뼈 조직 엔지니어링을 위한 탈세포화된 사과 유래 스캐폴드 , In Vitro 및 In Vivo
Summary
이 연구에서는 식물 기반 생체 재료의 탈세포화, 물리적 특성화, 이미징 및 생체 내 이식 방법과 스캐폴드의 세포 파종 및 분화 방법을 자세히 설명합니다. 설명된 방법을 통해 뼈 조직 공학 응용 분야를 위한 식물 기반 생체 재료를 평가할 수 있습니다.
Abstract
식물 유래 셀룰로오스 생체 재료는 다양한 조직 공학 응용 분야에 사용되어 왔습니다. 생체 내 연구는 천연 공급원에서 추출한 셀룰로오스로 만든 스캐폴드의 놀라운 생체 적합성을 보여주었습니다. 또한 이러한 지지체는 여러 조직과 관련된 구조적 특성을 가지고 있으며 포유류 세포의 침입 및 증식을 촉진합니다. 탈세포화된 사과 히판티움 조직을 사용한 최근 연구는 공극 크기가 섬유주 뼈의 기공 크기와 유사할 뿐만 아니라 골형성 분화를 효과적으로 지원하는 능력을 입증했습니다. 본 연구는 뼈 조직 공학(BTE) 응용 분야를 위한 사과 유래 셀룰로오스 지지체의 잠재력을 추가로 조사하고 시험관 내 및 생체 내 기계적 특성을 평가했습니다. MC3T3-E1 전골아세포를 사과 유래 셀룰로오스 스캐폴드에 파종한 후 골형성 잠재력과 기계적 특성을 평가했습니다. 알칼리성 포스파타제 및 alizarin red S 염색은 분화 배지에서 배양된 스캐폴드에서 골형성 분화를 확인했습니다. 조직학적 검사는 골격 전체에 걸쳐 광범위한 세포 침입과 광물화를 보여주었습니다. 주사전자현미경(SEM)을 통해 스캐폴드 표면에 광물 응집체가 발견되었고, 에너지 분산 분광법(EDS)을 통해 인산염과 칼슘 원소의 존재가 확인되었습니다. 그러나 세포 분화에 따른 영률(Young’s modulus)이 크게 증가했음에도 불구하고 건강한 뼈 조직보다 낮게 유지되었습니다. 생체 내 연구에서는 쥐 calvaria에 8주 동안 이식한 후 탈세포화된 사과 유래 지지체 내에서 세포 침투 및 세포외 기질의 침착을 보여주었습니다. 또한, 뼈 결손에서 지지체를 제거하는 데 필요한 힘은 이전에 보고된 본래 종골골의 골절 하중과 유사했습니다. 전반적으로, 이 연구는 사과에서 추출한 셀룰로오스가 BTE 응용 분야에 유망한 후보임을 확인합니다. 그러나 기계적 특성과 건강한 뼈 조직의 기계적 특성 사이의 비유사성으로 인해 하중이 적은 시나리오에 대한 적용이 제한될 수 있습니다. 하중 지지 응용 분야를 위한 사과 유래 셀룰로오스 스캐폴드의 기계적 특성을 향상시키기 위해 추가적인 구조적 재설계 및 최적화가 필요할 수 있습니다.
Introduction
부상이나 질병으로 인한 큰 뼈 결손은 완전한 재생을 위해 생체재료 이식이 필요한 경우가 많습니다1. 뼈 조직 재생을 개선하기 위해 고안된 현재의 기술은 정기적으로 자가 이식편, 동종 이식편, 이종 이식편 또는 합성 이식편을 사용합니다2. 큰 뼈 결함을 복구하기 위한 “황금 표준” 이식 관행으로 간주되는 자가 뼈 이식의 경우 환자로부터 뼈를 추출합니다. 그러나 이 이식 절차에는 크기 및 모양 제한, 조직 가용성, 샘플링 부위 이환율 등 몇 가지 단점이 있습니다3. 또한, 자가 이식술은 수술 부위 감염, 후속 골절, 검체 채취 또는 재건 부위에서의 혈종 형성 및 수술 후 통증에 취약하다4. 뼈 조직 공학(BTE)은 기존의 뼈 이식 방법에 대한 잠재적인 대안을 제공합니다5. 구조적 생체 재료와 세포를 결합하여 새로운 기능적 뼈 조직을 만듭니다. BTE용 생체 재료를 설계할 때 거대 다공성 구조, 세포 부착을 촉진하는 표면 화학 및 천연 뼈와 매우 유사한 기계적 특성을 결합하는 것이 중요합니다6. 과거 연구에 따르면 BTE에 사용되는 생체 재료에 대한 이상적인 기공 크기 및 탄성 계수는 이식 부위에 따라 각각 약 100-200 μm7 및 0.1-20 GPa입니다8. 또한, 지지체의 다공성 및 기공 상호 연결성은 세포 이동, 영양소 확산 및 혈관 신생에 영향을 미치는 중요한 요소입니다8.
BTE는 뼈 이식의 대안으로 개발 및 평가된 다양한 생체 재료로 유망한 결과를 보여주었습니다. 이러한 생체 재료 중 일부는 골유도 재료, 하이브리드 재료 및 고급 하이드로겔8입니다. 골유도성 물질은 새로 형성된 뼈 구조의 발달을 자극합니다. 하이브리드 재료는 합성 및/또는 천연 고분자(8)로 구성된다. 고급 하이드로겔은 세포외 기질(ECM)을 모방하며 뼈 조직 통합을 촉진하는 데 필요한 생체 활성 인자를 전달할 수 있습니다8. 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite)는 전통적인 재료이며 그 조성과 생체 적합성으로 인해 BTE에 일반적으로 선택된다9. 생체 활성 유리는 BTE의 또 다른 유형의 생체 재료로, 골형성에 필요한 유전자를 활성화하기 위해 특정 세포 반응을 자극하는 것으로 나타났습니다10,11. 폴리(글리콜산) 및 폴리(젖산)를 포함한 생분해성 고분자도 BTE 응용 분야에서 광범위하게 사용되어 왔다12. 마지막으로, 키토산, 키틴, 박테리아 셀룰로오스와 같은 천연 또는 자연 유래 폴리머도 BTE13에 대한 고무적인 결과를 보여주었습니다. 그러나 합성 고분자와 천연 고분자 모두 BTE의 잠재력을 보여주지만, 원하는 거대 구조를 가진 기능성 스캐폴드를 개발하려면 일반적으로 광범위한 프로토콜이 필요합니다.
반대로, 천연 거시적 셀룰로오스 구조는 다양한 식물에서 쉽게 유도할 수 있으며, 우리 연구 그룹은 이전에 식물에서 유래한 셀룰로오스 기반 스캐폴드를 다른 조직 재구성에 적용할 수 있음을 입증했습니다. 실제로, 간단한 계면활성제 처리 후, 우리는 식물 재료의 고유한 구조를 활용하여 다용도 생체 재료로서의 잠재력을 강조했습니다14. 더욱이, 이들 셀룰로오스-기반 스캐폴드는 시험관 내 포유류 세포 배양 응용(14)에 사용될 수 있고, 생체 적합성이 있으며, 자발적인 피하 혈관형성(spontaneous subcutaneous vascularization)을 지원한다(14,15,16,17). 우리의 연구 그룹과 다른 사람들은 모두 이러한 스캐폴드가 의도된 응용 프로그램 14,15,16,17,18,19,20에 따라 특정 식물에서 얻을 수 있음을 입증했습니다. 예를 들어, 식물의 줄기와 잎에서 관찰되는 혈관 구조는 동물 조직에서 발견되는 구조와 현저한 유사성을 나타낸다19. 또한, 식물로부터 유래된 셀룰로오스 스캐폴드는 원하는 특성을 달성하기 위해 용이하게 형성되고 표면 생화학적 변형을 받을 수 있다(16). 최근 연구에서, 우리는 탈세포화 과정 동안 염 완충액을 통합하여, in vitro 및 in vivo 설정 모두에서 세포 부착을 향상시켰다16. 같은 연구에서 우리는 스캐폴드 표면에 하이드로겔을 주조하여 복합 생체 재료에서 식물 유래 셀룰로오스 스캐폴드의 적용 가능성을 입증했습니다. 최근 연구에서 식물 유래 스캐폴드의 기능화는 그 효과를 향상시키는 것으로 나타났습니다18. 예를 들어, Fontana et al. (2017)이 수행한 연구에 따르면 인간 피부 섬유아세포의 접착력은 RGD로 코팅된 탈세포화된 줄기에 의해 지지되는 반면, 코팅되지 않은 줄기는 동일한 기능을 나타내지 않는 것으로 나타났습니다18. 또한, 저자들은 변형된 모의 체액을 사용하여 탈세포화된 식물 줄기를 인위적으로 광물화할 수 있음을 입증했습니다. 보다 최근의 연구에서, 우리는 식물 유래 셀룰로오스 스캐폴드에서 기계에 민감한 골 형성의 개념을 탐구하고 BTE17,20에 대한 잠재력을 평가했습니다. 또한, Lee et al. (2019)은 식물 유래 스캐폴드를 활용하여 체외 환경에서 뼈와 유사한 조직을 배양했습니다21. 다양한 식물 공급원에 대한 포괄적인 평가를 통해 저자들은 사과 유래 스캐폴드가 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)의 배양 및 분화에 가장 적합하다는 것을 확인했습니다. 또한 저자들은 사과에서 추출한 비계의 구조적, 기계적 특성이 의도한 목적에 대한 적합성에 중추적인 역할을 한다고 제안했습니다. 조직 공학 응용 분야에서 구현된 초기 식물 유래 지지체인 사과 유래 지지체는 특히 직경 100에서 200μm에 이르는 상호 연결된 기공 측면에서 인간 뼈의 구조와 현저하게 유사한 구조를 갖는 것으로 광범위하게 나타났습니다(14,21).
본 연구에서 우리는 BTE에 대한 사과 유래 셀룰로오스 스캐폴드의 잠재력을 추가로 조사하고 시험관 내 및 생체 내 모두에서 기계적 특성을 분석했습니다. BTE 17,20,21에 대한 사과 유래 스캐폴드의 잠재력에 대한 연구가 있었지만 기계적 특성은 충분히 조사되지 않았습니다. 결과는 분화 배지에서 4주 동안 배양된 스캐폴드에 파종된 MC3T3-E1 전골아세포의 야생 확산 침입 및 골형성 분화를 보여주었습니다. 이 스캐폴드의 영률은 192.0 ± 16.6 kPa였으며, 이는 빈 스캐폴드(시드된 세포가 없는 스캐폴드)(31.6 ± 4.8 kPa) 및 비분화 배지에서 배양된 셀 시드 스캐폴드(24.1 ± 8.8 kPa)보다 훨씬 높았습니다. 그러나, 건강한 인간 뼈 조직의 영률(Young’s modulus)은 전형적으로 섬유주 뼈의 경우 0.1-2 GPa, 피질골의 경우 약 15-20 GPa의 범위 내에 속한다는 점에 유의해야 한다8. 그럼에도 불구하고, 설치류의 종골 결손에서 8주간의 착상 후, 세포 파종된 지지체는 주변 뼈에 잘 통합된 것으로 나타났으며, 이는 푸시아웃 테스트에서 평균 113.6N ± 18.2N의 피크 힘으로 입증되었으며, 이는 이전에 보고된 본래 종아리골22의 골절 하중과 유사하다. 전반적으로, 이 연구에서 얻은 결과는 특히 비하중 응용 분야에서 상당한 가능성을 보여줍니다. 그러나 사과 유래 셀룰로오스 스캐폴드는 현재 임플란트 부위의 주변 뼈 조직과 정확하게 일치하는 데 필요한 기계적 특성을 가지고 있지 않습니다. 따라서 이러한 스캐폴드의 잠재력을 최대한 활용하려면 추가 개발이 필요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여러 시험관 내 및 생체 내 연구에서 식물 유래 셀룰로오스의 생체 적합성과 조직 공학에서의 잠재적 사용 14,15,16,18,19,20, 특히 골형성 분화 20,21. 본 연구의 목적은 BTE에 대한 사과 유래 셀룰…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트에 대한 자금은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)(디스커버리 그랜트)와 리카싱 재단(Li Ka Shing Foundation)에서 제공했습니다. MLL은 Ontario Centers of Excellence TalentEdge 프로그램의 지원을 받았으며 RJH는 NSERC 대학원 장학금과 온타리오 대학원 장학금(OGS)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
| 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium | Sigma-Aldrich | B5655 | BCIP/NBT |
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Cell Culture |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| Dental drill | Surgical tool | ||
| Ethanol | ThermoFisher | 615095000 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalin |
| Goldner's trichrome stain | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
| Hematoxylin and eosin stain | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
| High-speed resonant confocal laser scanning microscope | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Irrigation saline | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
| MC3T3-E1 Subclone 4 cells | ATCC | CRL-2593 | Pre-osteoblast cells |
| McIntosh apples | Canada Fancy grade | ||
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909 | Histological embedding |
| Minimum Essential Medium | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; without Ca2+ and Mg2+ |
| Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
| Slide scanner microscope | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
| Sodium metabisulphite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium phosphate | ThermoFisher | BP329 | |
| Sprague-Dawley rats | Charles-River Laboratories | 400 | Male |
| Sutures | Ethicon | J494G | 4-0 |
| Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm diameter |
| Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
| Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Cell Culture |
| Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
| Universal compression Device | CellScale | UniVert | |
| Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histology |
Riferimenti
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