Summary
Vi beskriver nye, enkle metoder til syntese og karakterisering af biokompatible ligninmikro- og submikronpartikler. Disse formuleringer giver en let tilgang til udnyttelsen af heteropolymeren samt et alternativ til rationelt design af multifunktionelle bærermatricer med potentiel anvendelighed inden for biomedicin, farmaceutisk teknologi og fødevareindustrien.
Abstract
Anvendelsen af biopolymermikro-/nanoteknologi inden for human-, veterinærmedicin-, farmaceutisk og fødevareteknologi vokser hurtigt på grund af det store potentiale i biopolymerbaserede partikler som effektive bærersystemer. Anvendelsen af lignin som en grundlæggende heteropolymerbiomatrix til design af innovative mikro-/submikronformuleringer gør det muligt at opnå øget biokompatibilitet og tilbyder forskellige aktive funktionelle grupper, der giver mulighed for tilpasning af formuleringernes fysisk-kemiske egenskaber og bioaktiviteter til forskellige anvendelser. Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en enkel og miljøvenlig metode til syntese af ligninpartikler med mikro- og submikronstørrelse; at evaluere deres fysisk-kemiske, spektrale og strukturelle egenskaber; og at undersøge deres evne til indkapsling af biologisk aktive molekyler og potentiale for in vitro-frigivelse af bioflavonoider i simulerede gastrointestinale medier. De præsenterede metoder anvender billige og grønne opløsningsmidler; nemme, ligetil, hurtige og følsomme processer, der kræver lidt udstyr, ikke-toksiske stoffer og enkle metoder til deres karakterisering, bestemmelse af indkapslingskapacitet mod de dårligt vandopløselige bioaktive forbindelser morin og quercetin og in vitro-frigivelsespotentialet for ligninmatricerne.
Introduction
I dag er tilbøjeligheden til biopolymerer såsom cellulose, chitosan, kollagen, dextran, gelatine og lignin som forløbere for design af mikro- / submikronbærere med tilpasselig størrelse, fysisk-kemiske egenskaber og biofunktionaliteter steget i biomedicinske, farmaceutiske og fødevareteknologiske industrier på grund af deres anvendelighed inden for vævsteknik, 3D-bioprint, in vitro sygdomsmodelleringsplatforme, emballageindustri, emulsionspræparation og næringsstoftilførsel blandt andet 1,2,3.
Nye undersøgelser fremhæver aspekterne af ligninbaserede hydrogeler samt mikro- og nanoformuleringer4 som fordelagtige køretøjer, der anvendes til fødevareemballagematerialer5, energilagring6, kosmetik7, termiske / lysstabilisatorer, forstærkede materialer og lægemiddelbærermatricer8 til levering af hydrofobe molekyler, forbedring af UV-barrierer9, som forstærkningsmidler i nanokompositter og som et alternativ til uorganiske nanopartikler på grund af nogle nylige sikkerhedsproblemer 10,11,12. Årsagen bag denne tendens er biokompatibiliteten, bionedbrydeligheden og ikke-toksiciteten af den naturlige heterobiopolymer samt dens dokumenterede bioaktiviteter af lignin-antioxidantpotentiale og radikale skylle-, antiproliferative og antimikrobielle aktiviteter 13,14,15,16,17.
Videnskabelig litteratur rapporterer forskellige metoder til syntese (selvsamling, udfældning mod opløsningsmidler, syreudfældning og forskydning af opløsningsmidler)18 og karakterisering af ligninbaserede mikro-/nanoskalerede formuleringer, herunder anvendelse af dyre eller skadelige opløsningsmidler såsom tetrahydrofuran (THF), dimethylsulfoxid (DMSO), N,N-dimethylformamid (DMF) og acetone og komplicerede, indirekte og kedelige processer, der bruger meget udstyr og giftige stoffer12,19,20.
For at overvinde sidstnævnte ulemper præsenterer følgende protokoller nye metoder til syntese af ligninbaserede mikro-/submikronpartikler ved hjælp af billige og grønne opløsningsmidler; nemme, ligetil, hurtige og følsomme processer, der kræver lidt udstyr, ikke-toksiske stoffer og enkle metoder til deres karakterisering og bestemmelse af indkapslingskapacitet over for dårligt vandopløselige bioaktive forbindelser og in vitro-frigivelsespotentiale for ligninmatricerne. De præsenterede produktionsmetoder i laboratorieskala er fordelagtige til fremstilling af funktionelle ligninbærere med justerbare størrelser, høj indkapslingskapacitet og bæredygtig in vitro-frigivelsesadfærd ved hjælp af enkle karakteriseringsprocedurer og miljøvenlige kemikalier, der kan finde anvendelse inden for forskellige områder af biomedicinsk videnskab og fødevareteknologi. To flavonoider blev påført som målmolekyler indkapslet i ligninpartiklerne: morin - ind i mikropartiklerne og quercetin - i submikronpartiklerne. Forskellen i strukturerne af begge flavonoider Er kun positionen af den anden -OH-gruppe i den B-aromatiske ring: -OH-gruppen er på 2'-positionen i morin og på 3'-positionen i quercetin, således at begge organiske forbindelser er positionelle isomerer. Sidstnævnte kendsgerning forudsætter lignende opførsel af begge bioaktive naturlige forbindelser i indkapslings- og/eller frigivelsesprocesserne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese af ligninmikropartikler
- Forbered en 50 mg / ml alkali lignin vandig opløsning ved at opløse 2,5 g alkali lignin i 50 ml ultrarent vand på en magnetisk omrører.
- Forbered 1% Tween 80 opløsning ved at opløse 1 ml Tween 80 i 100 ml ultrarent vand.
- Forbered en 2 M opløsning af HNO3 ved at fortynde 6,65 ml 67% HNO3 (densitet = 1,413 g / ml) med ultrarent vand til et slutvolumen på 50 ml.
- Der tilsættes langsomt 15 ml af 1% Tween 80-opløsningen til 50 ml af 50 mg/ml alkaliligninopløsningen.
- Omrør blandingen på en magnetisk omrører ved 500 o / min i 10 minutter, så det overfladeaktive stof bliver godt dispergeret.
- Der tilsættes 20 ml 2 M HNO3 dråbevis med en sprøjte med en strømningshastighed på ca. 150 μL/s til blandingen.
- Omrør blandingen fortsat i 30 minutter, hvorefter den mørkebrune opløsning omdannes til en lysebrun suspension af mikropartikler.
- Suspensionen overføres til 1,5-2 ml reagensglas og centrifugeres i 30 minutter ved 15.000 × g i en ultracentrifuge ved 10 °C.
- Supernatanten opsamles til yderligere analyse, og mikropartiklerne skylles med ultrarent vand.
- Gentag skylnings-/ultracentrifugeringsprocedurerne 3x.
- Dyp beholderen med mikropartiklerne i et isbad før ultralydhomogeniseringen.
- Homogeniser mikropartiklerne i 4 minutter med en intensitet på 93% på en ultralydhomogenisator.
- Frysefryse mikropartiklerne ved en temperatur på -64 °C i en frysetørrer og opbevar dem i en exicator til videre brug.
2. Syntese af lignin submikron partikler
- Forbered en 5 mg / ml alkali lignin vandig opløsning ved at opløse 125 mg alkali lignin i 25 ml ultrarent vand på en magnetisk omrører.
- Tilsæt langsomt 1 ml 96% EtOH til alkaliligninopløsningen.
- Omrør blandingen på en magnetisk omrører ved 500 o / min i 3 minutter.
- Forbered 50 ml af en 1% opløsning af citronsyre ved at opløse 0,5 g citronsyre i ultrarent vand til et slutvolumen på 50 ml.
- Tilsæt 7 ml 1% citronsyre dråbevis med en sprøjte med en strømningshastighed på ca. 4 ml / min til blandingen.
- Omrør blandingen fortsat i 10 minutter, hvorefter den brune, klare opløsning omdannes til en uklar, lysebrun suspension af submikronpartikler.
- Suspensionen overføres til reagensglas og centrifugeres i 30 minutter ved 15.000 × g i en ultracentrifuge ved 10 °C.
- Supernatanten opsamles til yderligere analyse, og mikropartiklerne skylles med ultrarent vand.
- Gentag skylnings-/ultracentrifugeringsprocedurerne 3x.
- Dyp beholderen med mikropartiklerne i et isbad før ultralydhomogeniseringen.
- Homogeniser mikropartiklerne ultralyd i to cyklusser på 4 minutter hver med en intensitet på 96% i en ultralydhomogenisator.
- Afkøl beholderne i 1 min efter den første cyklus.
- Frysefryse mikropartiklerne ved en temperatur på -64 °C i en frysetørrer og opbevar dem i en exicator til videre brug.
3. Syntese af naturlige flavonoidindkapslede ligninmikro-/submikronpartikler
- Gentag trin 1.1-1.5 for mikropartiklerne.
- Væg 0,08 g morin, opløs det i 1 ml EtOH, og tilsæt denne ethanolopløsning til blandingen.
- Omrør blandingen på en magnetisk omrører ved 500 o / min i 20 minutter.
- Der tilsættes dråbevis 20 ml 2 N HNO3 med en sprøjte med en strømningshastighed på ca. 150 μL/s.
- Fortsæt omrøring af blandingen i 60 min.
- Gentag trin 1.8-1.13.
- Gentag trin 2.1 for submikronpartiklerne.
- Vægt 0,04 g quercetin, opløs det i 1 ml EtOH og tilsæt denne ethanolopløsning til den alkaliske ligninvandige opløsning.
- Omrør blandingen på en magnetisk omrører ved 500 o / min i 10 min.
- Gentag trin 2.4-2.13.
4. Bestemmelse af indkapslingseffektiviteten af ligninmikro-/sumikropartikler
- Indholdet af det tilsatte bioaktive stof beregnes under proceduren for syntese af begge typer flavonoidindkapslede ligninpartikler.
- Absorptionen af flavonoid i supernatanten bestemmes spektrophototrisk efter fortynding med 96 % EtOH.
- Koncentrationen af det ikke-indesluttede morin/quercetin beregnes ved hjælp af flavonoidernes kalibreringskurver.
- Ligninmikropartiklernes indkapslingseffektivitet (EE, %) beregnes over for de naturlige flavonoider ved hjælp af ligning (1):
(1)
Hvor wo er den samlede mængde af det tilsatte bioaktive stof (mg), og wf er mængden af det frie ikke-indesluttede flavonoid (mg). - Beregn lægemiddelbelastningskapaciteten (DLC, %)-en vigtig parameter, der repræsenterer mængden af lægemiddel i partiklerne pr. vægtenhed af bærersystemet-ved hjælp af eq. (2):
(2)
Hvor wp er den samlede mængde (udbytte) af ligninmikro-/submikronpartikler opnået efter frysetørring (mg).
(1)
(2)5. Karakterisering af lignin-, mikro- og submikronpartikler
- Bestemmelse af partikelantal, størrelse og størrelsesfordeling
- Vurder partikelstørrelsen og partikelstørrelsesfordelingen af prøverne ved hjælp af en automatisk celletæller med mulighed for perletælling. Med en mikropipette tilsættes 1 μL lignin/flavonoid mikro-/submikronpartikler suspension i ultrarent vand i brønden på det tælleobjektglas, der kræves til operationen.
- Vent på, at antallet af partikler i 1 ml af suspensionen samt deres antal og fordeling efter størrelse vises i displayet på den automatiske celletæller.
BEMÆRK: Apparatet tillader lagring af data på en USB-flash. Den automatiske celletæller speciel software tillader yderligere behandling af de gemte digitale og fotofiler.
- Bestemmelse af indholdet af overfladesyre/basiske grupper af ligninpartikler ved potentiometrisk titrering
- Vægt 0,04 g lossede/flavonoidindkapslede ligninpartikler.
- De overføres til en Erlenmeyerkolbe, tilsættes 10 ml 0,1 M HCI, og kolben anbringes på en magnetomrører ved 250 omdr./min.
- Fyld en 50 ml burette med en 0,1 M standardopløsning af titranten NaOH.
- Den oprindelige pH-værdi i opløsningen i Erlenmeyerkolben måles med et pH-meter på prøvebænk, inden titreringen påbegyndes.
- Start titreringen, og mål pH-værdien af den analyserede opløsning efter hver 0,5 ml tilsat portion af titranten.
- De eksperimentelle data opbevares i en tabel, der indeholder volumenet af den anvendte titrand og den tilsvarende pH-værdi.
- Titrering stoppes, når en tilnærmelsesvis konstant værdi af pH-værdien nås ved at øge titrantopløsningens volumen.
- De eksperimentelle data afbildes i form af nul-, første- og andenafledte differentialtitreringskurver.
- De ækvivalente point og de tilsvarende ækvivalente volumener af de anvendte titranter bestemmes.
- Indholdet af de sure Aaog Abbasisgrupper på overfladen af ubelastede og flavonoidbelastede ligninpartikler beregnes ved hjælp af ligningerne (3) og (4):
, mgeq/g (3)
mgeq/g (4)
hvor Veqi er det ækvivalente rumfang (ml) NT titrantens normalitet (mgeqv/ml) VT volumenet af den titrand, der er anvendt til bestemmelsesmetoden (ml) m vægten af den analyserede prøve (g).
- Bestemmelse af pH-punktet for nulladning (pHPZC) af ligninbaserede partikler ved den faste tilsætningsmetode.
- Forbered 60 ml 0,1 M vandig opløsning af NaCl.
- Der tilsættes 9 ml 0,1 M NaCl-opløsning i hver af fem lukkede koniske kolber, og pH justeres til pHi = 2, 4, 7, 10 og 12 (hvor i = 1-5 angiver antallet af den tilsvarende opløsning) ved tilsætning af enten 0,1 M HCl eller 0,1 M NaOH. Det totale volumen af opløsningen i hver kolbe justeres nøjagtigt til 10 ml ved tilsætning af NaCl-opløsning med samme styrke.
- Der tilsættes 40 mg tørre ligninpartikler (lossede, flavonoidbelastede mikro-/submikron) til hver kolbe, og kolberne lukkes sikkert.
- Fastgør kolberne lodret på en orbitalryster, og lad dem ryste i 24 timer.
- Der tillades ligevægt i 30 min, og derefter måles supernatanternes endelige pH (pHf) i hver kolbe.
- pHf-værdier afbildes mod de tilsvarende indledende pH-værdier (pHi).
- Punktet med nulladning (pHPZC) defineres som den pH-værdi, hvor kurven ΔpH versus pHi skærer den rette linje med koordinater (pHi; pHi).
- Bestemmelse af det samlede phenolindhold (TPC) af ligninpartikler
BEMÆRK: Det totale phenolindhold (TPC) af mikro-/submikron ligninpartiklerne bestemmes via en modificeret Folin-Ciocalteu kolorimetrisk metode.- 200 μL af en vandig suspension af partikler med en koncentration på 500 μg/ml blandes med 600 μL ultrarent vand og 200 μL Folin-Ciocalteu-reagens (1:1, v/v).
- Efter 5 minutter tilsættes 1,0 ml 8%Na2CO3 og 1,0 ml Milli-Q vand til blandingen og inkuberes i mørke ved 40 °C i 30 minutter i et vandbad med intermitterende omrøring.
- Centrifuger suspensionen ved 5.300 × g i 2 min.
- Forbered et emne, der ikke indeholder partikler.
- 3,5 ml supernatant overføres i en 10 mm kvartskuvet, og absorbansen måles på et UV/Vis-spektrofotometer i det synlige område ved 760 nm mod blindprøven.
- Der udarbejdes en kalibreringskurve for gallinsyrestandarden efter trin 5.3.1-5.3.5. kun i stedet for 200 μL ligninpartikelsuspensionen anvendes ethanolopløsningen af gallinsyre med startkoncentrationer på 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 og 200 μg / ml.
- Mikropartiklernes eksperimentelle data udtrykkes som mg gallinsyreækvivalenter i milligram pr. gram tør prøve (mg GAE/g).
- Beregn TPC ved hjælp af ligning (5):
mg GAE/g (5)
hvor CGA er prøvens koncentration svarende til koncentrationen af gallinsyrestandarden opnået ved hjælp af syrens kalibreringsplot (μg GA/ml) Cs er prøvens koncentration, som er lig med tørprøvens masse divideret med opløsningsmidlets volumen (μg/ml).
, mgeq/g (3)
mgeq/g (4)
mg GAE/g (5)6. Bestemmelse af ligninpartiklers in vitro-frigivelseskapacitet
- Der fremstilles 250 ml simuleret enzymfrit gastrisk medium ved at justere pH-værdien i PBS-standardopløsningen med 0,1 M HCl til pH = 1,2.
- Der fremstilles 250 ml af hver af de to simulerede tarmvæskeopløsninger ved at justere PBS-standardopløsningens pH med 0,1 M NaOH/0,1 M HCl til henholdsvis pH = 6,8 og 7,4.
- Der tilsættes 25 mg flavonoidindkapslede mikro-/submikronpartikler til 50 ml af det simulerede enzymfrie gastriske medium i en glasbatchreaktor, der forsynes med en mekanisk omrører, og anbringes i et termisk vandbad ved en konstant temperatur på T = 37 ± 0,2 oC.
- Dyp omrøreren til en dybde på 2/3 af væskevolumenet for at sikre fuld blanding af de faste og flydende faser og sikre maksimal masseoverførsel uden stillestående zoner.
- Der udtages 1 ml prøve fra reaktoren hvert 10. minut indtil det 90. minut, og der pipetteres straks 1 ml frisk simuleret væskeopløsning ind i reaktoren for at forhindre ændring af det samlede volumen og for at sikre synkeforholdene.
- Gentag den samme procedure, herunder trin 6.3-6.6 med begge simulerede tarmvæskeopløsninger med henholdsvis pH = 6,8 og 7,4 i 200 minutter.
- Udfør analoge eksperimenter med ubelastede ligninpartikler i de tre simulerede medier, og brug prøverne som blindprøver til nulstilling af spektrofotometeret.
- Absorptionen af prøverne bestemmes spetromotermt efter filtrering af prøverne og fortynding med 96% EtOH mod blindprøverne fra trin 6.7, og den tilsvarende flavonoidkoncentration beregnes ved hjælp af de tilsvarende kalibreringskurver for morin opnået ved pH = henholdsvis 1,2, 6,8 og 7,4.
- Bioflavonoidernes kumulative frigivelse (CR) beregnes ved hjælp af ligning (6) i μg/ml og den kumulative frigivelsesprocent (CRP) ved ligning (7):
(6)
hvor Ci og Ci+1 er koncentrationerne af morin/quercetin i deni'te og (i+1)te prøve (μg/ml) Vs prøvevolumenet udtaget fra batchreaktoren (ml) V det samlede volumen af det simulerede medie (ml).
(7)
HvorCmax er den maksimale koncentration af den biologisk aktive forbindelse i bæreren (μg/ml).
(6)
(7)7. Statistiske analyser
- Eksperimentelle data udtrykkes som middel ± standardafvigelser (SD) for tre uafhængige målinger.
- Bestem den statistiske signifikans af forsøgsresultaterne ved at udføre ANOVA-testen som post-hoc-test. Overvej en værdi af p < 0,05 statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En anti-opløsningsmiddeludfældningsteknik blev udført for at producere alkaliske ligninmikro-/submikronpartikler. En vandig opløsning af fortyndet uorganisk syre-salpetersyre / organisk syre-citronsyre blev dispergeret i en alkali lignin vandig opløsning, beriget med et miljøvenligt overfladeaktivt stof / ethanol, hvilket resulterede i gradvis udfældning af biopolymer opløst stof, og efter sonikering blev der endelig fremstillet en suspension af kompakte mikro- / submikronpartikler (figur 1).
Figur 1: Homogenisering af ligninpartikler. (A) Ultralydhomogenisering af de syntetiserede ligninsubmikronpartikler; B) Homogeniserede morinbelastede og ubelastede ligninmikropartikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Størrelsen, antallet og størrelsesfordelingen af de ubelastede og morinindkapslede ligninmikrobærere blev bestemt (figur 2). De eksperimentelle data viste højere koncentration, 1 × 107 partikler / ml (2.037 partikler / μL) og højere gennemsnitlig størrelse, 6,1 μm, af de bioflavonoidbelastede mikrobærere (figur 2B) end de ubelastede med en koncentration på 7,4 × 106 partikler / ml (1.474 partikler / μL) og gennemsnitlig størrelse på 5,7 μm (figur 2A). Den procentvise størrelsesfordeling af begge typer partikler inden for størrelsesområdet 3-6 μm var 75,2% for de ubelastede og 69,3% for de morinindkapslede mikrobærere og henholdsvis 20,2% og 25,2% inden for området 7-10 μm. Mængden, koncentrationen og strømningshastigheden af antisolventet, salpetersyre, er afgørende for partiklernes størrelse. Den højere koncentration og større mængde syre fører til større partikler, mens den højere strømningshastighed fremkalder aggregering af suspensionen.
Figur 2: Partikelstørrelsesfordeling. A) Faktisk størrelsesfordeling af ubelastede ligninmikropartikler i 1 μL suspensionssoftware i partikeltælleren. B) faktisk størrelsesfordeling af morinindkapslede alkaliske ligninmikropartikler i 1 μL suspensionssoftware i partikeltælleren. C) Partikeltællermikroskopisk foto af fordelingen af de ubelastede ligninmikropartikler D) mikroskopisk partikeltællerfoto af fordelingen af de morinindkapslede alkaliske ligninmikropartikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 viser UV/Vis-absorptionsspektrene for ethanolmorinopløsninger, vandige alkaliligninopløsninger og blandinger, der indeholder morin og lignin med forskellige startkoncentrationer. Det er klart, at absorptionstoppene for rent lignin og bioflavonoid ikke falder sammen, og heteropolymeren udøver ingen forstyrrende indflydelse under den anvendte spektrofotometriske metode til bestemmelse af morinkoncentrationen i væskefasen efter indkapsling af flavonoid i polymermikrobærerne og under in vitro-frigivelsesforsøgene. Den maksimale absorption af morin i tokomponentblandingen skiftede til en højere bølgelængde, fra λmax = 359 nm til λmax = 395 nm som et resultat af den øgede pH i mediet på grund af tilstedeværelsen af alkalilignin. Sidstnævnte afvigelse af absorptionsmaksimum i det synlige område fremkaldte nødvendigheden af udformningen af kalibreringskurver for morin ved forskellige pH-værdier af mediet (figur 4A). De tre standardkurver, der er kendetegnet ved meget stærke lineære korrelationer, blev bevist ved de høje værdier af regressionskoefficienterne (R2 > 0,99) inden for morinkoncentrationsområdet Co = 2,5-100 μg/ml. Tilsvarende viste de tre standardkurver for quercetin i de tre simulerede fysiologiske rum, vist i figur 4B, høj linearitet inden for samme koncentrationsområde.
Figur 3: Sammenligning af UV/Vis-spektrene af ethanolopløsninger af morin, vandige alkaliske ligninopløsninger og blandinger indeholdende morin og lignin med forskellige startkoncentrationer. Spektrene af ren lignin og morin falder ikke sammen, og heteropolymeren udøver ingen forstyrrende indflydelse. Tilsætningen af lignin til morin fører til forskydning af den maksimale absorption af morin til en højere bølgelængde, fra λmax = 359 nm til λmax = 395 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kalibreringskurver for ethanoliske flavonoidopløsninger. (A) Morin og (B) quercetin inden for koncentrationsområdet Co = 2,5-100 μg/ml ved pH = 1,2 (i blåt) (svarende til simuleret mavevæske), pH = 6,8 (i rødt) (svarende til simuleret tyndtarmsvæske) og pH = 7,4 (i grønt) (svarende til simuleret tyktarmsvæske). Klik her for at se en større version af denne figur.
Den relative koncentration af sure og basiske aktive steder/funktionelle grupper på overfladen af de ubelastede og belastede alkaliske ligninpartikler blev bestemt ved potentiometrisk titrering. Beregningerne var baseret på de ækvivalente titrantvolumener bestemt af de andre afledte differentielle titreringskurver (figur 5). Værdierne af de bestemte pKa, koncentrationer af sure (stærke, svage, totale) funktionelle grupper og pH og pHpzc af mikro- og submikronpartiklerne er vist i tabel 1.
Figur 5: Anden afledte differentialpotentiometriske titreringskurve for de ubelastede og indlæste ligninmikro-/submikronpartikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Parameter | lignin mikropartikler | Morin-indkapslede ligninmikropartikler | lignin submikron partikler | Quercetin-indkapslede lignin submikron partikler |
| Vækv., ml | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| pKa | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa (stærk), mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa (svag), mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa (i alt), mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH (vandig suspension) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| pHpzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
Tabel 1: Værdier for det ækvivalente volumen af titrand (Veq), den negative base -10 logaritme af syredissociationskonstanten (pKa), koncentrationer af sure (stærke, svage, totale) funktionelle grupper (Aa, mgeq/g), pH og punkt med nulladning (pHpzc) af de ubelastede og indlæste ligninmikro- og submikronpartikler. Mikro- og submikron-, ubelastede og flavonoidbelastede ligninpartikler er negativt ladede, fordi deres pH >pH pzc.
Det totale phenolindhold (TPC), bestemt ved en modificeret Folin-Ciocalteu-kolorimetrimetode og beregnet som gallinsyreækvivalenter, var 78,2 mg GAE/g af de ubelastede ligninpartikler, mens værdien af TPC for de morinindkapslede mikrobærere med samme koncentration var 2,3 gange højere (183,43 mg GAE/g). Sidstnævnte indikerer, at heterobiopolymerpartiklerne er beriget med yderligere phenolgrupper på grund af inkorporeringen af flavonoidmolekylerne. Flavonoidindkapslingseffektiviteten var: 98,1% for morin og 97,6% for quercetin. Lægemiddelindkapslingskapaciteten var 28,2% for de morinbelastede mikropartikler og 39,0% for de quercetinindkapslede submikronpartikler.
Den in vitro kumulative frigivelse af morin og quercetin blev undersøgt i simulerede gastrointestinale enzymfrie medier: mave-, små tarm- og tyktarmsvæsker ved pH = henholdsvis 1,2, 6,8 og 7,4 (figur 6). Den højeste frigivelseseffektivitet på ca. 24% blev opnået efter 30-40 min ved pH = 6,8. Ifølge de eksperimentelle resultater var mængden af det frigivne flavonoid i det simulerede tyndtarmsmedium fremherskende to gange det, der blev frigivet i det simulerede tyktarmsmiljø, og tre gange frigivelseseffektiviteten bestemt i maven. Det højeste omfang af quercetinfrigivelse etableret i SIF ved pH = 7,4 på 70th- 90th min var 34%, hvilket overgik den kumulative frigivelse af flavonoid i SGF (pH = 1,2) og SIF (pH = 6,8) ved 23,5% og 18% respektfuldt.
Figur 6: Sammenlignende analyser af den kumulative in vitro frigivelseseffektivitet af morin og quercetin fra ligninmikro- og submikronpartikler i simulerede fysiologiske medier. Det højeste omfang af morinfrigivelse blev opnået i simuleret tyndtarmsmedium. Den højeste frigivelseseffektivitet af quercetin blev registreret i simuleret tyktarmsvæske. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blandt de vigtigste kritiske spørgsmål i moderne syntesemetoder til design af lægemiddelbærerformuleringer baseret på biopolymerer er anvendelsen af farlige organiske reagenser - flygtige og brandfarlige opløsningsmidler, såsom tetrahydrofuran, acetone, methanol og endda DMSO i høje koncentrationer - hvilket begrænser deres anvendelighed i biomedicin, farmaceutisk industri og fødevareteknologi på grund af manifestationen af mulige toksiske virkninger20, 21,22,23,24. Et andet afgørende punkt er involvering af komplicerede kemiske reaktioner (fx esterificering, polymerisation) eller dyre apparater under synteseproceduren. Begge teknikker, der præsenteres i det nuværende manuskript, overvinder sidstnævnte begrænsninger ved implikationen af alternative opløsningsmidler (vand) og ikke-toksiske forbindelser såsom overfladeaktive stoffer (Tween 80) og tværbindingsmidler (ethanol, citronsyre), der klassificerer dem som "grønne" syntesemetoder. Desuden tilbyder metoderne en løsning, der opfylder den kritiske nødvendighed og trang til udvikling af billige, miljøvenlige, bæredygtige procedurer til design af ligninpartikler, der tjener som bionedbrydelige, bioaktive og biokompatible bæreskabeloner af fysiologisk aktive stoffer25.
For at opnå ligninpartikler med den ønskede størrelse blev der valgt to produktionsbetingelser: en med høj ligninkoncentration (50 g/l) og salpetersyre som antiopløsningsmiddel og en anden med lavere ligninkoncentration (5 g/l), ethanol som antiopløsningsmiddel og citronsyre, der spillede en dobbelt rolle som antisolvent og tværbindingsmiddel samtidigt, da disse var de to variabler, der påvirkede ligninpartiklernes størrelse. Strømningshastigheden under begge procedurer blev holdt lav for at tilvejebringe mindre partikler og for at forhindre deres aggregering. Der er nogle kritiske punkter, der skal overvejes med hensyn til valget af de uorganiske og organiske syrer til synteseprotokollerne.
Salpetersyre blev valgt, fordi det er en stærk uorganisk syre, som giver en høj grad af udfældning af alkalilignin, og ved at kontrollere hastigheden af dens tilsætning kan partikler opnås inden for det ønskede størrelsesområde. Desuden forventes det, at tilsætningen afHNO3 kunne tilvejebringe modifikation af heteropolymerpartiklerne på grund af sandsynlige kemiske ændringer af ligninstruktur forbundet med: processer med nitreringssubstitutionsreaktioner af H-atomer i benzenringene med -NO2-grupper ; esterificering af alifatiske -OH-grupper og dannelsen af esterfunktionelle grupper; og/eller oxidation af phenol-OH- og -OCH3-grupper , hvilket resulterer i dannelse af quinonstrukturer. Med hensyn til bundfældnings- og ligninkoncentrationens rolle for størrelsen af de syntetiserede partikler førte på den ene side den højere indledende ligninkoncentration kombineret med tilsætningen af den stærke salpetersyre (pKa = -1,4) og den begrænsede opløselighed af alkaliheteropolymeren i den uorganiske syre til produktion af partikler inden for mikrometerområdet. På den anden side fremkalder tilsætningen af ethanol til den vandige opløsning af alkalilignin med den lavere koncentration dannelsen af en fin suspension på grund af den delvise opløselighed af alkalilignin i alkoholen. Desuden førte den efterfølgende tilsætning af citronsyre til produktion af partikler inden for nanometerområdet, fordi den organiske syre er svagere (pKa1 = 3,13) end salpetersyre, hvilket giver lavere nedbørsforlængelse.
Nogle grundlæggende egenskaber ved nanostørrelse lægemidler er lægemiddelcirkulation, lægemiddelfrigivelse fra doseringsformer på bestemte steder og absorption gennem biologiske membraner. Disse egenskaber påvirkes betydeligt af nogle fysiske og kemiske egenskaber hos nanopartikelbærerne og af de indkapslede lægemiddelmolekyler.
Biopolymerbærernes fysisk-kemiske egenskaber: koncentration af overfladeaktive sure og basiske grupper, punkt med nulladning (pHPZC), størrelse, partikelstørrelsesfordeling samt partiklernes spektrale egenskaber før og efter inkorporering af det bioaktive stof er væsentlige parametre, der skal tages i betragtning ved evaluering af de funktionelle grupper, reaktivitet, Partiklernes stabilitet og homogenitet10.
Partikelstørrelse, partikelstørrelsesfordeling, ladning og morfologi er blandt de vigtigste faktorer, der påvirker disse evalueringer. Partikelstørrelse påvirker deres stabilitet, reaktivitet og lægemiddelfrigivelsesadfærd26. Mindre partikler tilbyder et større masseoverførselsområde, hvilket fører til en højere lægemiddelfrigivelseshastighed. I modsætning hertil resulterer det mindre masseoverførselsoverfladeareal af større partikler i en lavere hastighed af lægemiddeldiffusion inde i disse partikler.
Anvendelsen af titrimetriske metoder som grundlæggende teknikker til bestemmelse af sure og basiske steder og funktionelle grupper, der er til stede på faste overflader, udvides konstant. De vigtigste fordele ved potentiometrisk titrering omfatter tids- og arbejdsbesparende, høj præcision og eliminering af referencestandarder og dyre apparater. Metoden blev anvendt i denne undersøgelse, da den tillader karakterisering af biopolymerpartikler ved kvalitativ og semikvantitativ bestemmelse af arten og antallet af aktive steder, der er til stede på overfladen af lastede og lossede biopolymerbærere27.
Overfladeladningen af biologiske og medicinske mikro-/nanobærere spiller en vigtig rolle i cellulær optagelse28. PH-PZC svarer til nul overfladeladningstæthed, det vil sige til ækvivalente mængder negative og positive ladninger udviklet af protonligevægte. Bestemmelsen af disse værdier giver oplysninger om adsorptionsspecificiteten29. Da parameteren isoelektrisk punkt imidlertid kun repræsenterer de eksterne overfladeladninger af partikler i suspension, mens punktet med nulladning varierer som reaktion på partiklernes samlede nettooverfladeladning (ekstern og intern), blev pHpzc-protokollen anvendt for første gang i denne undersøgelse som en enkel og effektiv metode til karakterisering af biopolymerlægemiddelbærere. Ifølge begrebet pHpzc, ved pH over pHpzc, er overfladen af biopolymerpartiklerne overvejende negativt ladet, mens en netto positiv ladning observeres, når suspensionens pH er under pHpzc. Ud fra de eksperimentelle data, der præsenteres i tabel 1, kunne det konkluderes, at mikro- og submikron-, ubelastede og flavonoidbelastede ligninpartikler er negativt ladede, fordi deres pH >pH pzc.
Effektiviteten af flavonoidbelastning påvirkes af indkapslingseffektivitet og lægemiddelbelastningskapacitet. Indkapslingseffektivitet (E, %) defineres som forholdet mellem mængden af lægemidlet inkorporeret i partiklerne og den samlede mængde i formuleringen. Indkapslingseffektiviteten påvirkes af lægemiddelegenskaber, opløsningsmidlet og bæreren30.
Den effektive levering af et fysiologisk aktivt stof afhænger imidlertid af den måde og i hvilket omfang dets molekyler frigives fra bærermatrixen. Det er således meget vigtigt at overveje lægemiddelfrigivelsesmekanismen og frigivelseshastigheden 31,32,33. Ved at belyse in vitro-frigivelsesmekanismen for bioflavonoider fra deres biopolymere mikro-/nanobærere kan man simulere og forudsige flavonoidets og bærerens opførsel i et reelt fysiologisk medium og optimere designet af farmaceutiske formuleringer med forbedret biotilgængelighed. De eksperimentelle in vitro-resultater opnået i denne undersøgelse er nyttige til klinisk praksis, da de viser, at på grund af det lavere omfang af morin / quercetinfrigivelse fra ligninsubmikron og mikropartikler i mavemiljøet er de innovative biopolymerpartikler egnede til oral administration på grund af den lavere risiko for gastrisk irritation sammenlignet med direkte oral administration af de bioaktive stoffer. De innovative biopolymermikropartikler er egnede til oral administration på grund af den lavere risiko for gastrisk irritation sammenlignet med direkte oral administration af de bioaktive stoffer. Desuden kan submikronpartiklerne på grund af deres lille størrelse og betydelige frigivelsespotentiale anvendes som injicerbare formuleringer. Derudover giver de nye ligninmikro- og submikronbærere mulighed for at overvinde de begrænsninger, som andre forskere har rapporteret i forbindelse med vanskeligheder forbundet med oral administration af høje doser af visse bioflavonoider som følge af deres tendens til at danne mættede opløsninger i tarmkanalen, hvilket igen hindrer opløsningsprocessen og deres effektive resorption.
Den lette syntese, biokompatibiliteten af de resulterende partikler samt muligheden for tilpasning af den nuværende protokol repræsenterer de største fordele ved den præsenterede metode. Partiklernes størrelse er optimal til deres tilsigtede anvendelser, idet der er tilstrækkeligt overfladeareal til rådighed til fastgørelse af terapi og målretning, hvilket igen ikke kræver, at flere partikler administreres for at nå måldoseringskravene. Anvendelsen af lignin som den grundlæggende heteropolymermatrix til syntese af innovative partikler muliggør øget biokompatibilitet og tilbyder forskellige aktive funktionelle grupper, der giver mulighed for tilpasning af partiklerne til forskellige applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af den bulgarske videnskabelige fond under kontrakt nr. KΠ-06 H59/3 og af videnskabeligt projekt nr. 07/2023 FVM, Trakia Universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
References
- Yu, X., et al. Lignin nanoparticles with high phenolic content as efficient antioxidant and sun-blocker for food and cosmetics. ACS Sustainable Chem. Eng. 11 (10), 4082-4092 (2023).
- Boarino, A., Klok, H. -A. Opportunities and challenges for lignin valorization in food packaging, antimicrobial, and agricultural applications. Biomacromolecules. 24 (3), 1065-1077 (2023).
- Aadil, K., Barapatre, A., Jha, H. Synthesis and characterization of Acacia lignin-gelatin film for its possible application in food packaging. Bioresour. Bioprocess. 3 (27), 1-11 (2016).
- Sharma, S., et al. Valorization of lignin into nanoparticles and nanogel: characterization and application. Bioresour. Technol. Reports. 18, 101041 (2022).
- Zadeh, E. M., O'Keefe, S. F., Kim, Y. -T.
- Beaucamp, A., et al. Lignin for energy applications - state of the art, life cycle, technoeconomic analysis and future trends (Critical Review). Green Chem. 24, 8193-8226 (2022).
- Antunes, F., et al. From sugarcane to skin: Lignin as a multifunctional ingredient for cosmetic application. Int J Biol Macromol. 234, 123592 (2023).
- Garg, J., et al. Applications of lignin nanoparticles for cancer drug delivery: An update. Materials Letters. 311, 131573 (2022).
- Anushikha, K. K. Lignin as a UV blocking, antioxidant, and antimicrobial agent for food packaging applications. Biomass Conv. Bioref. , 1-14 (2023).
- Freitas, F. M. C., et al. synthesis of lignin nano- and micro-particles: Physicochemical characterization, bioactive properties and cytotoxicity assessment. Int J Biol Macromol. 163, 1798-1809 (2020).
- Rismawati, R., Nurdin, I. A., Pradiptha, M. N., Maulidiyah, A., Mubarakati, N. J. Preparation and characterization of lignin nanoparticles from rice straw after biosynthesis using Lactobacillus bulgaricus. Journal of Physics: Conference Series. 9th International Seminar on New Paradigm and Innovation of Natural Sciences and its Application. 1524, 012070 (2020).
- Worku, L. A., et al. Synthesis of lignin nanoparticles from Oxytenanthera abyssinica by nanoprecipitation method followed by ultrasonication for the nanocomposite application. Journal of King Saud University - Science. 35 (7), 102793 (2023).
- Gala Morena, A., Tzanov, T. z Antibacterial lignin-based nanoparticles and their use in composite materials. Nanoscale Adv. 4, 4447-4469 (2022).
- Ivanova, D., Nikolova, G., Karamalakova, Y., Marutsova, V., Yaneva, Z. Water-soluble alkali lignin as a natural radical scavenger and anticancer alternative. Int J Mol Sci. 24 (16), 12705 (2023).
- Ivanova, D., Toneva, M., Simeonov, E., Antov, G., Yaneva, Z. Newly synthesized lignin microparticles as bioinspired oral drug-delivery vehicles: Flavonoid-carrier potential and in vitro radical-scavenging activity. Pharmaceutics. 15 (4), 1067 (2023).
- Yaneva, Z., et al. Antimicrobial potential of conjugated lignin/morin/chitosan combinations as a function of system complexity. Antibiotics. 11, 650 (2022).
- Handral, H. K., Wyrobnik, T. A., Lam, A. T. -L. Emerging trends in biodegradable microcarriers for therapeutic applications. Polymers. 15 (6), 1487 (2023).
- Figueiredo, P., Lintinen, K., Hirvonen, J. T., Kostiainen, M. A., Santos, H. A. Properties and chemical modifications of lignin: Towards lignin-based nanomaterials for biomedical applications. Prog. Mater. Sci. 93, 233-269 (2018).
- Tang, Q., et al. Lignin-based nanoparticles: a review on their preparations and applications. Polymers. 12 (11), Basel. 2471 (2020).
- Zhao, W., Simmons, B., Singh, S., Ragauskas, A., Cheng, G. From lignin association to nano-/micro-particle preparation: extracting higher value of lignin. Green Chemistry. 18 (21), 5693-5700 (2016).
- Stewart, H., Golding, M., Matia-Merino, L., Archer, R., Davies, C. Manufacture of lignin microparticles by anti-solvent precipitation: Effect of preparation temperature and presence of sodium dodecyl sulfate. Food Res Int. 66, 93-99 (2014).
- Beisl, S., Friedl, A., Miltner, A. Lignin from micro- to nanosize: Applications. Int. J. Mol. Sci. 18, 2367 (2017).
- Mishra, P. K., Ekielski, A. A simple method to synthesize lignin nanoparticles. Colloids Interfaces. 3, 52 (2019).
- Qian, Y., Deng, Y., Qiu, X., Li, H., Yang, D. Formation of uniform colloidal spheres from lignin, a renewable resource recovered from pulping spent liquor. Green Chem. 16, 2156-2163 (2014).
- Tardy, B. L., et al. Lignin nano- and microparticles as template for nanostructured materials: formation of hollow metal-phenolic capsules. Green Chem. 20, 1335-1344 (2018).
- Silva, M., et al. Paraquat-loaded alginate/chitosan nanoparticles: preparation, characterization and soil sorption studies. J Haz Mat. 190 (1-3), 366-374 (2011).
- Georgieva, N., Yaneva, Z. Comparative evaluation of natural and acid-modified layered mineral materials as rimifon-carriers using UV/VIS, FTIR, and equilibrium sorption study. Cogent Chem. 1 (1), 1-16 (2015).
- Zhang, P., Chen, D., Li, L., Sun, K. Charge reversal nano-systems for tumor therapy. J Nanobiotechnol. 20, 31 (2022).
- Yaneva, Z. L., Georgieva, N. V. Removal of diazo dye from the aqueous phase by biosorption onto ball-milled maize cob (BMMC) biomass of Zea mays. Maced. J. Chem. Chem. Eng. 32 (1), 133-149 (2013).
- Zatorska, M., et al. Drug-loading capacity of polylactide-based micro- and nanoparticles - Experimental and molecular modeling study. Int J Pharmaceutics. 591, 120031 (2020).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Chapter 5 - Physicochemical and morphological characterization of pharmaceutical nanocarriers and mathematical modeling of drug encapsulation/release mass transfer processes. Nanoscale Fabrication, Optimization, Scale-Up and Biological Aspects of Pharmaceutical Nanotechnology. Grumezescu, A. M. , William Andrew Publishing. 173-218 (2018).
- Yaneva, Z., Georgieva, N., Staleva, M. Development of d,l-α-tocopherol acetate/zeolite carrier system: equilibrium study. Monatshefte fur Chemie Chemical Monthly. 147 (7), 1167-1175 (2016).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Study on the physical chemistry, equilibrium, and kinetic mechanism of Azure A biosorption by Zea mays biomass. Journal of Dispersion Science and Technology. 35 (2), 193-204 (2014).
