Децеллюляризованные каркасы, полученные из яблока, для инженерии костной ткани in vitro и in vivo
Summary
В этом исследовании мы подробно описываем методы децеллюляризации, физической характеристики, визуализации и имплантации in vivo биоматериалов растительного происхождения, а также методы посева и дифференцировки клеток в скаффолдах. Описанные методы позволяют оценить биоматериалы растительного происхождения для применения в инженерии костной ткани.
Abstract
Биоматериалы из целлюлозы растительного происхождения используются в различных приложениях тканевой инженерии. Исследования in vivo показали замечательную биосовместимость каркасов из целлюлозы, полученной из природных источников. Кроме того, эти каркасы обладают структурными характеристиками, которые имеют отношение к нескольким тканям, и они способствуют инвазии и пролиферации клеток млекопитающих. Недавние исследования с использованием децеллюляризованной ткани яблочного гипантия продемонстрировали сходство размера пор с размером пор трабекулярной кости, а также его способность эффективно поддерживать остеогенную дифференцировку. В настоящем исследовании также был изучен потенциал целлюлозных каркасов, полученных из яблок, для применения в инженерии костной ткани (BTE) и оценены их механические свойства in vitro и in vivo . Преостеобласты MC3T3-E1 были высеяны в целлюлозные каркасы, полученные из яблок, которые затем были оценены на предмет их остеогенного потенциала и механических свойств. Окрашивание щелочной фосфатазой и ализариновым красным S подтвердило остеогенную дифференцировку в скаффолдах, культивируемых в дифференцировочной среде. Гистологическое исследование показало обширную клеточную инвазию и минерализацию скаффолдов. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) выявила минеральные агрегаты на поверхности скаффолдов, а энергодисперсионная спектроскопия (ЭДС) подтвердила наличие фосфатных и кальциевых элементов. Однако, несмотря на значительное увеличение модуля Юнга после дифференцировки клеток, он оставался ниже, чем у здоровой костной ткани. Исследования in vivo показали клеточную инфильтрацию и отложение внеклеточного матрикса в децеллюляризованных каркасах, полученных из яблок, после 8 недель имплантации в кальварию крыс. Кроме того, сила, необходимая для удаления каркасов из костного дефекта, была аналогична ранее зарегистрированной нагрузке при переломе нативной пяточной кости. В целом, это исследование подтверждает, что целлюлоза, полученная из яблок, является многообещающим кандидатом для применения в заушных аппаратах. Тем не менее, несходство между его механическими свойствами и свойствами здоровой костной ткани может ограничить его применение сценариями с низкой нагрузкой. Для улучшения механических свойств целлюлозных лесов, полученных из яблок, может потребоваться дополнительная структурная реконструкция и оптимизация.
Introduction
Большие костные дефекты, вызванные травмой или заболеванием, часто требуют трансплантатов биоматериала для полной регенерации1. Современные методы, предназначенные для улучшения регенерации костной ткани, регулярно используют аутологичные, аллогенные, ксеногенные или синтетические трансплантаты2. Для аутологичной костной пластики, которая считается «золотым стандартом» трансплантации для исправления больших костных дефектов, кость извлекается у пациента. Тем не менее, эта процедура трансплантации имеет ряд недостатков, включая ограничения по размеру и форме, доступность тканей и заболеваемость в месте забора материала3. Кроме того, процедуры аутологичной трансплантации подвержены инфекциям в области хирургического вмешательства, последующим переломам, образованию гематомы в месте забора или реконструкции, а также послеоперационным болям4. Инженерия костной ткани (BTE) является потенциальной альтернативой традиционным методам костной пластики5. Он сочетает в себе структурные биоматериалы и клетки для построения новой функциональной костной ткани. При разработке биоматериалов для заушных аппаратов крайне важно сочетать макропористую структуру, химический состав поверхности, способствующий прикреплению клеток, и механические свойства, близкие к свойствам нативной кости6. Прошлые исследования показали, что идеальный размер пор и модуль упругости для биоматериалов, используемых в заушных материалах, составляют примерно 100-200мкм7 и 0,1-20 ГПа соответственно, в зависимости от места пересадки8. Кроме того, пористость и взаимосвязь пор каркасов являются критическими факторами, влияющими на миграцию клеток, диффузию питательных веществ и ангиогенез8.
BTE показала многообещающие результаты с различными биоматериалами, разработанными и оцененными в качестве альтернативы костным трансплантатам. Некоторые из этих биоматериалов являются остеоиндуктивными материалами, гибридными материалами и усовершенствованными гидрогелями8. Остеоиндуктивные материалы стимулируют развитие новообразованных костных структур. Гибридные материалы состоят из синтетических и/или природных полимеров8. Усовершенствованные гидрогели имитируют внеклеточный матрикс (ВКМ) и способны доставлять необходимые биологически активные факторы для содействия интеграции костной ткани8. Гидроксиапатит является традиционным материалом и распространенным выбором для заушных заушных аппаратов благодаря своему составу и биосовместимости9. Биоактивное стекло является еще одним типом биоматериала для БТЭ, который, как было показано, стимулирует специфические клеточные реакции для активации генов, необходимых для остеогенеза10,11. Биоразлагаемые полимеры, в том числе полигликолевая кислота и полимолочная кислота, также широко используются в заушных материалах12. Наконец, натуральные полимеры или полимеры природного происхождения, такие как хитозан, хитин и бактериальная целлюлоза, также продемонстрировали обнадеживающие результаты для BTE13. Однако, несмотря на то, что как синтетические, так и натуральные полимеры имеют потенциал для заушных слуховых аппаратов, разработка функционального каркаса с желаемой макроструктурой, как правило, требует обширных протоколов.
И наоборот, нативные макроскопические целлюлозные структуры могут быть легко получены из различных растений, и наша исследовательская группа ранее продемонстрировала применимость каркасов на основе целлюлозы, полученных из растений, для различных реконструкций тканей. Действительно, после простой обработки поверхностно-активным веществом мы использовали присущую растительному материалу структуру, подчеркнув его потенциал в качестве универсального биоматериала14. Кроме того, эти каркасы на основе целлюлозы могут быть использованы для применения в культуре клеток млекопитающих in vitro 14, являются биосовместимыми и поддерживают спонтанную подкожную васкуляризацию 14,15,16,17. Как наша исследовательская группа, так и другие продемонстрировали, что эти скаффолды могут быть получены из конкретных растений в зависимости от предполагаемого применения 14,15,16,17,18,19,20. Например, сосудистая структура, наблюдаемая в стеблях и листьях растений, обнаруживает поразительное сходство со структурой, обнаруженной в тканях животных19. Кроме того, целлюлозные каркасы, полученные из растений, могут быть легко сформированы и подвергнуты поверхностным биохимическим модификациям для достижения желаемых характеристик16. В недавнем исследовании мы включили солевой буфер во время процесса децеллюляризации, что привело к усилению прикрепления клеток, наблюдаемому как в условиях in vitro, так и in vivo 16. В этом же исследовании мы продемонстрировали применимость целлюлозных скаффолдов растительного происхождения в композитных биоматериалах путем отливки гидрогелей на поверхность скаффолдов. В недавних исследованиях было показано, что функционализация скаффолдов растительного происхождения повышает их эффективность18. Например, исследование, проведенное Fontana et al. (2017), показало, что адгезия дермальных фибробластов человека поддерживалась децеллюляризованными стеблями, покрытыми RGD, в то время как стебли без покрытия не проявляли такой способности18. Более того, авторы также продемонстрировали, что модифицированная смоделированная жидкость организма может быть использована для искусственной минерализации децеллюляризованных стеблей растений. В более поздних исследованиях мы изучили концепцию механочувствительного остеогенеза в целлюлозных скаффолдах растительного происхождения и оценили их потенциал для BTE17,20. Кроме того, Lee et al. (2019) использовали скаффолды растительного происхождения для культивирования костноподобных тканей в условиях in vitro 21. Проведя всестороннюю оценку различных растительных источников, авторы определили, что скаффолды, полученные из яблок, являются наиболее оптимальными для культивирования и дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК). Кроме того, авторы предположили, что структурные и механические характеристики лесов, полученных из яблок, играют ключевую роль в их пригодности для использования по назначению. Будучи первыми каркасами растительного происхождения, реализованными в приложениях тканевой инженерии, яблочные каркасы, как было показано, обладают поразительно похожей архитектурой на человеческую кость, особенно с точки зрения их взаимосвязанных пор размером от 100 до 200 мкм и диаметром14,21.
В настоящем исследовании мы дополнительно изучили потенциал целлюлозных скаффолдов из яблок для заушных ушей и провели анализ их механических свойств как in vitro, так и in vivo. Несмотря на то, что были проведены исследования потенциала яблочных скаффолдов для заушных ушных ушей 17,20,21, их механические свойства были недостаточно изучены. Результаты показали дикую инвазию и остеогенную дифференцировку преостеобластов MC3T3-E1, высеянных в каркасы, которые культивировали в дифференцировочной среде в течение 4 недель. Модуль Юнга этих скаффолдов составил 192,0 ± 16,6 кПа, что было значительно выше, чем у пустых скаффолдов (скаффолдов без засеянных клеток) (31,6 ± 4,8 кПа) и клеточных скаффолдов, культивируемых в недифференцированной среде (24,1 ± 8,8 кПа). Тем не менее, следует отметить, что модуль Юнга здоровой костной ткани человека обычно находится в диапазоне 0,1-2 ГПа для трабекулярной кости и примерно 15-20 ГПа для кортикальной кости8. Тем не менее, после 8-недельной имплантации в дефект головного мозга грызуна, засеянные клетками каркасы, по-видимому, были хорошо интегрированы в окружающую кость, о чем свидетельствует средняя пиковая сила 113,6 Н ± 18,2 Н в тестах на выталкивание, что аналогично ранее зарегистрированной нагрузке на перелом нативной пяточной кости22. В целом, результаты, полученные в ходе этого исследования, показывают значительные перспективы, особенно для приложений, не несущих нагрузки. Тем не менее, целлюлозные каркасы, полученные из яблок, в настоящее время не обладают необходимыми механическими свойствами для точного соответствия окружающей костной ткани в месте установки имплантата. Следовательно, требуется дальнейшая разработка, чтобы раскрыть весь потенциал этих лесов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несколько исследований in vitro и in vivo продемонстрировали биосовместимость целлюлозы растительного происхождения и ее потенциальное использование в тканевой инженерии 14,15,16,18,19,20, в частности, для проведения остеогенной дифференциации <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование этого проекта было предоставлено Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) (грант на открытие) и Фондом Ли Ка Шина. M.L.L. получил поддержку от программы Ontario Centers of Excellence TalentEdge, а R.J.H. получил стипендию для аспирантов NSERC и стипендию для выпускников Онтарио (OGS).
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
| 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium | Sigma-Aldrich | B5655 | BCIP/NBT |
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Cell Culture |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| Dental drill | Surgical tool | ||
| Ethanol | ThermoFisher | 615095000 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalin |
| Goldner's trichrome stain | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
| Hematoxylin and eosin stain | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
| High-speed resonant confocal laser scanning microscope | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Irrigation saline | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
| MC3T3-E1 Subclone 4 cells | ATCC | CRL-2593 | Pre-osteoblast cells |
| McIntosh apples | Canada Fancy grade | ||
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909 | Histological embedding |
| Minimum Essential Medium | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; without Ca2+ and Mg2+ |
| Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
| Slide scanner microscope | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
| Sodium metabisulphite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium phosphate | ThermoFisher | BP329 | |
| Sprague-Dawley rats | Charles-River Laboratories | 400 | Male |
| Sutures | Ethicon | J494G | 4-0 |
| Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm diameter |
| Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
| Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Cell Culture |
| Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
| Universal compression Device | CellScale | UniVert | |
| Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histology |
Riferimenti
- Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
- Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
- Parikh, S. N. Bone graft substitutes: Past, present, future. Journal of Postgraduate Medicine. 48 (2), 142-148 (2002).
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (6), 570-575 (2000).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
- Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30 (10), 546-554 (2012).
- Yoshikawa, H., Myoui, A. Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics. Journal of Artificial Organs. 8 (3), 131-136 (2005).
- Fu, Q., Saiz, E., Rahaman, M. N., Tomsia, A. P. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 31 (7), 1245-1256 (2011).
- Xynos, I. D., Edgar, A. J., Buttery, L. D. K., Hench, L. L., Polak, J. M. Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276 (2), 461-465 (2000).
- Kroeze, R., Helder, M., Govaert, L., Smit, T. Biodegradable polymers in bone tissue engineering. Materials. 2 (3), 833-856 (2009).
- Venkatesan, J., Vinodhini, P. A., Sudha, P. N. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration. Advances in Food and Nutrition Research. 73, 59-81 (2014).
- Modulevsky, D. J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z., Pelling, A. E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS One. 9 (5), e97835 (2014).
- Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Biocompatibility of subcutaneously implanted plant-derived cellulose biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
- Hickey, R. J., Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Customizing the shape and microenvironment biochemistry of biocompatible macroscopic plant-derived cellulose scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3726-3736 (2018).
- Hickey, R. J., Leblanc Latour, M., Harden, J. L., Pelling, A. E. Designer scaffolds for interfacial bioengineering. Advanced Engineering Materials. 25, 2201415 (2023).
- Fontana, G., et al. Biofunctionalized plants as diverse biomaterials for human cell culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601225 (2017).
- Gershlak, J. R., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
- Leblanc Latour, M., Pelling, A. E. Mechanosensitive osteogenesis on native cellulose scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics. 135, 111030 (2022).
- Lee, J., Jung, H., Park, N., Park, S. H., Ju, J. H. Induced osteogenesis in plants decellularized scaffolds. Scientific Reports. 9 (1), 20194 (2019).
- Zhao, J., et al. Enhanced healing of rat calvarial defects with sulfated chitosan-coated calcium-deficient hydroxyapatite/bone morphogenetic protein 2 scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 18 (1-2), 185-197 (2012).
- Murtey, M. D., Ramasamy, P. . Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy – Life Sciences. In: Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , 161-186 (2016).
- . . tousimis Critical Point Dryers – Samdri®-PVT-3D. , (2022).
- . . Leica EM ACE200 Vacuum Coater. , (2023).
- Spicer, P. P. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nature Protocols. 7 (10), 1918-1929 (2012).
- Leblanc Latour, M. . Cellulose biomaterials for bone tissue engineering [dissertation]. , (2023).
- Kodama, H. -. A., Amagai, Y., Sudo, H., Kasai, S., Yamamoto, S. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Japanese Journal of Oral Biology. 23 (4), 899-901 (1981).
- Wang, D., et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (6), 893-903 (1999).
- Addison, W. N., et al. Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone. 71, 244-256 (2015).
- Heary, R. F., Parvathreddy, N., Sampath, S., Agarwal, N. Elastic modulus in the selection of interbody implants. Journal of Spine Surgery. 3 (2), 163-167 (2017).
- Lawson, Z. T., et al. Methodology for performing biomechanical push-out tests for evaluating the osseointegration of calvarial defect repair in small animal models. MethodsX. 8, 101541 (2021).
