Scaffolds Decelularizados Derivados de Maçã para Engenharia de Tecido Ósseo In Vitro e In Vivo

Summary

Neste estudo, detalhamos métodos de decelularização, caracterização física, imageamento e implantação in vivo de biomateriais de base vegetal, bem como métodos de semeadura e diferenciação celular nos scaffolds. Os métodos descritos permitem a avaliação de biomateriais de origem vegetal para aplicações em engenharia de tecido ósseo.

Abstract

Biomateriais de celulose derivados de plantas têm sido empregados em diversas aplicações de engenharia de tecidos. Estudos in vivo têm demonstrado a notável biocompatibilidade de arcabouços feitos de celulose derivada de fontes naturais. Além disso, esses arcabouços possuem características estruturais relevantes para múltiplos tecidos e promovem a invasão e proliferação de células de mamíferos. Pesquisas recentes utilizando tecido hipântio de maçã decelularizado demonstraram a semelhança de seu tamanho de poro com o do osso trabecular, bem como sua capacidade de apoiar efetivamente a diferenciação osteogênica. O presente estudo examinou ainda o potencial de scaffolds de celulose derivados de maçã para aplicações em engenharia de tecido ósseo (BTE) e avaliou suas propriedades mecânicas in vitro e in vivo . Pré-osteoblastos MC3T3-E1 foram semeados em scaffolds de celulose derivados de maçã que foram então avaliados quanto ao seu potencial osteogênico e propriedades mecânicas. A coloração de fosfatase alcalina e S vermelho de alizarina confirmou a diferenciação osteogênica em scaffolds cultivados em meio de diferenciação. O exame histológico demonstrou invasão celular generalizada e mineralização através dos scaffolds. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) revelou agregados minerais na superfície dos scaffolds, e a espectroscopia de energia dispersiva (EDS) confirmou a presença de elementos fosfato e cálcio. No entanto, apesar de um aumento significativo no módulo de Young após a diferenciação celular, ele permaneceu menor do que o do tecido ósseo normal. Estudos in vivo mostraram infiltração celular e deposição de matriz extracelular dentro dos arcabouços derivados de maçãs decelularizadas após 8 semanas de implantação na calvária de ratos. Além disso, a força necessária para remover os scaffolds do defeito ósseo foi semelhante à carga de fratura relatada anteriormente do osso nativo da calota. No geral, este estudo confirma que a celulose derivada da maçã é uma candidata promissora para aplicações em BTE. Entretanto, a dissimilaridade entre suas propriedades mecânicas e as do tecido ósseo normal pode restringir sua aplicação a cenários de baixa carga de carga. Reengenharia estrutural adicional e otimização podem ser necessárias para melhorar as propriedades mecânicas de andaimes de celulose derivados de maçã para aplicações de suporte de carga.

Introduction

Grandes defeitos ósseos causados por uma lesão ou doença frequentemente requerem enxertos de biomateriais para regeneração completa¹. As técnicas atuais destinadas a melhorar a regeneração do tecido ósseo utilizam regularmente enxertos autólogos, alogênicos, xenogênicos ou sintéticos². Para o enxerto ósseo autólogo, considerado a prática de enxerto “padrão ouro” para reparar grandes defeitos ósseos, o osso é extraído do paciente. No entanto, esse procedimento de enxertia tem várias desvantagens, incluindo limitações de tamanho e forma, disponibilidade de tecido e morbidade do local de amostragem³. Além disso, os procedimentos de enxertia autóloga são suscetíveis a infecções do sítio cirúrgico, fraturas subsequentes, formação de hematoma no local da amostragem ou reconstruído e dor pós-operatória⁴. A engenharia do tecido ósseo (BTE) oferece uma alternativa potencial aos métodos convencionais de enxerto ósseo⁵. Ele combina biomateriais estruturais e células para construir novo tecido ósseo funcional. Ao projetar biomateriais para BTE, é fundamental combinar uma estrutura macroporosa, química de superfície que promova a fixação celular e propriedades mecânicas que se assemelham muito às do osso nativo⁶. Pesquisas anteriores indicaram que o tamanho ideal dos poros e o módulo de elasticidade para os biomateriais utilizados em BTE são de aproximadamente 100-200 μm⁷ e 0,1-20 GPa, respectivamente, dependendo do local de enxertia⁸. Além disso, a porosidade e a interconectividade dos poros dos scaffolds são fatores críticos que afetam a migração celular, a difusão de nutrientes e a angiogênese⁸.

O BTE tem mostrado resultados promissores com diversos biomateriais desenvolvidos e avaliados como opções alternativas aos enxertos ósseos. Alguns desses biomateriais são osteoindutores, híbridos e hidrogéis avançados⁸. Os materiais osteoindutores estimulam o desenvolvimento de estruturas ósseas neoformadas. Os materiais híbridos são compostos por polímeros sintéticos e/ou naturais⁸. Os hidrogéis avançados mimetizam a matriz extracelular (MEC) e são capazes de fornecer os fatores bioativos necessários para promover a integração do tecido ósseo⁸. A hidroxiapatita é um material tradicional e de escolha comum para BTE devido à sua composição e biocompatibilidade⁹. O vidro bioativo é outro tipo de biomaterial para BTE, que demonstrou estimular respostas celulares específicas para ativar genes necessários para a osteogênese10,11. Polímeros biodegradáveis, incluindo poli(ácido glicólico) e poli(ácido lático), também têm sido extensivamente utilizados em aplicações de BTE¹². Finalmente, polímeros naturais ou de origem natural como quitosana, quitina e celulose bacteriana também demonstraram resultados encorajadores para o BTE¹³. No entanto, enquanto polímeros sintéticos e naturais mostram potencial para BTE, o desenvolvimento de um arcabouço funcional com a macroestrutura desejada normalmente requer protocolos extensos.

Por outro lado, estruturas macroscópicas nativas de celulose podem ser facilmente derivadas de diversas plantas e nosso grupo de pesquisa demonstrou anteriormente a aplicabilidade de scaffolds à base de celulose derivados de plantas para diferentes reconstruções teciduais. De fato, após um simples tratamento com surfactante, aproveitamos a estrutura inerente do material vegetal, destacando seu potencial como biomaterial versátil¹⁴. Além disso, esses scaffolds à base de celulose podem ser utilizados para aplicações em cultura de células de mamíferos in vitro ¹⁴, são biocompatíveis e suportam vascularização subcutânea espontânea 14,15,16,17. Tanto nosso grupo de pesquisa quanto outros demonstraram que esses scaffolds podem ser obtidos a partir de plantas específicas com base na aplicação pretendida 14,15,16,17,18,19,20. Por exemplo, a estrutura vascular observada em caules e folhas de plantas apresenta uma semelhança marcante com a estrutura encontrada em tecidos animais¹⁹. Além disso, suportes de celulose derivados de plantas podem ser facilmente moldados e submetidos a modificações bioquímicas superficiais para atingir as características desejadas¹⁶. Em um estudo recente, incorporamos um tampão salino durante o processo de decelularização, levando a uma maior adesão celular observada tanto in vitro quanto in vivo ¹⁶. No mesmo estudo, demonstramos a aplicabilidade de scaffolds de celulose de origem vegetal em biomateriais compósitos por meio da fundição de hidrogéis na superfície dos scaffolds. Em estudos recentes, a funcionalização de arcabouços derivados de plantas tem demonstrado aumentar sua eficácia¹⁸. Por exemplo, um estudo realizado por Fontana e colaboradores (2017) revelou que a adesão de fibroblastos dérmicos humanos era suportada por hastes decelularizadas revestidas com RGD, enquanto hastes não revestidas não exibiam a mesma capacidade¹⁸. Além disso, os autores também demonstraram que fluidos corporais simulados modificados podem ser utilizados para mineralizar artificialmente caules de plantas descelularizadas. Em estudos mais recentes, exploramos o conceito de osteogênese mecanossensível em scaffolds de celulose de origem vegetal e avaliamos seu potencial para^BTE17,20. (2019) utilizaram arcabouços derivados de plantas para cultivar tecidos semelhantes a ossos em um ambiente in vitro ²¹. Por meio de avaliações abrangentes de diferentes fontes vegetais, os autores identificaram os scaffolds derivados da maçã como os mais ideais para o cultivo e diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Além disso, os autores propuseram que os atributos estruturais e mecânicos dos andaimes derivados de maçãs desempenham um papel fundamental na sua adequação à finalidade pretendida. Sendo os arcabouços iniciais derivados de plantas implementados em aplicações de engenharia de tecidos, os scaffolds derivados de maçãs têm demonstrado extensivamente possuir uma arquitetura surpreendentemente semelhante à do osso humano, notadamente em termos de seus poros interconectados variando de 100 a 200 μm de diâmetro^14,21.

No presente estudo, investigamos o potencial de scaffolds de celulose derivados de maçã para BTE e realizamos uma análise de suas propriedades mecânicas tanto in vitro quanto in vivo. Embora existam estudos sobre o potencial de scaffolds derivados de maçãs para BTE 17,20,21, suas propriedades mecânicas têm sido pouco investigadas. Os resultados mostraram invasão selvagem e diferenciação osteogênica de pré-osteoblastos MC3T3-E1 semeados em scaffolds que foram cultivados em meio de diferenciação por 4 semanas. O módulo de Young desses scaffolds foi de 192,0 ± 16,6 kPa, significativamente maior do que os scaffolds blank (scaffolds sem células semeadas) (31,6 ± 4,8 kPa) e os scaffolds cell-seed cultivados em meio de não diferenciação (24,1 ± 8,8 kPa). No entanto, deve-se notar que o módulo de Young do tecido ósseo humano saudável tipicamente está dentro da faixa de 0,1-2 GPa para o osso trabecular e aproximadamente 15-20 GPa para o osso cortical⁸. No entanto, após um implante de 8 semanas em um defeito na calvária de roedores, os arcabouços com sementes de células pareciam estar bem integrados ao osso circundante, como demonstrado por um pico de força médio de 113,6 N ± 18,2 N em testes de push-out, que é semelhante à carga de fratura relatada anteriormente do osso nativo da calota^craniana22. Em geral, os resultados obtidos a partir deste estudo mostram uma promessa significativa, particularmente para aplicações sem suporte de carga. No entanto, os suportes de celulose derivados da maçã não possuem atualmente as propriedades mecânicas necessárias para combinar precisamente com o tecido ósseo circundante em um local de implante. Consequentemente, é necessário um maior desenvolvimento para desbloquear todo o potencial destes andaimes.

Protocol

Os protocolos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Ottawa. 1. Preparação do andaime Use uma fatia de bandolim para cortar maçãs McIntosh (Canada Fancy) em fatias de 8 mm de espessura. Corte o tecido do hipântio das fatias de maçã em quadrados de 5 mm x 5 mm. Colocar as amostras quadradas em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1% durante 2 dias. Lavar as amostras decelularizadas co…

Representative Results

Medida do tamanho dos poros, distribuição celular e mineralização in vitro (Figura 1 e Figura 2)A remoção completa dos componentes celulares nativos dos scaffolds de tecido macieira foi obtida após o tratamento dos scaffolds com SDS e CaCl2 (Figura 1A). Os scaffolds exibiam uma estrutura altamente porosa, o que foi confirmado por microscopia confocal. A quantificação das imagens demo…

Discussion

Vários estudos in vitro e in vivo têm demonstrado a biocompatibilidade da celulose vegetal e seu potencial uso na engenharia tecidual 14,15,16,18,19,20, mais especificamente para hospedar a diferenciação osteogênica ^20,21. Os objetivos do prese…

Materials

4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology