سقالات مشتقة من التفاح منزوعة الخلايا لهندسة أنسجة العظام في المختبر وفي الجسم الحي
Summary
في هذه الدراسة ، نقوم بتفصيل طرق إزالة الخلايا ، والتوصيف الفيزيائي ، والتصوير ، وزرع المواد الحيوية النباتية في الجسم الحي ، بالإضافة إلى طرق بذر الخلايا والتمايز في السقالات. تسمح الطرق الموصوفة بتقييم المواد الحيوية النباتية لتطبيقات هندسة أنسجة العظام.
Abstract
تم استخدام المواد الحيوية السليلوز المشتقة من النباتات في تطبيقات هندسة الأنسجة المختلفة. أظهرت الدراسات في الجسم الحي التوافق الحيوي الرائع للسقالات المصنوعة من السليلوز المشتق من المصادر الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، تمتلك هذه السقالات خصائص هيكلية ذات صلة بأنسجة متعددة ، وتعزز غزو وتكاثر خلايا الثدييات. أظهرت الأبحاث الحديثة التي تستخدم أنسجة Hypanthium التفاح منزوعة الخلايا تشابه حجم المسام مع حجم العظم التربيقي بالإضافة إلى قدرته على دعم التمايز العظمي بشكل فعال. فحصت الدراسة الحالية كذلك إمكانات سقالات السليلوز المشتقة من التفاح لتطبيقات هندسة أنسجة العظام (BTE) وقيمت خصائصها الميكانيكية في المختبر وفي الجسم الحي . تم زرع بانيات MC3T3-E1 preosteoblasts في سقالات السليلوز المشتقة من التفاح والتي تم تقييمها بعد ذلك لإمكاناتها العظمية وخصائصها الميكانيكية. أكد تلطيخ الفوسفاتيز القلوي و S الأحمر الأليزارين التمايز العظمي في السقالات المستزرعة في وسط التمايز. أظهر الفحص النسيجي غزو الخلايا والتمعدن على نطاق واسع عبر السقالات. كشف المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) عن مجاميع معدنية على سطح السقالات ، وأكد التحليل الطيفي المشتت للطاقة (EDS) وجود عناصر الفوسفات والكالسيوم. ومع ذلك ، على الرغم من الزيادة الكبيرة في معامل يونغ بعد تمايز الخلايا ، إلا أنه ظل أقل من الأنسجة العظمية السليمة. أظهرت الدراسات في الجسم الحي تسلل الخلايا وترسب المصفوفة خارج الخلية داخل السقالات المشتقة من التفاح بعد 8 أسابيع من الزرع في كالفاريا الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، كانت القوة المطلوبة لإزالة السقالات من عيب العظام مماثلة لحمل الكسر المبلغ عنه سابقا لعظم الجلفاري الأصلي. بشكل عام ، تؤكد هذه الدراسة أن السليلوز المشتق من التفاح هو مرشح واعد لتطبيقات BTE. ومع ذلك ، فإن الاختلاف بين خواصه الميكانيكية وخصائص الأنسجة العظمية السليمة قد يحد من تطبيقه على سيناريوهات منخفضة الحمل. قد يكون من الضروري إعادة هندسة هيكلية إضافية وتحسينها لتعزيز الخواص الميكانيكية لسقالات السليلوز المشتقة من التفاح للتطبيقات الحاملة.
Introduction
غالبا ما تتطلب عيوب العظام الكبيرة الناتجة عن إصابة أو مرض ترقيع المواد الحيوية للتجديد الكامل1. تستخدم التقنيات الحالية المصممة لتحسين تجديد أنسجة العظام بانتظام الطعوم الذاتية أو الخيفية أو الغريبة أو الاصطناعية2. بالنسبة لتطعيم العظام الذاتي ، الذي يعتبر ممارسة التطعيم “المعيار الذهبي” لإصلاح عيوب العظام الكبيرة ، يتم استخراج العظام من المريض. ومع ذلك ، فإن إجراء التطعيم هذا له العديد من العيوب ، بما في ذلك قيود الحجم والشكل ، وتوافر الأنسجة ، ومراضة موقع أخذ العينات3. علاوة على ذلك ، فإن إجراءات التطعيم الذاتي عرضة لالتهابات موقع الجراحة ، والكسور اللاحقة ، وتشكيل ورم دموي في موقع أخذ العينات أو إعادة بنائه ، وآلام ما بعد الجراحة4. تقدم هندسة أنسجة العظام (BTE) بديلا محتملا لطرق تطعيم العظام التقليدية5. فهو يجمع بين المواد الحيوية الهيكلية والخلايا لبناء أنسجة عظمية وظيفية جديدة. عند تصميم المواد الحيوية ل BTE ، من الأهمية بمكان الجمع بين بنية كبيرة يسهل اختراقها ، وكيمياء السطح التي تعزز ارتباط الخلية ، والخصائص الميكانيكية التي تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في العظام الأصلية6. أشارت الأبحاث السابقة إلى أن حجم المسام المثالي ومعامل المرونة للمواد الحيوية المستخدمة في BTE هما حوالي 100-200 ميكرومتر7 و 0.1-20 جيجا باسكال ، على التوالي ، اعتمادا على موقع التطعيم8. إلى جانب ذلك ، فإن المسامية والترابط المسامي للسقالات هي عوامل حاسمة تؤثر على هجرة الخلايا ، وانتشار المغذيات ، وتكوين الأوعية8.
أظهر بنك تونس و التعليم نتائج واعدة مع العديد من المواد الحيوية التي تم تطويرها وتقييمها كخيارات بديلة لترقيع العظام. بعض هذه المواد الحيوية هي مواد حثية عظمية ومواد هجينة وهلاميات مائية متقدمة8. تحفز المواد الاستقرائية العظمية تطوير الهياكل العظمية المشكلة حديثا. تتكون المواد الهجينة من بوليمرات اصطناعية و / أو طبيعية8. تحاكي الهلاميات المائية المتقدمة المصفوفة خارج الخلية (ECM) وهي قادرة على تقديم العوامل النشطة بيولوجيا اللازمة لتعزيز تكامل أنسجة العظام8. هيدروكسيباتيت هو مادة تقليدية وخيار شائع ل BTE بسبب تكوينه وتوافقه الحيوي9. الزجاج النشط بيولوجيا هو نوع آخر من المواد الحيوية ل BTE ، والذي ثبت أنه يحفز استجابات خلايا معينة لتنشيط الجينات اللازمة لتكوين العظم10,11. كما تم استخدام البوليمرات القابلة للتحلل ، بما في ذلك بولي (حمض الجليكوليك) وبولي (حمض اللاكتيك) ، على نطاق واسع في تطبيقات BTE12. أخيرا ، أظهرت البوليمرات الطبيعية أو المشتقة بشكل طبيعي مثل الشيتوزان والكيتين والسليلوز البكتيري نتائج مشجعة ل BTE13. ومع ذلك ، في حين أن كل من البوليمرات الاصطناعية والطبيعية تظهر إمكانات ل BTE ، فإن تطوير سقالة وظيفية مع البنية الكلية المطلوبة يتطلب عادة بروتوكولات واسعة النطاق.
على العكس من ذلك ، يمكن اشتقاق هياكل السليلوز العيانية الأصلية بسهولة من النباتات المتنوعة ، وقد أثبتت مجموعتنا البحثية سابقا قابلية تطبيق السقالات القائمة على السليلوز المشتقة من النباتات على عمليات إعادة بناء الأنسجة المختلفة. في الواقع ، بعد معالجة بسيطة للفاعل بالسطح ، قمنا بتسخير البنية المتأصلة للمادة النباتية ، وتسليط الضوء على إمكاناتها كمادة حيوية متعددة الاستخدامات14. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه السقالات القائمة على السليلوز لتطبيقات زراعة خلايا الثدييات في المختبر 14 ، وهي متوافقة حيويا ، وتدعم الأوعية الدموية العفوية تحت الجلد14،15،16،17. أثبتت كل من مجموعتنا البحثية وغيرها أنه يمكن الحصول على هذه السقالات من نباتات محددة بناء على التطبيق المقصود14،15،16،17،18،19،20. على سبيل المثال ، تظهر البنية الوعائية التي لوحظت في سيقان وأوراق النبات تشابها مذهلا مع التركيب الموجود في الأنسجة الحيوانية19. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تشكيل سقالات السليلوز المشتقة من النباتات بسهولة وتعريضها لتعديلات كيميائية حيوية سطحية لتحقيق الخصائص المطلوبة16. في دراسة حديثة ، قمنا بدمج مخزن مؤقت للملح أثناء عملية إزالة الخلايا ، مما أدى إلى تعزيز ارتباط الخلية الذي لوحظ في كل من الإعدادات في المختبر وفي الجسم الحي 16. في نفس الدراسة ، أظهرنا قابلية تطبيق سقالات السليلوز المشتقة من النباتات في المواد الحيوية المركبة عن طريق صب الهلاميات المائية على سطح السقالات. في الدراسات الحديثة ، ثبت أن تشغيل السقالات المشتقة من النباتات يعزز فعاليتها18. على سبيل المثال ، كشفت دراسة أجراها Fontana et al. (2017) أن التصاق الخلايا الليفية الجلدية البشرية كان مدعوما بسيقان منزوعة الخلايا مغلفة ب RGD ، في حين أن السيقان غير المطلية لم تظهر نفس القدرة18. علاوة على ذلك ، أظهر المؤلفون أيضا أنه يمكن استخدام سائل الجسم المحاكي المعدل لتمعدن سيقان النباتات منزوعة الخلايا بشكل مصطنع. في دراسات أحدث ، استكشفنا مفهوم تكوين العظم الحساس ميكانيكيا في سقالات السليلوز المشتقة من النباتات وقيمنا إمكاناتها ل BTE17،20. علاوة على ذلك ، استخدم Lee et al. (2019) سقالات مشتقة من النباتات لزراعة الأنسجة الشبيهة بالعظام في بيئة في المختبر 21. من خلال التقييمات الشاملة للمصادر النباتية المختلفة ، حدد المؤلفون السقالات المشتقة من التفاح باعتبارها الأكثر مثالية لثقافة وتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). علاوة على ذلك ، اقترح المؤلفون أن السمات الهيكلية والميكانيكية للسقالات المشتقة من التفاح تلعب دورا محوريا في ملاءمتها للغرض المقصود. نظرا لكونها السقالات الأولية المشتقة من النباتات التي تم تنفيذها في تطبيقات هندسة الأنسجة ، فقد ثبت على نطاق واسع أن السقالات المشتقة من التفاح تمتلك بنية مشابهة بشكل لافت للنظر لتلك الموجودة في العظام البشرية ، لا سيما من حيث مسامها المترابطة التي يتراوح قطرها من 100 إلى 200 ميكرومتر14,21.
في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق بشكل أكبر في إمكانات سقالات السليلوز المشتقة من التفاح ل BTE وأجرينا تحليلا لخصائصها الميكانيكية في كل من المختبر والجسم الحي. على الرغم من وجود دراسات حول إمكانات السقالات المشتقة من التفاح ل BTE17،20،21 ، إلا أن خصائصها الميكانيكية لم يتم التحقيق فيها بشكل كاف. أظهرت النتائج غزو الانتشار البري والتمايز العظمي لبانيات MC3T3-E1 preosteoblasts المصنفة في سقالات تم استزراعها في وسط التمايز لمدة 4 أسابيع. كان معامل يونغ لهذه السقالات 192.0 ± 16.6 كيلو باسكال ، وهو أعلى بكثير من تلك الموجودة في السقالات الفارغة (سقالات بدون خلايا مصنفة) (31.6 ± 4.8 كيلو باسكال) والسقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة في وسط غير متمايز (24.1 ± 8.8 كيلو باسكال). ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن معامل يونغ للأنسجة العظمية البشرية السليمة يقع عادة في نطاق 0.1-2 GPa للعظام التربيقية وحوالي 15-20 GPa للعظام القشرية8. ومع ذلك ، بعد زرع لمدة 8 أسابيع في عيب كالفاري القوارض ، بدا أن السقالات المصنفة بالخلايا مدمجة جيدا في العظام المحيطة ، كما يتضح من متوسط قوة الذروة البالغة 113.6 نيوتن ± 18.2 نيوتن في اختبارات الدفع ، وهو مشابه لحمل الكسر المبلغ عنه سابقا لعظم الجلفاري الأصلي22. بشكل عام ، تظهر النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الدراسة وعدا كبيرا ، خاصة بالنسبة للتطبيقات غير الحاملة. ومع ذلك ، لا تمتلك سقالات السليلوز المشتقة من التفاح حاليا الخصائص الميكانيكية اللازمة لمطابقة الأنسجة العظمية المحيطة بدقة في موقع الزرع. وبالتالي ، هناك حاجة إلى مزيد من التطوير لإطلاق العنان للإمكانات الكاملة لهذه السقالات.
Protocol
Representative Results
Discussion
أظهرت العديد من الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي التوافق الحيوي للسليلوز المشتق من النبات واستخدامه المحتمل في هندسة الأنسجة14،15،16،18،19،20 ، وبشكل أكثر تحديدا لاستضافة …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) (منحة الاكتشاف) ومؤسسة لي كا شينغ. تلقى MLL الدعم من برنامج TalentEdge لمراكز التميز في أونتاريو ، وتم دعم RJH من خلال منحة NSERC للدراسات العليا ومنحة أونتاريو للدراسات العليا (OGS).
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
| 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium | Sigma-Aldrich | B5655 | BCIP/NBT |
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Cell Culture |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| Dental drill | Surgical tool | ||
| Ethanol | ThermoFisher | 615095000 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalin |
| Goldner's trichrome stain | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
| Hematoxylin and eosin stain | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
| High-speed resonant confocal laser scanning microscope | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Irrigation saline | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
| MC3T3-E1 Subclone 4 cells | ATCC | CRL-2593 | Pre-osteoblast cells |
| McIntosh apples | Canada Fancy grade | ||
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909 | Histological embedding |
| Minimum Essential Medium | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; without Ca2+ and Mg2+ |
| Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
| Slide scanner microscope | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
| Sodium metabisulphite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium phosphate | ThermoFisher | BP329 | |
| Sprague-Dawley rats | Charles-River Laboratories | 400 | Male |
| Sutures | Ethicon | J494G | 4-0 |
| Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm diameter |
| Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
| Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Cell Culture |
| Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
| Universal compression Device | CellScale | UniVert | |
| Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histology |
Riferimenti
- Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
- Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
- Parikh, S. N. Bone graft substitutes: Past, present, future. Journal of Postgraduate Medicine. 48 (2), 142-148 (2002).
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (6), 570-575 (2000).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
- Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30 (10), 546-554 (2012).
- Yoshikawa, H., Myoui, A. Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics. Journal of Artificial Organs. 8 (3), 131-136 (2005).
- Fu, Q., Saiz, E., Rahaman, M. N., Tomsia, A. P. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 31 (7), 1245-1256 (2011).
- Xynos, I. D., Edgar, A. J., Buttery, L. D. K., Hench, L. L., Polak, J. M. Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276 (2), 461-465 (2000).
- Kroeze, R., Helder, M., Govaert, L., Smit, T. Biodegradable polymers in bone tissue engineering. Materials. 2 (3), 833-856 (2009).
- Venkatesan, J., Vinodhini, P. A., Sudha, P. N. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration. Advances in Food and Nutrition Research. 73, 59-81 (2014).
- Modulevsky, D. J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z., Pelling, A. E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS One. 9 (5), e97835 (2014).
- Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Biocompatibility of subcutaneously implanted plant-derived cellulose biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
- Hickey, R. J., Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Customizing the shape and microenvironment biochemistry of biocompatible macroscopic plant-derived cellulose scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3726-3736 (2018).
- Hickey, R. J., Leblanc Latour, M., Harden, J. L., Pelling, A. E. Designer scaffolds for interfacial bioengineering. Advanced Engineering Materials. 25, 2201415 (2023).
- Fontana, G., et al. Biofunctionalized plants as diverse biomaterials for human cell culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601225 (2017).
- Gershlak, J. R., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
- Leblanc Latour, M., Pelling, A. E. Mechanosensitive osteogenesis on native cellulose scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics. 135, 111030 (2022).
- Lee, J., Jung, H., Park, N., Park, S. H., Ju, J. H. Induced osteogenesis in plants decellularized scaffolds. Scientific Reports. 9 (1), 20194 (2019).
- Zhao, J., et al. Enhanced healing of rat calvarial defects with sulfated chitosan-coated calcium-deficient hydroxyapatite/bone morphogenetic protein 2 scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 18 (1-2), 185-197 (2012).
- Murtey, M. D., Ramasamy, P. . Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy – Life Sciences. In: Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , 161-186 (2016).
- . . tousimis Critical Point Dryers – Samdri®-PVT-3D. , (2022).
- . . Leica EM ACE200 Vacuum Coater. , (2023).
- Spicer, P. P. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nature Protocols. 7 (10), 1918-1929 (2012).
- Leblanc Latour, M. . Cellulose biomaterials for bone tissue engineering [dissertation]. , (2023).
- Kodama, H. -. A., Amagai, Y., Sudo, H., Kasai, S., Yamamoto, S. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Japanese Journal of Oral Biology. 23 (4), 899-901 (1981).
- Wang, D., et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (6), 893-903 (1999).
- Addison, W. N., et al. Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone. 71, 244-256 (2015).
- Heary, R. F., Parvathreddy, N., Sampath, S., Agarwal, N. Elastic modulus in the selection of interbody implants. Journal of Spine Surgery. 3 (2), 163-167 (2017).
- Lawson, Z. T., et al. Methodology for performing biomechanical push-out tests for evaluating the osseointegration of calvarial defect repair in small animal models. MethodsX. 8, 101541 (2021).
