zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュヒト遺伝病モデリングのための効率的なPAMレスベース編集
Summary
このプロトコルは、zSpRY-ABE8eを使用して正確なゼブラフィッシュ病モデルを構築するために、PAMの制限なしに効率的なアデニン塩基編集を実行する方法について説明します。
Abstract
CRISPR/Cas9技術は、ヒト遺伝病のモデル化、疾患病因の研究、および薬物スクリーニングのためのゼブラフィッシュの価値を高めましたが、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の制限は、一塩基変異体(SNV)によって引き起こされるヒト遺伝性疾患の正確な動物モデルを作成する上で大きな障害となっています。これまで、幅広いPAM互換性を持ついくつかのSpCas9バリアントは、ゼブラフィッシュで効率を示してきました。最適化されたSpRY媒介アデニン塩基エディター(ABE)、zSpRY-ABE8e、および合成修飾gRNAをゼブラフィッシュに適用することで、PAMの制限なしに効率的なアデニン-グアニン塩基変換が可能になりました。ここで説明するのは、zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュにおけるPAM制限のない効率的なアデニン塩基編集のためのプロトコルである。zSpRY-ABE8e mRNAと合成修飾gRNAの混合物をゼブラフィッシュ胚に注入することにより、TSR2リボソーム成熟因子(tsr2)の病原部位を模擬した正確な変異を有するゼブラフィッシュ病モデルを構築した。この方法は、疾患メカニズムと治療法を研究するための正確な疾患モデルを確立するための貴重なツールを提供します。
Introduction
ミスセンス変異またはナンセンス変異を引き起こす一塩基変異体(SNV)は、ヒトゲノム1における最も一般的な変異源です。特定のSNVが病原性であるかどうかを判断し、その病因を明らかにするためには、正確な動物モデルが必要です2。ゼブラフィッシュは、ヒトとの高度な生理学的および遺伝的相同性、短い発生サイクル、および強力な繁殖能力を示す優れたヒト疾患モデルであり、病原性の特徴とメカニズムの研究、および薬物スクリーニングに有利です3。
クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)/Cas9システムは、ゼブラフィッシュ4を含むさまざまな種のゲノム編集に広く適用されています。gRNAガイダンスにより、CRISPR/Cas9システムは標的部位でDNA二本鎖切断(DSB)を生成することができ、相同性指向性修復(HDR)経路を介して標的部位とドナーDNAテンプレートとの組換えによる一塩基置換が可能になります。しかし、細胞DNA修復プロセスは主に非相同末端結合(NHEJ)経路によって行われ、通常は挿入および欠失(インデル)変異を伴うため、この塩基置換法の効率は非常に低いです5。幸いなことに、CRISPR/Cas9ベースのシングルベース編集技術は、DSBを誘導することなくより効率的なシングルベース編集を可能にするベースエディタを使用することで、この問題を大幅に軽減します。Two major classes of base editors, adenine base editors (ABEs) and cytosine base editors (CBEs), have been developed to implement base substitution editing for A·T から G·C および C·G から T ·A、それぞれ6、7、8、9、10、11。これらの4種類の塩基置換は、ヒト病原性多様体の30%をカバーしています12。PmCDA1、BEシステム、CBE4max、ABE7.10、ABE8eを含む両方のクラスのベースエディタは、ゼブラフィッシュで動作することが報告されており、特にBE4maxとABE8eは高い編集活動を達成することが報告されています13,14,15,16,17,18,19。
黄色ブドウ球菌、化膿レンサ球菌、およびS.canisを含む異なる種のCas9タンパク質は、ゼブラフィッシュ遺伝子編集に実装されており、化膿レンサ球菌Cas9(SpCas9)が最も広く使用されています20,21,22,23。 しかしながら、SpCas9は、NGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を有する標的部位しか認識できず、これはその編集可能な範囲を制限し、その結果、目的の病原性部位の近くに適切な配列が見出されない可能性がある24。ターゲット範囲を拡大するために、さまざまなSpCas9バリアントが、指向性進化と構造ガイド付き設計を通じてさまざまなPAMを認識するように設計されています。しかし、動物、特にゼブラフィッシュに有効な変異体はほとんどなく、SNV関連疾患研究におけるゼブラフィッシュの適用を制限しています25,26,27,28。最近、SpCas9の2つのバリアント、SpGおよびSpRYは、PAM制限がそれほど厳しくない(SpGのNGNおよびSpRYのNNNはNYNよりもNRNの選好が高い)が、ヒトの細胞および植物において高い編集活性を示すことが報告されている29,30,31,32。その後、SpGとSpRY、およびSpRYを介したCBEやSpRYを介したABEなどの多くの媒介ベースエディターもゼブラフィッシュで機能することが報告されており、SNV関連疾患の機構研究と薬物スクリーニングにおけるゼブラフィッシュモデルの適用を強化します18,33,34,35.さらに、i-Silenceは、ABEを介したATGからGTGまたはACG36への開始コドン変換による効果的で正確な遺伝子ノックアウト戦略として提案されました。i-Silence戦略とSpRYを介したベースエディターzSpRY-ABE8eの組み合わせは、疾患モデリングのための新しい方法を提供します18。このプロトコルは、ゼブラフィッシュでzSpRY-ABE8eを使用して遺伝子編集を実行し、i-Silence戦略を使用してtsr2(M1V)モデルを構築する方法を示しています。ゼブラフィッシュモデルに現れる編集効率と表現型を評価および分析しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、ベースエディタzSpRY-ABE8eを使用したゼブラフィッシュ病モデルの構築を記述します。塩基置換のための従来のHDR経路と比較して、このプロトコルはより効率的な塩基編集を達成し、インデルの発生を減らすことができます。同時に、このプロトコルには、最近提案されたi-Silence遺伝子ノックアウト戦略をゼブラフィッシュに実装することが含まれます。まとめると、zSpRY-AB…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿の草稿の英語テキストを編集してくれたLiwen Bianji(Edanz)のBarbara Garbers博士に感謝します。この研究は、広東省の主要地域研究開発プログラム(2019B030335001)、中国の国家重点研究開発プログラム(2019YFE0106700)、中国国家自然科学財団(32070819、31970782)、および広東省の水生経済動物の病原生物学および疫学の主要研究所の研究基金プログラム(PBEA2020YB05)によってサポートされました。
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
Riferimenti
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