Andamios descelularizados derivados de la manzana para la ingeniería de tejidos óseos in vitro e in vivo
Summary
En este estudio, detallamos métodos de descelularización, caracterización física, imagen e implantación in vivo de biomateriales de origen vegetal, así como métodos para la siembra y diferenciación celular en los andamios. Los métodos descritos permiten la evaluación de biomateriales de origen vegetal para aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos.
Abstract
Los biomateriales de celulosa de origen vegetal se han empleado en diversas aplicaciones de ingeniería de tejidos. Los estudios in vivo han demostrado la notable biocompatibilidad de los andamios hechos de celulosa derivada de fuentes naturales. Además, estos andamios poseen características estructurales que son relevantes para múltiples tejidos, y promueven la invasión y proliferación de células de mamíferos. Investigaciones recientes con tejido de hipantio de manzana descelularizado han demostrado la similitud de su tamaño de poro con el del hueso trabecular, así como su capacidad para apoyar eficazmente la diferenciación osteogénica. El presente estudio examinó más a fondo el potencial de los andamios de celulosa derivados de la manzana para aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos (BTE) y evaluó sus propiedades mecánicas in vitro e in vivo . Los preosteoblastos MC3T3-E1 se sembraron en andamios de celulosa derivados de manzanas que luego se evaluaron por su potencial osteogénico y propiedades mecánicas. La tinción con fosfatasa alcalina y rojo de alizarina S confirmó la diferenciación osteogénica en andamios cultivados en medio de diferenciación. El examen histológico demostró una invasión celular generalizada y mineralización a través de los andamios. La microscopía electrónica de barrido (SEM) reveló agregados minerales en la superficie de los andamios, y la espectroscopia de dispersión de energía (EDS) confirmó la presencia de elementos fosfato y calcio. Sin embargo, a pesar de un aumento significativo en el módulo de Young después de la diferenciación celular, se mantuvo más bajo que el del tejido óseo sano. Los estudios in vivo mostraron la infiltración celular y el depósito de matriz extracelular dentro de los andamios derivados de manzanas descelularizados después de 8 semanas de implantación en calvaria de rata. Además, la fuerza requerida para retirar los andamios del defecto óseo fue similar a la carga de fractura previamente reportada del hueso nativo de la pantorrilla. En general, este estudio confirma que la celulosa derivada de la manzana es una candidata prometedora para las aplicaciones de BTE. Sin embargo, la disimilitud entre sus propiedades mecánicas y las del tejido óseo sano puede restringir su aplicación a escenarios de baja carga. Es posible que sea necesaria una reingeniería y optimización estructural adicional para mejorar las propiedades mecánicas de los andamios de celulosa derivados de la manzana para aplicaciones de carga.
Introduction
Los defectos óseos grandes causados por una lesión o enfermedad a menudo requieren injertos de biomaterial para unaregeneración completa. Las técnicas actuales diseñadas para mejorar la regeneración del tejido óseo utilizan regularmente injertos autólogos, alogénicos, xenogénicos o sintéticos2. Para el injerto óseo autólogo, considerado la práctica de injerto “estándar de oro” para reparar defectos óseos grandes, el hueso se extrae del paciente. Sin embargo, este procedimiento de injerto tiene varios inconvenientes, como las limitaciones de tamaño y forma, la disponibilidad de tejido y la morbilidad del sitio de muestreo3. Además, los procedimientos de injerto autólogo son susceptibles a infecciones del sitio quirúrgico, fracturas posteriores, formación de hematomas en el sitio de muestreo o reconstruido y dolor postoperatorio4. La ingeniería de tejidos óseos (BTE) ofrece una alternativa potencial a los métodos convencionales de injerto óseo5. Combina biomateriales estructurales y células para construir nuevo tejido óseo funcional. Al diseñar biomateriales para BTE, es fundamental combinar una estructura macroporosa, una química de superficie que promueva la adhesión celular y propiedades mecánicas que se asemejen mucho a las del hueso nativo6. Investigaciones anteriores han indicado que el tamaño de poro ideal y el módulo elástico para los biomateriales utilizados en BTE son aproximadamente 100-200 μm7 y 0,1-20 GPa, respectivamente, dependiendo del sitio de injerto8. Además, la porosidad y la interconectividad de poros de los andamios son factores críticos que afectan la migración celular, la difusión de nutrientes y la angiogénesis8.
El BTE ha mostrado resultados prometedores con diversos biomateriales desarrollados y evaluados como opciones alternativas a los injertos óseos. Algunos de estos biomateriales son materiales osteoinductivos, materiales híbridos e hidrogeles avanzados8. Los materiales osteoinductivos estimulan el desarrollo de estructuras óseas recién formadas. Los materiales híbridos están compuestos de polímeros sintéticos y/o naturales8. Los hidrogeles avanzados imitan la matriz extracelular (MEC) y son capaces de suministrar los factores bioactivos necesarios para promover la integración del tejido óseo8. La hidroxiapatita es un material tradicional y una opción común para el BTE debido a su composición y biocompatibilidad9. El vidrio bioactivo es otro tipo de biomaterial para la BTE, que ha demostrado estimular respuestas celulares específicas para activar genes necesarios para la osteogénesis10,11. Los polímeros biodegradables, incluidos el poli(ácido glicólico) y el poli(ácido láctico), también se han utilizado ampliamente en aplicaciones de EEB12. Por último, los polímeros naturales o de origen natural como el quitosano, la quitina y la celulosa bacteriana también han demostrado resultados alentadores para el BTE13. Sin embargo, si bien tanto los polímeros sintéticos como los naturales muestran potencial para BTE, el desarrollo de un andamio funcional con la macroestructura deseada generalmente requiere protocolos extensos.
Por el contrario, las estructuras macroscópicas nativas de celulosa se pueden derivar fácilmente de diversas plantas y nuestro grupo de investigación demostró previamente la aplicabilidad de andamios basados en celulosa derivados de plantas a diferentes reconstrucciones de tejidos. De hecho, después de un simple tratamiento con tensioactivo, aprovechamos la estructura inherente del material vegetal, destacando su potencial como biomaterial versátil14. Además, estos andamios a base de celulosa pueden utilizarse para aplicaciones de cultivo de células de mamíferos in vitro 14, son biocompatibles y favorecen la vascularización subcutánea espontánea 14,15,16,17. Tanto nuestro grupo de investigación como otros han demostrado que estos andamios pueden obtenerse a partir de plantas específicas en función de la aplicación prevista 14,15,16,17,18,19,20. Por ejemplo, la estructura vascular observada en los tallos y hojas de las plantas exhibe una sorprendente similitud con la estructura encontrada en los tejidos animales19. Además, los andamios de celulosa derivados de plantas pueden moldearse fácilmente y someterse a modificaciones bioquímicas superficiales para lograr las características deseadas16. En un estudio reciente, incorporamos un tampón de sal durante el proceso de descelularización, lo que condujo a una mejor adhesión celular observada tanto in vitro como in vivo 16. En el mismo estudio, demostramos la aplicabilidad de andamios de celulosa de origen vegetal en biomateriales compuestos mediante la fundición de hidrogeles sobre la superficie de los andamios. En estudios recientes, se ha demostrado que la funcionalización de andamios derivados de plantas mejora su eficacia18. Por ejemplo, un estudio realizado por Fontana et al. (2017) reveló que la adhesión de los fibroblastos dérmicos humanos estaba respaldada por tallos descelularizados recubiertos de RGD, mientras que los tallos no recubiertos no exhibían la misma capacidad18. Además, los autores también demostraron que los fluidos corporales simulados modificados podrían utilizarse para mineralizar artificialmente tallos de plantas descelularizados. En estudios más recientes, exploramos el concepto de osteogénesis mecanosensible en andamios de celulosa derivados de plantas y evaluamos su potencial para BTE17,20. Además, Lee et al. (2019) utilizaron andamios derivados de plantas para cultivar tejidos similares a los huesos en un entorno in vitro 21. A través de evaluaciones exhaustivas de diferentes fuentes vegetales, los autores identificaron los andamios derivados de la manzana como los más óptimos para el cultivo y la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC). Además, los autores propusieron que los atributos estructurales y mecánicos de los andamios derivados de la manzana desempeñan un papel fundamental en su idoneidad para el propósito previsto. Al ser los andamios iniciales derivados de plantas implementados en aplicaciones de ingeniería de tejidos, se ha demostrado ampliamente que los andamios derivados de manzanas poseen una arquitectura sorprendentemente similar a la del hueso humano, especialmente en términos de sus poros interconectados que van de 100 a 200 μm de diámetro 14,21.
En el presente estudio, investigamos más a fondo el potencial de los andamios de celulosa derivados de la manzana para el BTE y realizamos un análisis de sus propiedades mecánicas tanto in vitro como in vivo. Aunque se han realizado estudios sobre el potencial de los andamios derivados de la manzana para la BTE 17,20,21, sus propiedades mecánicas han sido poco investigadas. Los resultados mostraron invasión silvestre y diferenciación osteogénica de preosteoblastos MC3T3-E1 sembrados en andamios que se cultivaron en medio de diferenciación durante 4 semanas. El módulo de Young de estos andamios fue de 192,0 ± 16,6 kPa, que fue significativamente mayor que el de los andamios en blanco (andamios sin células sembradas) (31,6 ± 4,8 kPa) y los andamios sembrados en células cultivados en medio de no diferenciación (24,1 ± 8,8 kPa). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el módulo de Young del tejido óseo humano sano suele estar dentro del rango de 0,1-2 GPa para el hueso trabecular y aproximadamente 15-20 GPa para el hueso cortical8. Sin embargo, después de una implantación de 8 semanas en un defecto de la pantorrilla de roedores, los andamios sembrados con células parecían estar bien integrados en el hueso circundante, como lo demuestra una fuerza máxima promedio de 113,6 N ± 18,2 N en las pruebas de empuje, que es similar a la carga de fractura previamente reportada del hueso nativo de la pantorrilla22. En general, los resultados obtenidos de este estudio son muy prometedores, especialmente para aplicaciones no portantes. Sin embargo, los andamios de celulosa derivados de la manzana no poseen actualmente las propiedades mecánicas necesarias para adaptarse con precisión al tejido óseo circundante en el sitio del implante. En consecuencia, se requiere un mayor desarrollo para liberar todo el potencial de estos andamios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varios estudios in vitro e in vivo han demostrado la biocompatibilidad de la celulosa de origen vegetal y su potencial uso en ingeniería de tejidos 14,15,16,18,19,20, más específicamente para albergar la diferenciación osteogénica 20,21. Los obj…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación de este proyecto fue proporcionada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) (Discovery Grant) y por la Fundación Li Ka Shing. M.L.L. recibió apoyo del programa TalentEdge de los Centros de Excelencia de Ontario, y R.J.H. recibió el apoyo de una beca de posgrado de NSERC y una beca de posgrado de Ontario (OGS).
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
| 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium | Sigma-Aldrich | B5655 | BCIP/NBT |
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Cell Culture |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| Dental drill | Surgical tool | ||
| Ethanol | ThermoFisher | 615095000 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalin |
| Goldner's trichrome stain | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
| Hematoxylin and eosin stain | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
| High-speed resonant confocal laser scanning microscope | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Irrigation saline | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
| MC3T3-E1 Subclone 4 cells | ATCC | CRL-2593 | Pre-osteoblast cells |
| McIntosh apples | Canada Fancy grade | ||
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909 | Histological embedding |
| Minimum Essential Medium | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; without Ca2+ and Mg2+ |
| Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
| Slide scanner microscope | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
| Sodium metabisulphite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium phosphate | ThermoFisher | BP329 | |
| Sprague-Dawley rats | Charles-River Laboratories | 400 | Male |
| Sutures | Ethicon | J494G | 4-0 |
| Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm diameter |
| Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
| Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Cell Culture |
| Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
| Universal compression Device | CellScale | UniVert | |
| Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histology |
Riferimenti
- Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
- Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
- Parikh, S. N. Bone graft substitutes: Past, present, future. Journal of Postgraduate Medicine. 48 (2), 142-148 (2002).
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (6), 570-575 (2000).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
- Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30 (10), 546-554 (2012).
- Yoshikawa, H., Myoui, A. Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics. Journal of Artificial Organs. 8 (3), 131-136 (2005).
- Fu, Q., Saiz, E., Rahaman, M. N., Tomsia, A. P. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 31 (7), 1245-1256 (2011).
- Xynos, I. D., Edgar, A. J., Buttery, L. D. K., Hench, L. L., Polak, J. M. Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276 (2), 461-465 (2000).
- Kroeze, R., Helder, M., Govaert, L., Smit, T. Biodegradable polymers in bone tissue engineering. Materials. 2 (3), 833-856 (2009).
- Venkatesan, J., Vinodhini, P. A., Sudha, P. N. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration. Advances in Food and Nutrition Research. 73, 59-81 (2014).
- Modulevsky, D. J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z., Pelling, A. E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS One. 9 (5), e97835 (2014).
- Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Biocompatibility of subcutaneously implanted plant-derived cellulose biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
- Hickey, R. J., Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Customizing the shape and microenvironment biochemistry of biocompatible macroscopic plant-derived cellulose scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3726-3736 (2018).
- Hickey, R. J., Leblanc Latour, M., Harden, J. L., Pelling, A. E. Designer scaffolds for interfacial bioengineering. Advanced Engineering Materials. 25, 2201415 (2023).
- Fontana, G., et al. Biofunctionalized plants as diverse biomaterials for human cell culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601225 (2017).
- Gershlak, J. R., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
- Leblanc Latour, M., Pelling, A. E. Mechanosensitive osteogenesis on native cellulose scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics. 135, 111030 (2022).
- Lee, J., Jung, H., Park, N., Park, S. H., Ju, J. H. Induced osteogenesis in plants decellularized scaffolds. Scientific Reports. 9 (1), 20194 (2019).
- Zhao, J., et al. Enhanced healing of rat calvarial defects with sulfated chitosan-coated calcium-deficient hydroxyapatite/bone morphogenetic protein 2 scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 18 (1-2), 185-197 (2012).
- Murtey, M. D., Ramasamy, P. . Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy – Life Sciences. In: Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , 161-186 (2016).
- . . tousimis Critical Point Dryers – Samdri®-PVT-3D. , (2022).
- . . Leica EM ACE200 Vacuum Coater. , (2023).
- Spicer, P. P. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nature Protocols. 7 (10), 1918-1929 (2012).
- Leblanc Latour, M. . Cellulose biomaterials for bone tissue engineering [dissertation]. , (2023).
- Kodama, H. -. A., Amagai, Y., Sudo, H., Kasai, S., Yamamoto, S. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Japanese Journal of Oral Biology. 23 (4), 899-901 (1981).
- Wang, D., et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (6), 893-903 (1999).
- Addison, W. N., et al. Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone. 71, 244-256 (2015).
- Heary, R. F., Parvathreddy, N., Sampath, S., Agarwal, N. Elastic modulus in the selection of interbody implants. Journal of Spine Surgery. 3 (2), 163-167 (2017).
- Lawson, Z. T., et al. Methodology for performing biomechanical push-out tests for evaluating the osseointegration of calvarial defect repair in small animal models. MethodsX. 8, 101541 (2021).
