骨組織工学のための脱細胞化リンゴ由来の足場( In Vitro および In Vivo)
Summary
本研究では、植物由来の生体材料の脱細胞化、物性評価、イメージング、 in vivo 移植の方法、および足場における細胞の播種と分化の方法について詳しく説明します。記載された方法は、骨組織工学的応用のための植物ベースの生体材料の評価を可能にする。
Abstract
植物由来のセルロース生体材料は、さまざまな組織工学用途に採用されています。 In vivo 研究では、天然由来のセルロースで作られた足場の驚くべき生体適合性が示されています。さらに、これらの足場は複数の組織に関連する構造的特徴を有しており、哺乳類細胞の侵入と増殖を促進します。脱細胞化リンゴのヒパンチウム組織を用いた最近の研究では、その細孔径が海綿骨の孔径と類似していること、および骨形成の分化を効果的にサポートする能力が実証されています。本研究では、骨組織工学(BTE)用途におけるリンゴ由来のセルロース足場の可能性をさらに検討し、in vitro および in vivo の機械的特性を評価しました。MC3T3-E1骨芽細胞をリンゴ由来のセルロース足場に播種し、骨形成能と機械的特性を評価しました。アルカリホスファターゼおよびアリザリンレッドS染色により、分化培地で培養した足場における骨形成分化が確認されました。組織学的検査では、足場全体に広範囲にわたる細胞浸潤と石灰化が示されました。走査型電子顕微鏡(SEM)により、足場の表面に鉱物凝集体が発見され、エネルギー分散型分光法(EDS)により、リン酸塩とカルシウム元素の存在が確認されました。しかし、細胞分化後のヤング率の有意な増加にもかかわらず、健康な骨組織よりも低いままでした。 In vivo 研究では、ラットの頭蓋骨に8週間移植した後、 脱細胞化リンゴ由来の足場内に細胞浸潤と細胞外マトリックスが沈着することが示されました。さらに、骨欠損部から足場を取り外すのに必要な力は、以前に報告された天然の頭蓋骨の骨折荷重と同様でした。全体として、この研究は、リンゴ由来のセルロースがBTEアプリケーションの有望な候補であることが確認されています。ただし、その機械的特性と健康な骨組織の機械的特性の相違により、低耐荷重シナリオへの適用が制限される可能性があります。耐荷重用途のリンゴ由来のセルロース足場の機械的特性を強化するために、追加の構造の再設計と最適化が必要になる場合があります。
Introduction
怪我や病気によって引き起こされる大きな骨欠損は、完全な再生のために生体材料移植片を必要とすることがよくあります1。骨組織の再生を改善するために設計された現在の技術では、自家移植片、同種移植片、異種移植片、または合成移植片が定期的に使用されています2。自家骨移植は、大きな骨欠損を修復するための「ゴールドスタンダード」移植方法と見なされており、患者から骨を抽出します。ただし、この移植手順には、サイズと形状の制限、組織の可用性、サンプリング部位の罹患率など、いくつかの欠点があります3。さらに、自家移植手術は、手術部位の感染、その後の骨折、サンプリング部位または再建部位での血腫形成、および術後の痛みの影響を受けやすい4。骨組織工学(BTE)は、従来の骨移植方法に代わる潜在的な方法を提供します5。構造的な生体材料と細胞を組み合わせて、新しい機能的な骨組織を構築します。BTE用の生体材料を設計する際には、マクロ多孔質構造、細胞接着を促進する表面化学、および天然の骨によく似た機械的特性を組み合わせることが重要です6。これまでの研究から、BTEに利用される生体材料の理想的な細孔径と弾性率は、グラフト部位にもよるが、それぞれ約100-200μm7、0.1-20GPa程度であることが示されている8。さらに、足場の多孔性と細孔の相互接続性は、細胞の移動、栄養素の拡散、および血管新生に影響を与える重要な要素です8。
BTEは、骨移植の代替オプションとして開発および評価されたさまざまな生体材料で有望な結果を示しています。これらの生体材料には、骨誘導材料、ハイブリッド材料、および高度なハイドロゲル8があります。骨誘導材料は、新しく形成された骨構造の発達を刺激します。ハイブリッド材料は、合成ポリマーおよび/または天然ポリマーで構成されています8。高度なハイドロゲルは細胞外マトリックス(ECM)を模倣し、骨組織の統合を促進するために必要な生理活性因子を提供することができます8。ハイドロキシアパタイトは伝統的な材料であり、その組成と生体適合性からBTEの一般的な選択肢です9。生体活性ガラスはBTEの別のタイプの生体材料であり、特定の細胞応答を刺激して骨形成に必要な遺伝子を活性化することが示されています10,11。ポリ(グリコール酸)やポリ(乳酸)などの生分解性ポリマーも、BTE用途で広く使用されています12。最後に、キトサン、キチン、バクテリアセルロースなどの天然または天然由来のポリマーも、BTE13の有望な結果を示しています。しかし、合成ポリマーと天然ポリマーの両方がBTEの可能性を示していますが、目的のマクロ構造を持つ機能的な足場の開発には、通常、広範なプロトコルが必要です。
逆に、天然の巨視的なセルロース構造は、多様な植物から容易に導出することができ、私たちの研究グループは、植物に由来するセルロースベースの足場が、異なる組織再建に適用できることを以前に実証しました。実際、簡単な界面活性剤処理に続いて、植物材料の固有の構造を利用し、用途の広い生体材料としての可能性を強調しました14。さらに、これらのセルロースベースの足場は、in vitro哺乳類細胞培養用途14に使用でき、生体適合性があり、自発的な皮下血管新生をサポートする14,15,16,17。私たちの研究グループと他の研究グループの両方が、これらの足場が意図された用途14、15、16、17、18、19、20に基づいて特定の植物から得られることを実証しました。例えば、植物の茎や葉に見られる維管束構造は、動物組織に見られる構造と著しい類似性を示す19。さらに、植物由来のセルロース足場は、所望の特性を達成するために、容易に成形され、表面の生化学的修飾を受けることができる16。最近の研究では、脱細胞化プロセス中に塩バッファーを組み込み、in vitroとin vivoの両方の設定で細胞接着の増強が観察されました16。同研究では、植物由来のセルロース足場を足場の表面にハイドロゲルを流延することで、複合生体材料への適用性を実証しました。最近の研究では、植物由来の足場の機能化がその有効性を高めることが示されています18。例えば、Fontana et al.(2017)が実施した研究では、ヒトの皮膚線維芽細胞の接着はRGDでコーティングされた脱細胞化ステムによって支えられているが、コーティングされていないステムは同じ能力を示さないことが明らかになった18。さらに、著者らは、改変された模擬体液を利用して、脱細胞化した植物の茎を人工的に石灰化できることも示しました。最近の研究では、植物由来のセルロース足場における機械感受性骨形成の概念を探り、BTE17,20の可能性を評価しました。さらに、Lee et al.(2019)は、植物由来の足場を利用して、in vitro設定で骨様組織を培養しました21。著者らは、さまざまな植物源を包括的に評価した結果、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の培養と分化に最も適した足場がリンゴ由来の足場であることを突き止めた。さらに、著者らは、リンゴ由来の足場の構造的および機械的特性が、意図された目的への適合性において極めて重要な役割を果たすことを提案しました。組織工学用途に実装された最初の植物由来の足場であるリンゴ由来の足場は、特に直径100〜200μmの範囲の相互接続された細孔の点で、人間の骨の構造と驚くほど類似した構造を持っていることが広く示されています14,21。
本研究では、リンゴ由来のセルロース足場のBTEに対する可能性をさらに調査し、in vitroおよびin vivoの両方でその機械的特性の解析を行いました。BTE 17,20,21のリンゴ由来の足場の可能性に関する研究は行われてきましたが、その機械的特性は十分に調査されていませんでした。その結果、分化培地で4週間培養した足場に播種したMC3T3-E1骨芽細胞の野生の侵入と骨形成分化が示されました。これらの足場のヤング率は192.0 ± 16.6 kPaであり、ブランクスホールド(播種細胞のない足場)(31.6 ± 4.8 kPa)や非分化培地で培養した細胞播種足場(24.1 ± 8.8 kPa)よりも有意に高かった。しかしながら、健康なヒト骨組織のヤング率は、典型的には、海綿骨については0.1〜2GPa、皮質骨については約15〜20GPaの範囲に収まることに留意すべきである8。それにもかかわらず、げっ歯類の頭蓋骨欠損部に8週間の移植後、細胞播種された足場は周囲の骨によく統合されているように見え、押し出し試験で113.6 N±18.2 Nの平均ピーク力によって示され、これは以前に報告された天然の頭蓋骨の骨折荷重に類似しています22。全体として、この研究から得られた結果は、特に非耐荷重用途において大きな有望性を示しています。しかし、リンゴ由来のセルロース足場は、現在のところ、インプラント部位の周囲の骨組織と正確に一致させるために必要な機械的特性を有していません。そのため、これらの足場の可能性を最大限に引き出すには、さらなる開発が必要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
いくつかのin vitroおよびin vivo研究は、植物由来のセルロースの生体適合性と、組織工学におけるその潜在的な使用を実証しています14,15,16,18,19,20、より具体的には骨形成分化をホストするために20,21<sup clas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトの資金は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)(ディスカバリー助成金)と李嘉誠基金会から提供されました。MLLはオンタリオ州センターオブエクセレンスTalentEdgeプログラムから支援を受け、RJHはNSERC大学院奨学金とオンタリオ大学院奨学金(OGS)の支援を受けました。
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
| 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium | Sigma-Aldrich | B5655 | BCIP/NBT |
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Cell Culture |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| Dental drill | Surgical tool | ||
| Ethanol | ThermoFisher | 615095000 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalin |
| Goldner's trichrome stain | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
| Hematoxylin and eosin stain | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
| High-speed resonant confocal laser scanning microscope | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Irrigation saline | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
| MC3T3-E1 Subclone 4 cells | ATCC | CRL-2593 | Pre-osteoblast cells |
| McIntosh apples | Canada Fancy grade | ||
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909 | Histological embedding |
| Minimum Essential Medium | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; without Ca2+ and Mg2+ |
| Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
| Slide scanner microscope | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
| Sodium metabisulphite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium phosphate | ThermoFisher | BP329 | |
| Sprague-Dawley rats | Charles-River Laboratories | 400 | Male |
| Sutures | Ethicon | J494G | 4-0 |
| Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm diameter |
| Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
| Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Cell Culture |
| Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
| Universal compression Device | CellScale | UniVert | |
| Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histology |
Riferimenti
- Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
- Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
- Parikh, S. N. Bone graft substitutes: Past, present, future. Journal of Postgraduate Medicine. 48 (2), 142-148 (2002).
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (6), 570-575 (2000).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
- Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30 (10), 546-554 (2012).
- Yoshikawa, H., Myoui, A. Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics. Journal of Artificial Organs. 8 (3), 131-136 (2005).
- Fu, Q., Saiz, E., Rahaman, M. N., Tomsia, A. P. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 31 (7), 1245-1256 (2011).
- Xynos, I. D., Edgar, A. J., Buttery, L. D. K., Hench, L. L., Polak, J. M. Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276 (2), 461-465 (2000).
- Kroeze, R., Helder, M., Govaert, L., Smit, T. Biodegradable polymers in bone tissue engineering. Materials. 2 (3), 833-856 (2009).
- Venkatesan, J., Vinodhini, P. A., Sudha, P. N. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration. Advances in Food and Nutrition Research. 73, 59-81 (2014).
- Modulevsky, D. J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z., Pelling, A. E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS One. 9 (5), e97835 (2014).
- Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Biocompatibility of subcutaneously implanted plant-derived cellulose biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
- Hickey, R. J., Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Customizing the shape and microenvironment biochemistry of biocompatible macroscopic plant-derived cellulose scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3726-3736 (2018).
- Hickey, R. J., Leblanc Latour, M., Harden, J. L., Pelling, A. E. Designer scaffolds for interfacial bioengineering. Advanced Engineering Materials. 25, 2201415 (2023).
- Fontana, G., et al. Biofunctionalized plants as diverse biomaterials for human cell culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601225 (2017).
- Gershlak, J. R., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
- Leblanc Latour, M., Pelling, A. E. Mechanosensitive osteogenesis on native cellulose scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics. 135, 111030 (2022).
- Lee, J., Jung, H., Park, N., Park, S. H., Ju, J. H. Induced osteogenesis in plants decellularized scaffolds. Scientific Reports. 9 (1), 20194 (2019).
- Zhao, J., et al. Enhanced healing of rat calvarial defects with sulfated chitosan-coated calcium-deficient hydroxyapatite/bone morphogenetic protein 2 scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 18 (1-2), 185-197 (2012).
- Murtey, M. D., Ramasamy, P. . Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy – Life Sciences. In: Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , 161-186 (2016).
- . . tousimis Critical Point Dryers – Samdri®-PVT-3D. , (2022).
- . . Leica EM ACE200 Vacuum Coater. , (2023).
- Spicer, P. P. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nature Protocols. 7 (10), 1918-1929 (2012).
- Leblanc Latour, M. . Cellulose biomaterials for bone tissue engineering [dissertation]. , (2023).
- Kodama, H. -. A., Amagai, Y., Sudo, H., Kasai, S., Yamamoto, S. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Japanese Journal of Oral Biology. 23 (4), 899-901 (1981).
- Wang, D., et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (6), 893-903 (1999).
- Addison, W. N., et al. Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone. 71, 244-256 (2015).
- Heary, R. F., Parvathreddy, N., Sampath, S., Agarwal, N. Elastic modulus in the selection of interbody implants. Journal of Spine Surgery. 3 (2), 163-167 (2017).
- Lawson, Z. T., et al. Methodology for performing biomechanical push-out tests for evaluating the osseointegration of calvarial defect repair in small animal models. MethodsX. 8, 101541 (2021).
