Dezellularisierte aus Äpfeln gewonnene Gerüste für das Bone Tissue Engineering in vitro und in vivo

Summary

In dieser Studie beschreiben wir Methoden der Dezellularisierung, der physikalischen Charakterisierung, der Bildgebung und der in vivo Implantation von pflanzlichen Biomaterialien sowie Methoden zur Zellaussaat und Differenzierung in den Scaffolds. Die beschriebenen Methoden ermöglichen die Evaluierung von pflanzlichen Biomaterialien für Anwendungen im Bone Tissue Engineering.

Abstract

Pflanzliche Zellulose-Biomaterialien werden in verschiedenen Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt. In-vivo-Studien haben die bemerkenswerte Biokompatibilität von Scaffolds aus Zellulose aus natürlichen Quellen gezeigt. Darüber hinaus besitzen diese Gerüste strukturelle Eigenschaften, die für mehrere Gewebe relevant sind, und sie fördern die Invasion und Proliferation von Säugetierzellen. Neuere Forschungen mit dezellularisiertem Apfelhypanthium-Gewebe haben die Ähnlichkeit seiner Porengröße mit der von trabekulärem Knochen sowie seine Fähigkeit, die osteogene Differenzierung effektiv zu unterstützen, gezeigt. In der vorliegenden Studie wurde das Potenzial von aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten für Anwendungen im Bereich Bone Tissue Engineering (HdO) untersucht und ihre mechanischen Eigenschaften in vitro und in vivo bewertet. MC3T3-E1-Präosteoblasten wurden in aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten ausgesät, die dann auf ihr osteogenes Potenzial und ihre mechanischen Eigenschaften untersucht wurden. Die alkalische Phosphatase und die Alizarinrot-S-Färbung bestätigten die osteogene Differenzierung in Scaffolds, die in Differenzierungsmedium kultiviert wurden. Die histologische Untersuchung zeigte eine weit verbreitete Zellinvasion und Mineralisierung über die Scaffolds hinweg. Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) zeigte mineralische Aggregate auf der Oberfläche der Gerüste, und die energiedispersive Spektroskopie (EDS) bestätigte das Vorhandensein von Phosphat- und Kalziumelementen. Trotz eines signifikanten Anstiegs des Elastizitätsmoduls nach der Zelldifferenzierung blieb er jedoch niedriger als der von gesundem Knochengewebe. In-vivo-Studien zeigten die Zellinfiltration und die Ablagerung von extrazellulärer Matrix innerhalb der dezellularisierten Apfelgerüste nach 8-wöchiger Implantation in die Schädelknochen der Ratte. Darüber hinaus war die Kraft, die erforderlich war, um die Gerüste aus dem Knochendefekt zu entfernen, vergleichbar mit der zuvor berichteten Frakturbelastung des nativen Schädelknochens. Insgesamt bestätigt diese Studie, dass aus Äpfeln gewonnene Zellulose ein vielversprechender Kandidat für HdO-Anwendungen ist. Die Unähnlichkeit zwischen seinen mechanischen Eigenschaften und denen von gesundem Knochengewebe kann seine Anwendung jedoch auf Szenarien mit geringer Belastung beschränken. Zusätzliche strukturelle Umgestaltungen und Optimierungen können erforderlich sein, um die mechanischen Eigenschaften von aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten für tragende Anwendungen zu verbessern.

Introduction

Große Knochendefekte, die durch eine Verletzung oder Krankheit verursacht werden, erfordern oft Biomaterialtransplantate für eine vollständige Regeneration¹. Derzeitige Techniken zur Verbesserung der Regeneration von Knochengewebe verwenden regelmäßig autologe, allogene, xenogene oder synthetische Transplantate². Bei der autologen Knochentransplantation, die als “Goldstandard” zur Reparatur großer Knochendefekte gilt, wird dem Patienten Knochen entnommen. Dieses Transplantationsverfahren hat jedoch mehrere Nachteile, darunter Größen- und Formbeschränkungen, Gewebeverfügbarkeit und Morbidität an der Probenahmestelle³. Darüber hinaus sind autologe Transplantationsverfahren anfällig für Infektionen an der Operationsstelle, nachfolgende Frakturen, Hämatombildung an der Probenentnahme oder rekonstruierten Stelle und postoperative Schmerzen⁴. Das Bone Tissue Engineering (HdO) bietet eine potenzielle Alternative zu herkömmlichen Knochentransplantationsmethoden⁵. Es kombiniert strukturelle Biomaterialien und Zellen, um neues funktionelles Knochengewebe aufzubauen. Bei der Entwicklung von Biomaterialien für HdO ist es entscheidend, eine makroporöse Struktur, eine Oberflächenchemie, die die Zellanhaftung fördert, und mechanische Eigenschaften, die denen von nativem Knochen sehr ähnlich sind, zu kombinieren⁶. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass die ideale Porengröße und der ideale Elastizitätsmodul für Biomaterialien, die in HdO verwendet werden, etwa 100-200 μm⁷ bzw. 0,1-20 GPa betragen, abhängig von der Transplantationsstelle⁸. Darüber hinaus sind die Porosität und die Poreninterkonnektivität der Gerüste entscheidende Faktoren, die die Zellmigration, die Nährstoffdiffusion und die Angiogenese beeinflussen⁸.

HdO hat vielversprechende Ergebnisse mit verschiedenen Biomaterialien gezeigt, die als Alternative zu Knochentransplantaten entwickelt und bewertet wurden. Einige dieser Biomaterialien sind osteoinduktive Materialien, Hybridmaterialien und fortschrittliche Hydrogele⁸. Osteoinduktive Materialien stimulieren die Entwicklung neu gebildeter Knochenstrukturen. Hybridmaterialien bestehen aus synthetischen und/oder natürlichen Polymeren⁸. Fortschrittliche Hydrogele ahmen die extrazelluläre Matrix (EZM) nach und sind in der Lage, die notwendigen bioaktiven Faktoren zur Förderung der Integration von Knochengewebe zu liefern⁸. Hydroxylapatit ist ein traditionelles Material und aufgrund seiner Zusammensetzung und Biokompatibilität eine gängige Wahl für HdO⁹. Bioaktives Glas ist eine weitere Art von Biomaterial für HdO, von dem gezeigt wurde, dass es spezifische Zellantworten stimuliert, um Gene zu aktivieren, die für die Osteogenese notwendig sind^10,11. Biologisch abbaubare Polymere, einschließlich Polyglykolsäure und Polymilchsäure, werden ebenfalls in großem Umfang in HdO-Anwendungen eingesetzt¹². Schließlich haben auch natürliche oder natürlich gewonnene Polymere wie Chitosan, Chitin und bakterielle Zellulose ermutigende Ergebnisse für HdO¹³ gezeigt. Während jedoch sowohl synthetische als auch natürliche Polymere Potenzial für HdO aufweisen, erfordert die Entwicklung eines funktionellen Gerüsts mit der gewünschten Makrostruktur in der Regel umfangreiche Protokolle.

Umgekehrt können native makroskopische Zellulosestrukturen leicht aus verschiedenen Pflanzen abgeleitet werden, und unsere Forschungsgruppe hat bereits die Anwendbarkeit von zellulosebasierten Scaffolds aus Pflanzen auf verschiedene Geweberekonstruktionen gezeigt. In der Tat haben wir uns nach einer einfachen Tensidbehandlung die inhärente Struktur des Pflanzenmaterials zunutze gemacht und sein Potenzial als vielseitiges Biomaterial hervorgehoben¹⁴. Darüber hinaus können diese Scaffolds auf Zellulosebasis für In-vitro-Anwendungen in Säugetierzellkulturen^{verwendet werden 14}, sind biokompatibel und unterstützen die spontane subkutane Vaskularisierung 14,15,16,17. Sowohl unsere Forschungsgruppe als auch andere haben gezeigt, dass diese Gerüste aus bestimmten Pflanzen gewonnen werden können, je nach beabsichtigter Anwendung 14,15,16,17,18,19,20. Zum Beispiel weist die in Pflanzenstängeln und -blättern beobachtete Gefäßstruktur eine auffallende Ähnlichkeit mit der Struktur auf, die in tierischen Geweben gefunden wurde¹⁹. Darüber hinaus können aus Pflanzen gewonnene Zellulosegerüste leicht geformt und biochemischen Oberflächenmodifikationen unterzogen werden, um die gewünschten Eigenschaften zu erreichen¹⁶. In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir während des Dezellularisierungsprozesses einen Salzpuffer eingebaut, was zu einer verstärkten Zelladhäsion führte, die sowohl in vitro als auch in vivo beobachtet wurde¹⁶. In der gleichen Studie haben wir die Anwendbarkeit von pflanzlichen Zellulosegerüsten in Verbundbiomaterialien nachgewiesen, indem wir Hydrogele auf die Oberfläche der Gerüste gegossen haben. In neueren Studien wurde gezeigt, dass die Funktionalisierung von pflanzlichen Scaffolds deren Wirksamkeit erhöht¹⁸. Eine Studie von Fontana et al. (2017) ergab beispielsweise, dass die Adhäsion menschlicher dermaler Fibroblasten durch RGD-beschichtete dezellularisierte Stängel unterstützt wurde, während unbeschichtete Stängel nicht die gleiche Fähigkeit aufwiesen¹⁸. Darüber hinaus zeigten die Autoren, dass modifizierte simulierte Körperflüssigkeit verwendet werden kann, um dezellularisierte Pflanzenstängel künstlich zu mineralisieren. In neueren Studien untersuchten wir das Konzept der mechanosensitiven Osteogenese in pflanzlichen Zellulosegerüsten und bewerteten ihr Potenzial für HdO ^17,20. Darüber hinaus verwendeten Lee et al. (2019) pflanzliche Gerüste, um knochenähnliches Gewebe in einer In-vitro-Umgebung zu kultivieren²¹. Durch umfassende Auswertungen verschiedener pflanzlicher Quellen identifizierten die Autoren aus Äpfeln gewonnene Gerüste als die optimalsten für die Kultivierung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs). Darüber hinaus schlugen die Autoren vor, dass die strukturellen und mechanischen Eigenschaften der aus Äpfeln gewonnenen Gerüste eine entscheidende Rolle für ihre Eignung für den beabsichtigten Zweck spielen. Als erste pflanzliche Gerüste, die in Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt wurden, wurde ausführlich gezeigt, dass aus Äpfeln gewonnene Scaffolds eine auffallend ähnliche Architektur wie menschliche Knochen besitzen, insbesondere in Bezug auf ihre miteinander verbundenen Poren mit einem Durchmesser von 100 bis 200 μm^14,21.

In der vorliegenden Studie untersuchten wir das Potenzial von aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten für HdO und führten eine Analyse ihrer mechanischen Eigenschaften sowohl in vitro als auch in vivo durch. Obwohl es Studien über das Potenzial von aus Äpfeln gewonnenen Gerüsten für HdO 17,20,21 gibt, wurden ihre mechanischen Eigenschaften nur unzureichend untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine Wildspread-Invasion und osteogene Differenzierung von MC3T3-E1-Präosteoblasten, die in Gerüsten ausgesät wurden, die 4 Wochen lang in Differenzierungsmedium kultiviert wurden. Der Elastizitätsmodul dieser Scaffolds betrug 192,0 ± 16,6 kPa und war damit signifikant höher als der der Blank-Scaffolds (Scaffolds ohne ausgesäte Zellen) (31,6 ± 4,8 kPa) und der zellbesiedelten Scaffolds, die in Nicht-Differenzierungsmedium kultiviert wurden (24,1 ± 8,8 kPa). Es sollte jedoch beachtet werden, dass der Elastizitätsmodul von gesundem menschlichem Knochengewebe typischerweise im Bereich von 0,1-2 GPa für trabekulären Knochen und etwa 15-20 GPa für kortikalen Knochen⁸ liegt. Nichtsdestotrotz schienen nach einer 8-wöchigen Implantation in einen Schädelkrebsdefekt bei Nagetieren die zellbesiedelten Gerüste gut in den umgebenden Knochen integriert zu sein, wie eine durchschnittliche Spitzenkraft von 113,6 N ± 18,2 N in Push-out-Tests zeigte, was der zuvor berichteten Frakturlast des nativen Schädelknochens ähnelt²². Insgesamt sind die Ergebnisse dieser Studie vielversprechend, insbesondere für nicht-tragende Anwendungen. Aus Äpfeln gewonnene Zellulosegerüste verfügen jedoch derzeit nicht über die notwendigen mechanischen Eigenschaften, um das umgebende Knochengewebe an einer Implantatstelle genau anzupassen. Folglich ist eine weitere Entwicklung erforderlich, um das volle Potenzial dieser Gerüste auszuschöpfen.

Protocol

Die Versuchsprotokolle wurden vom Tierschutzausschuss der Universität Ottawa geprüft und genehmigt. 1. Vorbereitung des Gerüsts McIntosh-Äpfel (Canada Fancy) mit einem Mandolinenhobel in 8 mm dicke Scheiben schneiden. Das Hypanthiumgewebe der Apfelscheiben in 5 mm x 5 mm große Quadrate schneiden. Die quadratischen Proben werden 2 Tage lang in 0,1%iges Natriumdodecylsulfat (SDS) gelegt. Waschen Sie die dezellularisierten Proben mit deionisiert…

Representative Results

Porengrößenmessung, Zellverteilung und In-vitro-Mineralisierung (Abbildung 1 und Abbildung 2)Die vollständige Entfernung der nativen zellulären Bestandteile der Apfelgewebegerüste wurde nach der Behandlung der Gerüste mit SDS und CaCl2 erreicht (Abbildung 1A). Die Scaffolds wiesen eine hochporöse Struktur auf, die mittels konfokaler Mikroskopie bestätigt wurde. Die Quantifizierung der…

Discussion

Mehrere In-vitro– und In-vivo-Studien haben die Biokompatibilität von pflanzlicher Cellulose und ihre potenzielle Verwendung im Tissue Engineering^{nachgewiesen 14,15,16,18,19,20}, insbesondere für die osteogene Differenzierung^20,21. Ziel der vorliege…

Materials

4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology