minutter, og monter cellene på mikroskopiske lysbilder med fluorescensmonteringsmedium, inkludert 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Oppbevar lysbildene i mørket ved 4 °C til mikroskopisk dokumentasjon.
FORSIKTIG: Ved håndtering av fluorescensmonteringsmedium, bruk anbefalt personlig verneutstyr.
- For å fikse cellene på dekslene, fjern mediet sakte, vask 3x med DPBS forsiktig og inkuber i 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter. Bytt ut PFA med DPBS, og oppbevar de faste cellene ved 4 °C i opptil 1 uke.
- Analyse
- Ta bilder av åtte definerte regioner rundt DRG-anlegget i midten ved hjelp av et omvendt mikroskop.
- Bruk et bildeanalyseprogram for å kvantifisere områdene av βIII-tubulinpositive aksoner og myelinisering farget av MBP.
- Beregn prosentandelen myelinisering som et forhold mellom de myeliniserte aksonene og ikke-myeliniserte aksoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myelinisering i kokulturen ble vurdert på dagene 10, 12, 14, 16, 18 og 20. DRG-eksplantene og Schwann-cellene ble farget for MBP, βIII-tubulin og DAPI. Det aksonale nettverket i kokulturen var tett og endret seg ikke synlig i løpet av observasjonen. De første tegnene på myelin, i form av små fragmenter, kunne påvises dag 10 og økte dag 12 (figur 2). De MBP-positive områdene økte over tid frem til dag 20 i kulturen. Myeliniseringen ble kvantifisert som et forhold mellom de positive områdene MBP og βIII-tubulin. Myeliniseringen økte signifikant på dag 18 og 20 sammenlignet med dag 10 (figur 3; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001).
Figur 1: Utseende av Schwann-celler og aksoner i kokulturen. Forbilledlig bilde av kokulturen på dag 3. Svarte piler viser tynne DRG-aksoner, og den hvite pilen peker på en Schwann-celle med en langstrakt og spindelformet morfologi festet til et akson. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Myelinisering i en kokultur av DRG-eksplanter og Schwann-celler. Farging for nevronmarkøren βIII-tubulin og MBP ble utført dag 10, 12, 14, 16, 18 og 20, etter å ha slått sammen begge kulturer for å undersøke utviklingen av myelinisering i kokulturen. De første tegnene på myelinisering var synlige på dag 10 og 12 i kokultur. Fra dag 14 var MBP-signalet mer uttalt, og myelininnpakkede aksoner ble detektert. Myelineringen økte med tiden for kokultur frem til dag 20. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Kvantifisering av myelinisering. Dag 10, 12, 14, 16, 18 og 20 i kokultur ble myelinisering vurdert ved å farge aksoner med βIII-tubulin og myelin med MBP. Prosentandelen myeliniserte aksoner ble bestemt ved beregning av forholdet mellom MBP-positive og βIII-tubulinfargede områder. Signifikante forskjeller ble påvist på dag 18 og 20 sammenlignet med dag 10 i kokultur. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM; n = 3. Enveis ANOVA med Kruskal-Wallis og Dunns multippel sammenligning etter hoc-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Stadier av Schwann-cellekultur. Eksempler på lysfeltbilder av dyrkede Schwann-celler (A) før og (B) etter magnetisk celleseparasjon. Før magnetisk celleseparasjon inkluderer kulturen Schwann-celler med en langstrakt og spindelformmorfologi, flate og spredte fibroblaster og rester av bindevev. For å oppnå en renere kultur av Schwann-celler, utføres magnetisk celleseparasjon. Skala barer: 200 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Myelinisering av DRG-eksplanter med og uten ekstra Schwann-celler. MBP-farget område ble brukt til å måle myelinisering i kokulturen dag 14. Myeliniseringen av DRG-eksplanter økte signifikant hvis Schwann-celler ble lagt til dyrkningen (uparet t-test, **p ≤ 0,01). n = 3. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: Genuttrykksanalyse i kokulturen. Relative genuttrykksnivåer av MBP, PMP22, MAG, Oct6, Egr2 og Olig1 ble analysert i kokulturprøver på dag 22 ved qPCR (A). MBP og PMP22 var målene med de høyeste genuttrykksnivåene i kokulturen. Et eksemplarisk bilde av qPCR-amplifikasjonsprodukter påført en agarosegel demonstrerer den kvalitative overflod av målene (B). Den første og siste banen på gelen representerer en DNA-stige (100 basepar). n = 5. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en rask og lettvint protokoll for generering av in vitro myelinisering ved å slå sammen to separate celletypekulturer, Schwann-celler og dorsale rotganglioneksplanter.
Et kritisk trinn i protokollen er dyrking av DRG-eksplanter, spesielt i kulturens første dager. DRG er svært skjøre før et sterkt aksonalt nettverk er bygget og må håndteres svært nøye, for eksempel når det tas ut av inkubatoren eller under skifte av medium. DRG som løsner fra bunnen av brønnen og blir funnet svømmende i mediet, viser mislykket dyrking. For Schwann-celler kan endring av spredningshastigheter på grunn av forskjellige dyrkingsbetingelser og tilskudd (f.eks. serum i mediet) representere en utfordring for kokulturen. Hvis kulturen er overgrodd av et stort antall Schwann-celler, løsner den fra bunnen av brønnen og blir ubrukelig. Titrering av Schwann-celletallet i dyrkning anbefales derfor. Under etablering av Schwann-celleprotokollen bør renhetstester utføres ved bruk av SOX10 eller S100 immunfarging. Generelt må håndtering av kulturen, inkludert endring av medium samt vaske- og fikseringstrinn, utføres nøye for å sikre et vellykket resultat. Det er viktig å velge tidspunkt for observasjon i henhold til forskningsinteressen; Dag 14 representerer utgangspunktet for de første tette myeliniserte aksonene, og kan derfor velges som observasjonstidspunkt for initiering av myelinisering, mens senere tidspunkter gir mer komplette myelinskjeder.
Siden denne in vitro-metoden for myelinisering bare omfatter DRG- og Schwann-celler, ligner den ikke akkurat myeliniseringsprosessen i organismen. Andre medvirkende faktorer, som omgivende vev, mikromiljø, immunceller og signalering fra fjerne strukturer, er ikke representert i denne modellen. Denne metoden gir imidlertid en egnet modell for å undersøke myelinisering av PNS ved separat analyse og manipulering av begge celletyper 9,15,16. Schwann-celler eller DRG for kokulturen kan høstes fra syke eller behandlede dyr for å dechiffrere bidraget fra den spesifikke celletypen17,18. Når du bruker de sene stadiene av dette oppsettet, anbefales det sterkt å inkludere en kontrollbetingelse uten i tillegg å legge til Schwann-celler, for å utelukke mulige effekter av DRG-avledede Schwann-celler. Vår erfaring er at myelinisering i DRG-eksplanter uten Schwann-celler påvises i signifikant mindre grad enn i kokulturen (tilleggsfigur 2).
Bruken av DRG-eksplanter gir fordelen av intakt strukturell arkitektur i forhold til dissosierte nevronkulturer. Immunfluorescerende farging av myelinbasisk protein (MBP) gjør det mulig å kvantifisere det myeliniserte aksonområdet, og gir en tilstrekkelig avlesning for myelinisering i kokulturen. Genekspresjonsanalyse av kokulturprøver dag 22 viste tilstedeværelse av MBP, perifert myelinprotein (PMP22), myelinassosiert glykoprotein (MAG), oktamerbindende faktor 6 (Oct6), ETS-relatert gen 2 (Erg2) og oligodendrocytttranskripsjonsfaktor 1 (Olig1), med høyeste ekspresjonsnivå for MBP og PMP22 (tilleggsfigur 3). Derfor gir den beskrevne protokollen en metode med flere målalternativer for myeliniseringsmarkører i kokulturen.
Potensielle anvendelser av denne metoden inkluderer grunnleggende forskningsmetoder på myeliniseringsprosessen i periferien, samt validering av terapeutiske forbindelser for sykdommer i PNS, inkludert skade på myelin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Prof. Dr. Ralf Gold og PD Dr. Gisa Ellrichmann for deres råd og støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
- Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).
- Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
- Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
- Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
- Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
- Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
- Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781 (2016).
- Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).
- Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).
- Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
- Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).
- Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
- Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).
