Échafaudages décellularisés dérivés de la pomme pour l’ingénierie des tissus osseux in vitro et in vivo

Summary

Dans cette étude, nous détaillons les méthodes de décellularisation, de caractérisation physique, d’imagerie et d’implantation in vivo de biomatériaux d’origine végétale, ainsi que les méthodes d’ensemencement et de différenciation cellulaire dans les échafaudages. Les méthodes décrites permettent l’évaluation de biomatériaux d’origine végétale pour des applications d’ingénierie du tissu osseux.

Abstract

Les biomatériaux cellulosiques d’origine végétale ont été utilisés dans diverses applications d’ingénierie tissulaire. Des études in vivo ont montré la biocompatibilité remarquable des échafaudages en cellulose dérivée de sources naturelles. De plus, ces échafaudages possèdent des caractéristiques structurelles pertinentes pour de multiples tissus, et ils favorisent l’invasion et la prolifération des cellules de mammifères. Des recherches récentes utilisant du tissu d’hypanthium de pomme décellularisé ont démontré la similitude de la taille de ses pores avec celle de l’os trabéculaire ainsi que sa capacité à soutenir efficacement la différenciation ostéogénique. La présente étude a également examiné le potentiel des échafaudages en cellulose dérivés de la pomme pour les applications d’ingénierie du tissu osseux (BTE) et a évalué leurs propriétés mécaniques in vitro et in vivo . Les préostéoblastes MC3T3-E1 ont été ensemencés dans des échafaudages de cellulose dérivés de pommes qui ont ensuite été évalués pour leur potentiel ostéogénique et leurs propriétés mécaniques. La coloration de la phosphatase alcaline et du rouge d’alizarine S a confirmé la différenciation ostéogénique dans les échafaudages cultivés en milieu de différenciation. L’examen histologique a mis en évidence une invasion cellulaire et une minéralisation généralisées à travers les échafaudages. La microscopie électronique à balayage (MEB) a révélé la présence d’agrégats minéraux à la surface des échafaudages, et la spectroscopie à dispersion d’énergie (EDS) a confirmé la présence d’éléments phosphate et calcique. Cependant, malgré une augmentation significative du module de Young suite à la différenciation cellulaire, il est resté inférieur à celui du tissu osseux sain. Des études in vivo ont montré l’infiltration cellulaire et le dépôt de matrice extracellulaire dans les échafaudages décellularisés dérivés de la pomme après 8 semaines d’implantation dans la calvaria de rat. De plus, la force requise pour retirer les échafaudages du défaut osseux était similaire à la charge de fracture précédemment rapportée de l’os calvaire natif. Dans l’ensemble, cette étude confirme que la cellulose dérivée de la pomme est un candidat prometteur pour les applications de contours d’oreille. Cependant, la dissemblance entre ses propriétés mécaniques et celles du tissu osseux sain peut limiter son application à des scénarios à faible portance. Une réingénierie et une optimisation structurelles supplémentaires peuvent être nécessaires pour améliorer les propriétés mécaniques des échafaudages en cellulose dérivés de la pomme pour les applications porteuses.

Introduction

Les gros défauts osseux causés par une blessure ou une maladie nécessitent souvent des greffes de biomatériaux pour une régénération complète¹. Les techniques actuelles visant à améliorer la régénération du tissu osseux utilisent régulièrement des greffes autologues, allogéniques, xénogéniques ou synthétiques². Pour la greffe osseuse autologue, considérée comme la pratique de greffe « de référence » pour réparer les grands défauts osseux, l’os est extrait du patient. Cependant, cette procédure de greffe présente plusieurs inconvénients, notamment des limites de taille et de forme, la disponibilité des tissus et la morbidité du site d’échantillonnage³. De plus, les procédures de greffe autologue sont sensibles aux infections du site chirurgical, aux fractures ultérieures, à la formation d’hématome au niveau du site de prélèvement ou de reconstruction et à la douleur postopératoire⁴. L’ingénierie du tissu osseux (BTE) offre une alternative potentielle aux méthodes conventionnelles de greffe osseuse⁵. Il combine des biomatériaux structurels et des cellules pour construire de nouveaux tissus osseux fonctionnels. Lors de la conception de biomatériaux pour le contour d’oreille, il est essentiel de combiner une structure macroporeuse, une chimie de surface qui favorise la fixation cellulaire et des propriétés mécaniques qui ressemblent beaucoup à celles de l’os natif⁶. Des recherches antérieures ont indiqué que la taille idéale des pores et le module d’élasticité pour les biomatériaux utilisés dans les contours d’oreille sont d’environ 100 à 200 μm⁷ et 0,1 à 20 GPa, respectivement, selon le site de greffe⁸. En outre, la porosité et l’interconnectivité des pores des échafaudages sont des facteurs critiques affectant la migration cellulaire, la diffusion des nutriments et l’angiogenèse⁸.

Le contour d’oreille a montré des résultats prometteurs avec divers biomatériaux développés et évalués comme options alternatives aux greffes osseuses. Certains de ces biomatériaux sont des matériaux ostéo-inductifs, des matériaux hybrides et des hydrogels avancés⁸. Les matériaux ostéoinductifs stimulent le développement des structures osseuses nouvellement formées. Les matériaux hybrides sont composés de polymères synthétiques et/ou naturels⁸. Les hydrogels avancés imitent la matrice extracellulaire (MEC) et sont capables de fournir les facteurs bioactifs nécessaires pour favoriser l’intégration du tissu osseux⁸. L’hydroxyapatite est un matériau traditionnel et un choix courant pour les contours d’oreille en raison de sa composition et de sa biocompatibilité⁹. Le verre bioactif est un autre type de biomatériau pour les contours d’oreille, dont il a été démontré qu’il stimule des réponses cellulaires spécifiques pour activer les gènes nécessaires à l’ostéogenèse^10,11. Les polymères biodégradables, y compris l’acide poly(glycolique) et l’acide poly(lactique), ont également été largement utilisés dans les applications de contours d’oreille¹². Enfin, les polymères naturels ou d’origine naturelle comme le chitosane, la chitine et la cellulose bactérienne ont également démontré des résultats encourageants pour le BTE¹³. Cependant, bien que les polymères synthétiques et naturels présentent un potentiel pour les contours d’oreille, le développement d’un échafaudage fonctionnel avec la macrostructure souhaitée nécessite généralement des protocoles étendus.

À l’inverse, les structures macroscopiques de cellulose native peuvent être facilement dérivées de diverses plantes et notre groupe de recherche a précédemment démontré l’applicabilité des échafaudages à base de cellulose dérivés de plantes à différentes reconstructions tissulaires. En effet, à la suite d’un simple traitement tensioactif, nous avons exploité la structure inhérente de la matière végétale, mettant en évidence son potentiel en tant que biomatériau polyvalent¹⁴. De plus, ces échafaudages à base de cellulose peuvent être utilisés pour des applications in vitro de culture cellulaire de mammifères¹⁴, sont biocompatibles et favorisent la vascularisation sous-cutanée spontanée 14,15,16,17. Notre groupe de recherche et d’autres ont démontré que ces échafaudages peuvent être obtenus à partir de plantes spécifiques en fonction de l’application prévue 14,15,16,17,18,19,20. Par exemple, la structure vasculaire observée dans les tiges et les feuilles des plantes présente une similitude frappante avec la structure trouvée dans les tissus animaux¹⁹. De plus, les échafaudages en cellulose dérivés de plantes peuvent être facilement façonnés et soumis à des modifications biochimiques de surface pour obtenir les caractéristiques souhaitées¹⁶. Dans une étude récente, nous avons incorporé un tampon salin pendant le processus de décellularisation, ce qui a conduit à une meilleure fixation cellulaire observée à la fois in vitro et in vivo ¹⁶. Dans la même étude, nous avons démontré l’applicabilité des échafaudages cellulosiques d’origine végétale dans les biomatériaux composites en coulant des hydrogels sur la surface des échafaudages. Dans des études récentes, il a été démontré que la fonctionnalisation d’échafaudages d’origine végétale améliore leur efficacité¹⁸. Par exemple, une étude menée par Fontana et al. (2017) a révélé que l’adhésion des fibroblastes dermiques humains était soutenue par des tiges décellularisées enrobées de RGD, alors que les tiges non enrobées ne présentaient pas la même capacité¹⁸. De plus, les auteurs ont également démontré que des fluides corporels simulés modifiés pouvaient être utilisés pour minéraliser artificiellement les tiges de plantes décellularisées. Dans des études plus récentes, nous avons exploré le concept d’ostéogenèse mécanosensible dans les échafaudages cellulosiques d’origine végétale et évalué leur potentiel pour le contour d’oreille^17,20. De plus, Lee et al. (2019) ont utilisé des échafaudages d’origine végétale pour cultiver des tissus osseux dans un environnement in vitro ²¹. Grâce à des évaluations complètes de différentes sources végétales, les auteurs ont identifié les échafaudages dérivés de la pomme comme les plus optimaux pour la culture et la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). De plus, les auteurs ont proposé que les caractéristiques structurelles et mécaniques des échafaudages dérivés de la pomme jouent un rôle central dans leur adéquation à l’usage prévu. En tant que premiers échafaudages d’origine végétale mis en œuvre dans des applications d’ingénierie tissulaire, il a été largement démontré que les échafaudages dérivés de la pomme possèdent une architecture étonnamment similaire à celle de l’os humain, notamment en termes de pores interconnectés allant de 100 à 200 μm de diamètre^14,21.

Dans la présente étude, nous avons étudié plus en détail le potentiel des échafaudages en cellulose dérivés de la pomme pour les contours d’oreille et avons effectué une analyse de leurs propriétés mécaniques in vitro et in vivo. Bien qu’il y ait eu des études sur le potentiel des échafaudages dérivés de la pomme pour les contours d’oreille 17,20,21, leurs propriétés mécaniques ont été sous-étudiées. Les résultats ont montré une invasion sauvage et une différenciation ostéogénique des préostéoblastes MC3T3-E1 ensemencés dans des échafaudages qui ont été cultivés dans un milieu de différenciation pendant 4 semaines. Le module de Young de ces échafaudages était de 192,0 ± 16,6 kPa, ce qui était significativement plus élevé que ceux des échafaudages vierges (échafaudages sans cellules ensemencées) (31,6 ± 4,8 kPa) et des échafaudages à ensemencement cellulaire cultivés en milieu non différencié (24,1 ± 8,8 kPa). Cependant, il convient de noter que le module de Young du tissu osseux humain sain se situe généralement dans la plage de 0,1 à 2 GPa pour l’os trabéculaire et d’environ 15 à 20 GPa pour l’os cortical⁸. Néanmoins, après une implantation de 8 semaines dans un défaut calvaire de rongeur, les échafaudages ensemencés de cellules semblaient bien intégrés dans l’os environnant, comme le démontre une force maximale moyenne de 113,6 N ± 18,2 N dans les tests de poussée, ce qui est similaire à la charge de fracture précédemment rapportée de l’os calvaire natif²². Dans l’ensemble, les résultats obtenus dans le cadre de cette étude sont très prometteurs, en particulier pour les applications non porteuses. Cependant, les échafaudages en cellulose dérivés de la pomme ne possèdent pas actuellement les propriétés mécaniques nécessaires pour correspondre précisément au tissu osseux environnant sur un site d’implantation. Par conséquent, un développement supplémentaire est nécessaire pour libérer tout le potentiel de ces échafaudages.

Protocol

Les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux de l’Université d’Ottawa. 1. Préparation de l’échafaudage À l’aide d’une mandoline, couper les pommes McIntosh (Canada Fancy) en tranches de 8 mm d’épaisseur. Coupez le tissu hypanthium des tranches de pomme en carrés de 5 mm x 5 mm. Placez les échantillons carrés dans du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,1 % pendant 2 jours. …

Representative Results

Mesure de la taille des pores, de la distribution cellulaire et de la minéralisation in vitro (Figure 1 et Figure 2)L’élimination complète des composants cellulaires natifs des échafaudages de tissus de pommier a été obtenue après le traitement des échafaudages avec du SDS et du CaCl2 (figure 1A). Les échafaudages présentaient une structure très poreuse, ce qui a été confirmé …

Discussion

Plusieurs études in vitro et in vivo ont démontré la biocompatibilité de la cellulose d’origine végétale et son utilisation potentielle en ingénierie tissulaire 14,15,16,18,19,20, plus particulièrement pour la différenciation ostéogénique de l’hôte ^20,21<su…

Materials

4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology