Summary
В системе кокультуры ганглиев дорсальных корешков и шванновских клеток можно изучать миелинизацию периферической нервной системы. Эта модель предоставляет экспериментальные возможности для наблюдения и количественной оценки периферической миелинизации и изучения влияния интересующих соединений на миелиновую оболочку.
Abstract
Процесс миелинизации необходим для обеспечения быстрой и достаточной передачи сигнала в нервной системе. В периферической нервной системе нейроны и шванновские клетки участвуют в сложном взаимодействии, чтобы контролировать миелинизацию аксонов. Нарушения этого взаимодействия и разрушение миелиновой оболочки являются признаками воспалительных невропатий и возникают вторично при нейродегенеративных расстройствах. Здесь мы представляем модель кокультуры ганглиозных эксплантатов дорсальных корешков и шванновских клеток, которая развивает надежную миелинизацию периферических аксонов для исследования процесса миелинизации в периферической нервной системе, изучения взаимодействия аксон-шванновских клеток и оценки потенциального воздействия терапевтических агентов на каждый тип клеток в отдельности. Методологически ганглии дорсальных корешков эмбриональных крыс (E13.5) собирали, диссоциировали от окружающих их тканей и культивировали как целые эксплантаты в течение 3 дней. Шванновские клетки были выделены от 3-недельных взрослых крыс, а седалищные нервы были ферментативно переварены. Полученные шванновские клетки очищали магнитно-активированной сортировкой клеток и культивировали в условиях, обогащенных нейрегулином и форсколином. После 3 дней культивирования ганглиозной эксплантата дорсального корешка 30 000 шванновских клеток добавляли к одному ганглиозному эксплантату дорсального корня в среде, содержащей аскорбиновую кислоту. Первые признаки миелинизации были обнаружены на 10-й день кокультуры через рассеянные сигналы к основному белку миелина при иммуноцитохимическом окрашивании. Начиная с 14-го дня, миелиновые оболочки формировались и размножались вдоль аксонов. Миелинизация может быть количественно определена окрашиванием основного белка миелина как отношение площади миелинизации и площади аксонов, чтобы учесть различия в плотности аксонов. Данная модель предоставляет экспериментальные возможности для изучения различных аспектов периферической миелинизации in vitro, что имеет решающее значение для понимания патологии и возможных возможностей лечения демиелинизации и нейродегенерации при воспалительных и нейродегенеративных заболеваниях периферической нервной системы.
Introduction
В периферической нервной системе (ПНС) быстрая информационная трансдукция опосредована аксонами, обернутыми миелином. Миелинизация аксонов необходима для обеспечения быстрого распространения электрических импульсов, поскольку скорость проводимости нервных волокон коррелирует с диаметром аксона и толщиной миелина1. Сенсорная передача сигналов от периферии к центральной нервной системе (ЦНС) основана на активации сенсорных нейронов первого порядка, которые находятся в расширениях дорсального корешка, называемых ганглиями дорсальных корешков (DRG). Для образования и поддержания миелина необходима непрерывная связь между аксонами и шванновскими клетками, которые являются миелинизирующими глиальными клетками в ПНС.2.
Многие заболевания ПНС нарушают трансдукцию информации либо первичным аксональным, либо демиелинизирующим повреждением, что приводит к гипестезии или дизестезии. Сенсорные нейроны первого порядка обладают способностью к регенерации до некоторой степени после повреждения нейронов путем сложного взаимодействия между нейроном и окружающими шванновскими клетками3. В этом случае шванновские клетки могут подвергаться клеточному перепрограммированию, чтобы очистить аксональный и миелиновый мусор и способствовать регенерации аксонов, что приводит к ремиелинизации4. Понимание механизмов миелинизации в здоровье и заболевании важно для того, чтобы найти возможные варианты лечения демиелинизирующих расстройств ПНС. Миелин также может быть поврежден острой нейротравмой, и в настоящее время исследуются подходы, способствующие миелинизации для ускорения функционального восстановления после повреждения периферических нервов5.
Наши знания о периферической миелинизации в значительной степени выиграли от миелинизирующих кокультур шванновских клеток и сенсорных нейронов. С тех пор, как были применены первые подходы 6,7,8, миелинизация интенсивно изучалась с использованием различных систем кокультур9,10,11. Здесь мы предлагаем быстрый и простой протокол для надежной миелинизации in vitro аксонов ганглиев дорсальных корешков. Протокол подготовки шванновских клеток основан на протоколе Andersen et al.12, ранее опубликованном в Pitarokoili et al.13. Мы используем шванновские клетки, полученные от молодых крыс, и эмбриональные культуры эксплантатов DRG для совместной культуры, в которой миелинизация происходит примерно на 14-й день. Целью метода является создание системы для исследования образования миелина в результате прямого взаимодействия аксон-шванновских клеток, а также изучение модуляторов миелинизации ПНС. По сравнению с диссоциированными культурами нейрональных клеток, эксплантаты DRG более анатомически сохранены и образуют длинные аксональные отростки. Количественная оценка площади миелинизированного аксона обеспечивает достаточное считывание миелинизации в кокультуре. Этот метод является ценным инструментом для скрининга терапевтических соединений на предмет их потенциального влияния на миелинизацию ПНС, а также может быть использован в дополнение к исследованиям in vivo на животных моделях14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были выполнены в соответствии с Директивой Совета Европейских сообществ по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Шванновская клеточная культура
- Покрытие для шванновской клеточной культуры
- Покройте чашки для клеточных культур в стерильных условиях. Нанесите 2 мл 0,01% поли-L-лизина (ФАПЧ) на две чашки для культивирования тканей (ТС) диаметром 60 мм каждая и инкубируйте в течение ночи при 4 ° C.
- Удалите ФАПЧ, вымойте посуду TC 2 раза дистиллированной водой и инкубируйте с 2 мл 1 мкг/см2 ламинина в течение ночи при температуре 4 °C. Вымойте посуду TC 2 раза аквадестом и дайте тарелкам высохнуть на воздухе.
- Подготовка среды для культивирования шванновских клеток
- Приготовьте 50 мл шванновской клеточной среды, добавив 10% инактивированную теплом эмбриональную телячью сыворотку (FCS), 2 мкМ форсколина, 10 нМ нейрегулина и 50 мкг/мл гентамицина к модифицированной среде орла Дульбекко (DMEM)/F-12 (с высоким содержанием глюкозы) в стерильных условиях.
- Приготовьте 70 мл среды L-15 Лейбовица с 50 мкг/мл гентамицина в стерильных условиях.
- Подготовка седалищного нерва
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы подготовки седалищного нерва выполняются под чистой скамьей.- Приготовьте одну чашку TC диаметром 100 мм с 5 мл ледяного фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS) без Ca 2+ и Mg2+, одну чашку TC диаметром 100 мм с 5 мл ледяной среды L-15 Лейбовица и одну чашку TC диаметром 100 мм с 5 мл ледяной среды L-15 Лейбовица и 50 мкг/мл гентамицина.
- Очистите все инструменты автоклавированием. Опрыскайте инструменты и рабочую зону 70% этанолом.
- Усыпить пятерых 3-недельных крыс-самцов Sprague Dawley с помощью ингаляции и обезглавливания CO2 . Опрыскайте туловище крысы 70% этанолом.
- Вскройте ножницами спинную нижнюю левую конечность и осторожно удалите двуглавую мышцу бедра. Ослабьте седалищный нерв путем плавного возвышения с помощью изогнутых щипцов, чтобы не ушибнуть нерв.
- Удерживайте самую проксимальную часть нерва изогнутыми щипцами, чтобы выпрямить нерв, и обрежьте нерв как можно выше с помощью ножниц. Затем подрежьте ножницами нерв близко к крестцовому сплетению и лапе. Повторите шаги 1.3.4-1.3.5 для правой стороны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Открывая конечность, следите за тем, чтобы не повредить кровеносные сосуды. - С помощью щипцов поместите левый и правый седалищные нервы в 100-миллиметровую чашку TC с ледяным DPBS.
- Восстановление седалищного нерва
- Используйте щипцы для переноса всех нервов в чашку TC диаметром 100 мм с ледяной средой L-15 Лейбовица и гентамицином 50 мкг/мл. Продолжайте использовать стереомикроскоп и удалите жир, мышцы и кровеносные сосуды из нервов с помощью двух пар тонких щипцов. Захватите нервы щипцами и перенесите их в чашку TC диаметром 100 мм с ледяной средой L-15 Лейбовица.
- Определите проксимальный и дистальный окончания седалищного нерва. Удалите эпиневрий одной парой тонких щипцов в проксимальном и дистальном направлении, удерживая проксимальный нервный конец второй парой тонких щипцов.
- Перенесите очищенные нервы в чашку TC диаметром 100 мм с ледяной средой L-15 Лейбовица и гентамицином 50 мкг/мл. Дразните изолированные нервные пучки, чтобы разделить и изолировать отдельные нервные волокна с помощью двух пар тонких щипцов.
- Перенесите нервные волокна в пробирку объемом 50 мл с помощью серологической пипетки объемом 10 мл и возьмите как можно меньше среды. Добавьте 50 мл среды L-15 Лейбовица с 50 мкг/мл гентамицина к нервным волокнам и несколько раз проведите в трубке объемом 50 мл.
- Ферментативное переваривание седалищного нерва
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы (этапы 1.5-1.8, 2.1 и 2.2) выполняются в стерильных условиях.- Приготовьте ферментативный раствор для сбраживания, содержащий 0,25% диспазы II, 0,05% коллагеназы I типа и 50 мкг/мл гентамицина в 10 мл DMEM (с высоким содержанием глюкозы).
- Центрифугируйте пробирку при 188 x g в течение 5 мин при 4 ° C, удалите надосадочную жидкость серологической пипеткой объемом 25 мл и перенесите гранулу с оставшейся средой L-15 Лейбовица в чашку TC диаметром 60 мм с помощью пипетки объемом 1000 мл.
- Промойте пробирку объемом 50 мл 10 мл раствора ферментативного пищеварения и добавьте ее в посуду, содержащую нервные волокна. Аккуратно распределите ткань в посуде кончиком пипетки, чтобы максимально использовать доступную поверхность для пищеварения.
- Инкубировать при 37 ° C и 5% CO 2 в течение 18 часов и остановить разложение, добавив 10 мл 40% FCS в сбалансированный солевой раствор Хэнкса без Ca 2 и Mg2 + (HBSS).
- Разделение клеток
- Перенесите переваренные нервы в пробирку объемом 50 мл с помощью серологической пипетки и центрифуги при 188 x g в течение 10 мин при 4 ° C. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 10 мл DMEM, содержащего 10% FCS и 50 мкг/мл гентамицина. Затем ресуспендируйте гранулу 20 раз, используя наконечник пипетки объемом 10 мл, 5 мл, 2 мл, 1 мл и 200 мкл.
- Отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатый фильтр и центрифугу 100 мкм при 188 x g в течение 10 мин при 4 °C. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте гранулу с 4 мл DMEM, содержащим 10% FCS и 50 мкг / мл гентамицина.
- Добавьте 2 мл клеточной суспензии в каждую из двух 60-миллиметровых чашек TC, покрытых ФАПЧ и ламинином, и инкубируйте при 37 ° C и 5% CO2. Оставьте пластины нетронутыми на 2 дня в инкубаторе, чтобы защитить клетки от механического воздействия и поддержать прилипание.
- Дифференцировка шванновских клеток
- Через 2 дня удалите среду и тщательно промойте пластины 2 раза с DMEM (высоким содержанием глюкозы), 10% FCS и 50 мкг/мл гентамицина. После этого добавьте 2 мл шванновской клеточной среды. Заменяйте шванновскую клеточную среду каждые2-й день и наблюдайте за внешним видом и слиянием клеток с помощью микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шванновские клетки и эксплантаты DRG должны быть подготовлены своевременно и скоординированно для совместной культуры. Убедитесь, что крыса с эмбрионами при E 13,5 доступна для подготовки DRG, когда шванновские клетки близки к слиянию 80%.
- Через 2 дня удалите среду и тщательно промойте пластины 2 раза с DMEM (высоким содержанием глюкозы), 10% FCS и 50 мкг/мл гентамицина. После этого добавьте 2 мл шванновской клеточной среды. Заменяйте шванновскую клеточную среду каждые2-й день и наблюдайте за внешним видом и слиянием клеток с помощью микроскопа.
- Трипсинизация клеток и магнитная сепарация
ПРИМЕЧАНИЕ: Иллюстративные изображения различных стадий культивирования шванновских клеток см. на дополнительном рисунке 1.- Когда клетки достигнут слияния около 80% (6-12 дней культивирования), тщательно вымойте пластины 2 раза с 3 мл DPBS и инкубируйте с 2 мл 0,05% трипсина / ЭДТА (предварительно подогретого до 37 ° C) в течение 3 минут. Когда клетки отделяются от дна пластины, инактивируют пищеварение добавлением 2 мл DMEM с 10% FCS и 50 мкг/мл гентамицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Придерживайтесь времени трипсинизации строго 3 минуты и быстро продолжайте после этого. - Ресуспендируют клеточную гранулу в 2 мл магнитного буфера для разделения клеток, содержащего DPBS с 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 нМ ЭДТА. Соедините 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего и подсчитайте клетки с помощью камеры окрашивания.
- Центрифугируют суспензию ячейки при 188 x g в течение 10 мин при 4 °C и ресуспендируют гранулу ячейки в 90 мкл магнитного буфера для разделения ячеек на 1 x 107 ячеек. Добавьте 10 мкл микрогранул Thy-1 на 1 x 107 клеток. Суспендировать раствор несколько раз и инкубировать в течение 15 мин в темноте при 8 °C.
- Добавьте 2 мл магнитного буфера для разделения ячеек в суспензию ячейки и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин при 4 ° C. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл буфера для разделения магнитных элементов.
- Увлажните колонку для разделения магнитных ячеек 1 мл буфера для разделения магнитных ячеек. Поместите колонну разделения магнитных ячеек в сепаратор магнитных ячеек. Приложите ячейки к магнитной сепарационной колонке. Соберите поток и центрифугу при 300 x g при 4 ° C в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фибробласты положительно отбираются и остаются в колонке, в то время как шванновские клетки проходят через колонку. Фибробласты могут быть собраны с помощью штампа (например, в качестве отрицательного контроля для протоколов окрашивания шванновских клеток). - Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл среды для совместной культуры (см. этап 3.1.1). Посчитайте клетки после окрашивания трипановым синим и камеру окрашивания.
- Когда клетки достигнут слияния около 80% (6-12 дней культивирования), тщательно вымойте пластины 2 раза с 3 мл DPBS и инкубируйте с 2 мл 0,05% трипсина / ЭДТА (предварительно подогретого до 37 ° C) в течение 3 минут. Когда клетки отделяются от дна пластины, инактивируют пищеварение добавлением 2 мл DMEM с 10% FCS и 50 мкг/мл гентамицина.
2. Культура эксплантата DRG
- Подготовка питательной среды DRG
- Приготовьте питательную среду DRG, добавив в нейробазальную среду 2% B27, 2% лошадиной сыворотки, 1% L-глютамина, 0,5% пенициллина/стрептомицина и 10 нг/мл фактора роста нервов (NGF). Храните питательную среду при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Питательную среду можно использовать в течение 2 дней.
- Приготовьте питательную среду DRG, добавив в нейробазальную среду 2% B27, 2% лошадиной сыворотки, 1% L-глютамина, 0,5% пенициллина/стрептомицина и 10 нг/мл фактора роста нервов (NGF). Храните питательную среду при температуре 4 °C.
- Покрытие для эксплантатов DRG
- Инкубируют покровные стекла в 70% этаноле в течение 1 ч и помещают в лунки 4-луночной посуды с помощью изогнутых щипцов. После высыхания этанола нанесите 300 мкл 0,2 мг/мл поли-D-лизина (PDL) на лунку и инкубируйте в течение ночи при 37 ° C и 5% CO2.
- Стирайте покровные стекла 3 раза по 5 минут каждое с помощью DPBS последовательно. Снимите DPBS, нанесите 300 мкл 1 мкг/мл ламинина на покровные стекла и инкубируйте в течение ночи при 37 ° C и 5% CO2.
- После трех этапов промывки DPBS в течение 5 минут замените DPBS на 190 мкл питательной среды DRG. Поместите 4-луночные планшеты в инкубатор при температуре 37 °C и 5% CO2.
- Подготовка ДРГ
ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите DRG эмбриональных крыс под чистой скамьей.- Перед подготовкой очистите все инструменты 70% этанолом. Наполните 10 (по две на эмбрион) 35-миллиметровых посуды TC 2 мл ледяного HBSS на блюдо, а две чашки TC 100 мм — 5 мл ледяного HBSS на блюдо.
- Усыпить беременных крыс (взрослых самок крыс Sprague Dawley, E13.5) путем вдыхания и обезглавливания CO2 .
- Опрыскайте на тело 70% этанолом и вскройте брюшное туловище крысы. Осторожно извлеките матку и поместите ее в 100-миллиметровую чашку TC с ледяным HBSS.
- Удерживайте матку с помощью изогнутых щипцов и открывайте стенки матки тонкими щипцами. Удалите один амниотический мешок и осторожно откройте его, защипнув отверстие тонкими щипцами.
- Удалите эмбрион из окружающих тканей, перережьте пуповину и обезглавьте эмбрион с помощью тонких щипцов. Поместите туловище в чашку TC диаметром 100 мм, заполненную HBSS, с помощью изогнутых щипцов и шпателя.
- Быстро удалите все эмбрионы из матки и перенесите их в одну чашку TC диаметром 100 мм, заполненную HBSS. Если эмбрионов более пяти, приготовьте дополнительную чашку TC диаметром 35 мм с 2 мл HBSS в соответствии с этапом 2.3.1.
- Аккуратно поместите один торс эмбриона в чашку TC диаметром 35 мм, наполненную HBSS, с помощью шпателя и изогнутых щипцов. Под стереомикроскопом откройте дорсальную часть туловища, чтобы разделить эмбрион на две половины с помощью тонких щипцов и микроножниц. Поверните одну половину в сторону и определите нить DRG, расположенную в линию у дорсальной части эмбриона.
- Вырежьте DRG как целую прядь с помощью тонких щипцов и микроножниц. Поместите DRG в свежую 35-миллиметровую чашку TC, заполненную 2 мл HBSS, и отделите одну DRG от оставшейся ткани с помощью тонких щипцов и микроножниц.
- Культура клеток DRG
- Возьмите 4-луночные планшеты, содержащие 190 мкл питательной среды DRG, из инкубатора на чистый стол, где должны быть приготовлены DRG. Аккуратно перенесите одну DRG в одну лунку 4-луночной культуральной пластины с помощью тонких щипцов и шпателя. Поместите ДРГ в центр каждой лунки, так как центральное положение важно для крепления ДРГ.
- Отныне работайте в стерильных условиях. Поместите эксплантные культуры в инкубатор при температуре 37 °C и 5% CO2. На следующий день осторожно добавьте 50 мкл питательной среды DRG в каждую лунку с помощью пипетки объемом 100 мл.
- Ежедневно наблюдайте за адгезией эксплантатов DRG и ростом аксонов с помощью микроскопа и отбрасывайте эксплантаты DRG, которые отделились от покровного стекла или не смогли перерасти аксоны на 3-й день культивирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксплантаты DRG очень хрупкие в первые дни культивирования, и с ними нужно обращаться осторожно, особенно при перемещении тарелок в инкубатор и из него при смене среды или даже при закрытии дверцы инкубатора. Точный объем среды 190 мкл на лунку имеет решающее значение для поддержания эксплантатов DRG на месте в течение первого дня культивирования. Рыхлые эксплантаты DRG могут быть легко идентифицированы во время ежедневного контроля, так как они плавают в среде, а не прилипают к покровному стеклу.
3. Кокультура
- Перенос шванновских клеток в культуру эксплантата DRG
- Приготовьте среду для кокультуры, добавив 0,1% аскорбиновой кислоты в питательную среду DRG.
- На 3-й день культивирования эксплантата DRG осторожно замените питательную среду DRG на 250 мкл среды для кокультуры, содержащей 30 000 шванновских клеток (с шага 1.8) на лунку.
- Сохраняйте кокультуру эксплантатов DRG и шванновских клеток до 22 дней. Осторожно заменяйте 250 мкл среды для кокультуры через день и наблюдайте за внешним видом клеток с помощью микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример аксонов DRG и шванновских клеток в кокультуре в первые дни культивирования см. на рисунке 1.
- Иммуноцитохимическое окрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень осторожно обращайтесь с образцами кокультуры во время процедуры окрашивания, так как их можно легко повредить.- Чтобы зафиксировать ячейки на покровных стеклах, медленно удалите среду, тщательно промойте 3 раза DPBS и инкубируйте в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 10 минут. Замените PFA на DPBS и храните фиксированные ячейки при температуре 4 ° C до 1 недели.
ВНИМАНИЕ: При работе с 4% ПФА надевайте рекомендуемые средства индивидуальной защиты. - Промойте покровные стекла 3 раза DPBS в течение 5 мин, затем заблокируйте блокирующим раствором (10% козья сыворотка, 10% бычий сывороточный альбумин [BSA], 0,1% желатин и 0,05% Triton X-100) в DPBS в течение 1 часа. Разбавляют первичные антитела βIII-тубулин (1:7,500) и основной белок миелина (МБП) (1:750) в блокирующем растворе и инкубируют в течение ночи при 4 °C.
- Промойте ячейки 3 раза с помощью DPBS в течение 5 мин. Используйте флуоресцентные вторичные антитела, конъюгированные с красителем, в разведении 1:1000 в блокирующем растворе и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре (RT).
- Промойте клетки 3 раза с помощью DPBS в течение 5 минут и установите клетки на микроскопические предметные стекла с флуоресцентной монтажной средой, включая 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Хранить предметные стекла в темноте при температуре 4 °C до микроскопической документации.
ВНИМАНИЕ: При работе с флуоресцентной монтажной средой надевайте рекомендуемые средства индивидуальной защиты.
- Чтобы зафиксировать ячейки на покровных стеклах, медленно удалите среду, тщательно промойте 3 раза DPBS и инкубируйте в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 10 минут. Замените PFA на DPBS и храните фиксированные ячейки при температуре 4 ° C до 1 недели.
- Анализ
- Сфотографируйте восемь определенных областей, окружающих эксплантат DRG в центре, с помощью инвертированного микроскопа.
- Используйте программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки областей βIII-тубулиновых положительных аксонов и миелинизации, окрашенных MBP.
- Рассчитайте процент миелинизации как отношение миелинизированных аксонов и немиелинизированных аксонов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Миелинизацию в кокультуре оценивали на 10, 12, 14, 16, 18 и 20 сутки. Эксплантаты DRG и шванновские клетки окрашивали на MBP, βIII-тубулин и DAPI. Аксональная сеть в кокультуре была плотной и не изменялась заметно во время наблюдения. Первые признаки миелина в виде мелких фрагментов были обнаружены на 10-й день и усилились на 12-й день (рис. 2). Количество ПМБ-положительных областей увеличивалось с течением времени до 20-го дня культивирования. Количественно оценивали миелинизацию как соотношение положительных областей MBP и βIII-тубулина. Миелинизация значительно увеличилась на 18-й и 20-й день по сравнению с 10-м днем (рис. 3; ** p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001).
Рисунок 1: Появление шванновских клеток и аксонов в кокультуре. Примерная картина кокультуры на 3 день. Черные стрелки показывают тонкие аксоны DRG, а белая стрелка указывает на шванновскую клетку с удлиненной и веретенообразной морфологией, прикрепленной к аксону. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Миелинизация в кокультуре эксплантатов DRG и шванновских клеток. Окрашивание нейронального маркера βIII-тубулина и MBP проводили на 10, 12, 14, 16, 18 и 20-е сутки после объединения обеих культур для изучения развития миелинизации в кокультуре. Первые признаки миелинизации были видны на 10-й и 12-й день кокультуры. С 14-го дня сигнал MBP был более выраженным, и были обнаружены аксоны, обернутые миелином. Миелинизация увеличивалась со временем совместной культуры до 20-го дня. Масштабные линейки: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количественная оценка миелинизации. На 10-й, 12-й, 14-й, 16-й, 18-й и 20-й день кокультурирования миелинизацию оценивали окрашиванием аксонов βIII-тубулином и миелином MBP. Процент миелинизированных аксонов определяли расчетом соотношения участков MBP-положительного и βIII-тубулина. Значимые различия были обнаружены на 18-й и 20-й день по сравнению с 10-м днем кокультуры. Данные выражаются в виде среднего значения ± SEM; n = 3. Односторонний ANOVA с многократным сравнением Крускала-Уоллиса и теста Данна post hoc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Стадии культивирования шванновских клеток. Иллюстративные снимки светлого поля культивируемых шванновских клеток (А) до и (В) после разделения магнитных клеток. Перед магнитным разделением клеток культура включает шванновские клетки с морфологией удлиненной и веретенообразной формы, плоские и рассредоточенные фибробласты и остатки соединительной ткани. Для достижения более чистой культуры шванновских клеток проводят магнитное разделение клеток. Масштабные линейки: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Миелинизация эксплантатов DRG с дополнительными шванновскими клетками и без них. Область, окрашенная MBP, использовалась для измерения миелинизации в кокультуре на 14-й день. Миелинизация эксплантатов DRG была достоверно увеличена при добавлении шванновских клеток в культуру (непарный t-критерий, **p ≤ 0,01). n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Анализ экспрессии генов в кокультуре. Относительные уровни экспрессии генов MBP, PMP22, MAG, Oct6, Egr2 и Olig1 анализировали в образцах кокультуры на 22-й день с помощью кПЦР (А). MBP и PMP22 были мишенями с самыми высокими уровнями экспрессии генов в кокультуре. Примерная картина продуктов амплификации кПЦР, нанесенных на агарозный гель, демонстрирует качественное изобилие мишеней (В). Первая и последняя дорожки на геле представляют собой лестницу ДНК (100 пар оснований). n = 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем быстрый и простой протокол генерации миелинизации in vitro путем слияния двух отдельных культур клеточного типа, шванновских клеток и эксплантатов ганглиев дорсальных корешков.
Важнейшим этапом протокола является выращивание эксплантатов ДРГ, особенно в первые дни культуры. DRG очень хрупкие до того, как будет построена сильная аксональная сеть, и с ними нужно обращаться очень осторожно, например, при извлечении из инкубатора или во время смены среды. ДРГ, которые отрываются от дна колодца и плавают в среде, показывают неудачное выращивание. Для шванновских клеток изменение скорости пролиферации из-за различных условий культивирования и добавок (например, сыворотки в среде) может представлять собой проблему для кокультуры. Если культура обрастает чрезмерным количеством шванновских клеток, она отрывается от дна лунки и приходит в негодность. Поэтому рекомендуется титрование количества шванновских клеток в культуре. Во время создания протокола шванновских клеток следует проводить тесты на чистоту с использованием иммуноокрашивания SOX10 или S100. В целом, обработка культуры, включая смену среды, а также этапы промывки и фиксации, должна выполняться осторожно, чтобы обеспечить успешный результат. Важно выбрать момент времени наблюдения в соответствии с исследовательским интересом; День 14 представляет собой отправную точку для первых плотных миелинизированных аксонов, и поэтому может быть выбран в качестве временной точки наблюдения для начала миелинизации, в то время как более поздние временные точки предлагают более полные миелиновые оболочки.
Поскольку этот метод миелинизации in vitro включает только DRG и шванновские клетки, он не совсем похож на процесс миелинизации в организме. Другие способствующие факторы, такие как окружающие ткани, микроокружение, иммунные клетки и передача сигналов от отдаленных структур, не представлены в этой модели. Тем не менее, этот метод обеспечивает подходящую модель для исследования миелинизации ПНС путем раздельного анализа и манипулирования обоими типами клеток 9,15,16. Шванновские клетки или DRG для совместной культуры могут быть собраны у больных или обработанных животных, чтобы расшифровать вклад конкретного типа клеток17,18. При использовании поздних стадий этой установки настоятельно рекомендуется включить контрольное условие без дополнительного добавления шванновских клеток, чтобы исключить возможные эффекты шванновских клеток, полученных из DRG. По нашему опыту, миелинизация в эксплантатах DRG без шванновских клеток обнаруживается в значительно меньшей степени, чем в кокультуре (дополнительный рисунок 2).
Использование эксплантатов DRG обеспечивает преимущество интактной структурной архитектуры по сравнению с диссоциированными нейронными культурами. Иммунофлуоресцентное окрашивание основного белка миелина (MBP) позволяет количественно определить площадь миелинизированного аксона и обеспечивает достаточное считывание миелинизации в кокультуре. Анализ экспрессии генов образцов кокультур на 22-й день выявил наличие MBP, периферического белка миелина (PMP22), миелиноассоциированного гликопротеина (MAG), октамер-связывающего фактора 6 (Oct6), гена, связанного с ETS 2 (Erg2) и фактора транскрипции олигодендроцитов 1 (Olig1), с самыми высокими уровнями экспрессии для MBP и PMP22 (дополнительный рисунок 3). Таким образом, описанный протокол обеспечивает способ с несколькими вариантами мишени для маркеров миелинизации в кокультуре.
Потенциальные области применения этого метода включают фундаментальные подходы к исследованию процесса миелинизации на периферии, а также валидацию терапевтических соединений при заболеваниях ПНС, включая повреждение миелина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора д-ра Ральфа Голда и приват-доцента д-ра Гизу Эллрихманн за их советы и поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
- Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).
- Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
- Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
- Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
- Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
- Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
- Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781 (2016).
- Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).
- Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).
- Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
- Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).
- Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
- Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).
