Summary
Descriviamo nuove e semplici metodologie di sintesi e caratterizzazione di particelle biocompatibili di lignina micro e submicronica. Queste formulazioni forniscono un approccio facile per l'utilizzo dell'eteropolimero, nonché un'alternativa per la progettazione razionale di matrici carrier multifunzionali con potenziale applicabilità in biomedicina, tecnologia farmaceutica e industria alimentare.
Abstract
L'applicabilità della micro/nanotecnologia dei biopolimeri nella medicina umana, veterinaria, farmaceutica e alimentare è in rapida crescita grazie al grande potenziale delle particelle a base di biopolimeri come efficaci sistemi di trasporto. L'utilizzo della lignina come biomatrice eteropolimerica di base per la progettazione di formulazioni innovative micro/submicroniche consente il raggiungimento di una maggiore biocompatibilità e offre vari gruppi funzionali attivi presentando opportunità di personalizzazione delle proprietà fisico-chimiche e delle bioattività delle formulazioni per diverse applicazioni. Lo scopo del presente studio è stato quello di sviluppare una metodologia semplice ed ecologica per la sintesi di particelle di lignina di dimensioni micro e submicroniche; valutarne le caratteristiche fisico-chimiche, spettrali e strutturali; ed esaminare la loro capacità di incapsulamento di molecole biologicamente attive e il potenziale per il rilascio in vitro di bioflavonoidi in terreni gastrointestinali simulati. Le metodologie presentate applicano solventi economici e verdi; processi facili, diretti, rapidi e sensibili che richiedono poche attrezzature, sostanze non tossiche e metodi semplici per la loro caratterizzazione, la determinazione della capacità di incapsulamento nei confronti dei composti bioattivi scarsamente solubili in acqua Morin e Quercetina e il potenziale di rilascio in vitro delle matrici di lignina.
Introduction
Al giorno d'oggi l'inclinazione verso biopolimeri come cellulosa, chitosano, collagene, destrano, gelatina e lignina come precursori per la progettazione di vettori micro/submicronici con dimensioni, proprietà fisico-chimiche e biofunzionalità personalizzabili è aumentata nelle industrie biomediche, farmaceutiche e della tecnologia alimentare grazie alla loro applicabilità nell'ingegneria tissutale, nel bioprinting 3D, nella vitro piattaforme di modellazione delle malattie, industria dell'imballaggio, preparazione di emulsioni e somministrazione di nutrienti tra gli altri 1,2,3.
Nuovi studi evidenziano gli aspetti degli idrogel a base di lignina e delle micro e nanoformulazioni4 come veicoli vantaggiosi utilizzati per i materiali di imballaggio alimentare5, l'accumulo di energia6, i cosmetici7, gli stabilizzanti termici/fotoelettrici, i materiali rinforzati e le matrici di vettori di farmaci8 per la somministrazione di molecole idrofobiche, il miglioramento delle barriere UV9, come agenti di rinforzo nei nanocompositi e come alternativa alle nanoparticelle inorganiche a causa di alcuni recenti problemi di sicurezza 10,11,12. La ragione alla base di questa tendenza è la biocompatibilità, la biodegradabilità e la non tossicità del biopolimero etero naturale, nonché le sue comprovate bioattività di potenziale antiossidante della lignina e attività antimicrobiche, antiproliferative e antimicrobiche 13,14,15,16,17.
La letteratura scientifica riporta vari metodi per la sintesi (autoassemblaggio, precipitazione anti-solvente, precipitazione acida e spostamento del solvente)18 e la caratterizzazione di formulazioni su micro/nanoscala a base di lignina, inclusa l'applicazione di solventi costosi o dannosi come tetraidrofurano (THF), dimetilsolfossido (DMSO), N,N-dimetilformammide (DMF) e acetone e processi complicati, indiretti e noiosi che utilizzano molte apparecchiature e sostanze tossiche 12,19,20.
Per superare questi ultimi svantaggi, i seguenti protocolli presentano nuove metodologie per la sintesi di particelle micro-/submicroniche a base di lignina utilizzando solventi economici e verdi; Processi facili, diretti, rapidi e sensibili che richiedono poche attrezzature, sostanze non tossiche e metodi semplici per la loro caratterizzazione e la determinazione della capacità di incapsulamento verso composti bioattivi scarsamente solubili in acqua e potenziale di rilascio in vitro delle matrici di lignina. I metodi di produzione su scala di laboratorio presentati sono vantaggiosi per la produzione di vettori funzionali di lignina con dimensioni regolabili, elevata capacità di incapsulamento e comportamento di rilascio in vitro sostenibile utilizzando semplici procedure di caratterizzazione e sostanze chimiche ecologiche che possono trovare applicazione in varie aree delle scienze biomediche e della tecnologia alimentare. Due flavonoidi sono stati applicati come molecole bersaglio incapsulate nelle particelle di lignina: morin nelle microparticelle e quercetina nelle particelle submicroniche. La differenza nelle strutture di entrambi i flavonoidi è solo la posizione del secondo gruppo -OH nell'anello aromatico B: il gruppo -OH è in posizione 2' nella morina e in posizione 3' nella quercetina, quindi entrambi i composti organici sono isomeri posizionali. Quest'ultimo fatto presuppone un comportamento simile di entrambi i composti naturali bioattivi nei processi di incapsulamento e/o rilascio.
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Protocol
1. Sintesi di microparticelle di lignina
- Preparare una soluzione acquosa di lignina alcalina 50 mg/mL sciogliendo 2,5 g di lignina alcalina in 50 mL di acqua ultrapura su un agitatore magnetico.
- Preparare la soluzione Tween 80 all'1% sciogliendo 1 mL di Tween 80 in 100 mL di acqua ultrapura.
- Preparare una soluzione 2 M di HNO3 diluendo 6,65 mL di HNO3 al 67% (densità = 1,413 g/mL) con acqua ultrapura fino a un volume finale di 50 mL.
- Aggiungere lentamente 15 mL della soluzione Tween 80 all'1% a 50 mL della soluzione di lignina alcalina da 50 mg/mL.
- Agitare la miscela su un agitatore magnetico a 500 giri/min per 10 minuti in modo che il tensioattivo si disperda bene.
- Aggiungere alla miscela 20 mL di 2 M HNO3 goccia a goccia con una siringa a una velocità di flusso di circa 150 μL/s.
- Continuare a mescolare la miscela per 30 minuti quando la soluzione marrone scuro si trasforma in una sospensione marrone chiaro di microparticelle.
- Trasferire la sospensione in provette da 1,5-2 mL e centrifugare per 30 minuti a 15.000 × g in un'ultracentrifuga a 10 °C.
- Raccogliere il surnatante per ulteriori analisi e sciacquare le microparticelle con acqua ultrapura.
- Ripetere le procedure di risciacquo/ultracentrifugazione 3 volte.
- Immergere il contenitore con le microparticelle in un bagno di ghiaccio prima dell'omogeneizzazione a ultrasuoni.
- Omogeneizzare le microparticelle per 4 minuti a un'intensità del 93% su un omogeneizzatore a ultrasuoni.
- Liofilizzare le microparticelle a una temperatura di -64 °C in un liofilizzatore e conservarle in un ecciatore per un ulteriore utilizzo.
2. Sintesi di particelle submicroniche di lignina
- Preparare una soluzione acquosa di lignina alcalina da 5 mg/mL sciogliendo 125 mg di lignina alcalina in 25 mL di acqua ultrapura su un agitatore magnetico.
- Aggiungere lentamente 1 mL di EtOH al 96% alla soluzione di lignina alcalina.
- Agitare la miscela su un agitatore magnetico a 500 giri/min per 3 minuti.
- Preparare 50 mL di una soluzione all'1% di acido citrico sciogliendo 0,5 g di acido citrico in acqua ultrapura fino a un volume finale di 50 mL.
- Aggiungere alla miscela 7 mL di acido citrico all'1% per via gocciolina con una siringa a una velocità di flusso di circa 4 mL/min.
- Continua a mescolare la miscela per 10 minuti quando la soluzione marrone trasparente si trasformerà in una sospensione torbida marrone chiaro di particelle submicroniche.
- Trasferire la sospensione in provette e centrifugare per 30 minuti a 15.000 × g in un'ultracentrifuga a 10 °C.
- Raccogliere il surnatante per ulteriori analisi e sciacquare le microparticelle con acqua ultrapura.
- Ripetere le procedure di risciacquo/ultracentrifugazione 3 volte.
- Immergere il contenitore con le microparticelle in un bagno di ghiaccio prima dell'omogeneizzazione a ultrasuoni.
- Omogeneizzare le microparticelle ad ultrasuoni per due cicli di 4 minuti ciascuno ad un'intensità del 96% in un omogeneizzatore ad ultrasuoni.
- Raffreddare i contenitori per 1 minuto dopo il primo ciclo.
- Liofilizzare le microparticelle a una temperatura di -64 °C in un liofilizzatore e conservarle in un ecciatore per un ulteriore utilizzo.
3. Sintesi di particelle di lignina micro/submicronica incapsulate da flavonoidi naturali
- Ripetere i passaggi 1.1-1.5 per le microparticelle.
- Pesare 0,08 g di morin, scioglierlo in 1 mL di EtOH e aggiungere questa soluzione etanolica alla miscela.
- Agitare la miscela su un agitatore magnetico a 500 giri/min per 20 minuti.
- Aggiungere alla miscela 20 mL di 2 N HNO3 goccia a goccia con una siringa a una velocità di flusso di circa 150 μL/s.
- Continuare a mescolare il composto per 60 minuti.
- Ripetere i passaggi 1.8-1.13.
- Ripetere il passaggio 2.1 per le particelle submicroniche.
- Pesare 0,04 g di quercetina, scioglierla in 1 mL di EtOH e aggiungere questa soluzione etanolica alla soluzione acquosa di lignina alcalina.
- Agitare la miscela su un agitatore magnetico a 500 giri/min per 10 minuti.
- Ripetere i passaggi 2.4-2.13.
4. Determinazione dell'efficienza di incapsulamento delle micro-/sumicro- particelle di lignina
- Calcolare il contenuto della sostanza bioattiva aggiunta durante la procedura per la sintesi di entrambi i tipi di particelle di lignina incapsulate da flavonoidi.
- Determinare spettrofotometricamente l'assorbimento del flavonoide nel surnatante ottenuto durante le fasi 1.9 e 2.8 dopo averlo diluito con EtOH al 96%.
- Calcolare la concentrazione della morin/quercetina non intrappolata utilizzando le curve di calibrazione dei flavonoidi.
- Calcolare l'efficienza di incapsulamento (EE, %) delle microparticelle di lignina verso i flavonoidi naturali utilizzando l'equazione (1):
(1)
Dove wo è la quantità totale della sostanza bioattiva aggiunta (mg) e wf è la quantità del flavonoide libero non intrappolato (mg). - Calcolare la capacità di carico del farmaco (DLC, %) - un parametro importante che rappresenta la quantità di farmaco nelle particelle per unità di peso del sistema di trasporto - utilizzando l'eq. (2):
(2)
Dove wp è la quantità totale (resa) di particelle micro/submicroniche di lignina ottenute dopo liofilizzazione (mg).
(1)
(2)5. Caratterizzazione di particelle di lignina micro e submicronica
- Determinazione del numero, della dimensione e della distribuzione granulometrica delle particelle
- Valutare la dimensione delle particelle e la distribuzione granulometrica dei campioni utilizzando un contatore automatico di celle con l'opzione per il conteggio delle microsfere. Aggiungere con una micropipetta 1 μL di particelle di lignina/flavonoidi micro/submicroniche in sospensione in acqua ultrapura nel pozzetto del vetrino di conteggio necessario per l'operazione.
- Attendere che il numero di particelle in 1 mL della sospensione, nonché il loro numero e la loro distribuzione per dimensione vengano visualizzati sul display del contatore automatico di cellule.
NOTA: L'apparecchio consente la memorizzazione dei dati su una chiavetta USB. Il software speciale del contatore automatico delle celle consente un'ulteriore elaborazione dei file digitali e fotografici salvati.
- Determinazione del contenuto di gruppi acidi/basici superficiali di particelle di lignina mediante titolazione potenziometrica
- Peso 0,04 g di particelle di lignina scaricate/incapsulate con flavonoidi.
- Trasferirli in un matraccio di Erlenmeyer, aggiungere 10 ml di HCl 0,1 M e posizionare il matraccio su un agitatore magnetico a 250 giri/min.
- Riempire una buretta da 50 ml con una soluzione standard 0,1 M del titolante NaOH.
- Misurare il pH iniziale della soluzione nel pallone di Erlenmeyer con un pHmetro da banco prima di iniziare la titolazione.
- Avviare la titolazione e misurare il pH della soluzione analizzata dopo ogni porzione aggiunta di 0,5 mL del titolante.
- Memorizzare i dati sperimentali in una tabella contenente il volume del titolante applicato e il corrispondente valore di pH.
- Interrompere la titolazione quando viene raggiunto un valore approssimativamente costante del pH aumentando il volume della soluzione titolante.
- Tracciare i dati sperimentali sotto forma di curve di titolazione differenziale zero, prima e derivata seconda.
- Determinare i punti equivalenti e i corrispondenti volumi equivalenti dei titolanti utilizzati.
- Calcolare il contenuto dei gruppi basici acidi Aae Absulla superficie delle particelle di lignina scaricate e caricate con flavonoidi utilizzando le equazioni (3) e (4):
, mgeq/g (3)
MGEQ/G (4)
dove Veqi è il volume equivalente (mL); NT la normalità del titolante (mgeqv/mL); VT il volume del titolante utilizzato per la procedura di determinazione (mL); m il peso del campione analizzato (g).
- Determinazione del punto di pH a carica zero (pHPZC) di particelle a base di lignina con il metodo dell'addizione solida.
- Preparare 60 mL di soluzione acquosa 0,1 M di NaCl.
- Aggiungere 9 mL della soluzione di NaCl 0,1 M in ciascuno dei cinque matracci conici con tappo e regolare il pH a pHi = 2, 4, 7, 10 e 12 (dove i = 1-5 indica il numero della soluzione corrispondente), rispettivamente aggiungendo 0,1 M HCl o 0,1 M NaOH. Regolare il volume totale della soluzione in ciascun matraccio a 10 mL esattamente aggiungendo una soluzione di NaCl dello stesso dosaggio.
- Aggiungere 40 mg di particelle di lignina secche (micro/submicroniche caricate con flavonoidi non carichi) in ciascun matraccio e tappare bene i palloni con un tappo sicuro.
- Fissare i palloni in posizione verticale su uno shaker orbitale e tenerli agitati per 24 ore.
- Lasciare equilibrare per 30 minuti e successivamente misurare il pH finale (pHf) dei surnatanti in ciascun matrasso.
- Tracciare i valori di pHf rispetto ai corrispondenti valori di pH iniziale (pHi).
- Il punto di carica zero (pHPZC) è definito come il valore di pH al quale la curva ΔpH rispetto a pHi interseca la retta con le coordinate (pHi; pHi).
- Determinazione del contenuto fenolico totale (TPC) delle particelle di lignina
NOTA: Il contenuto fenolico totale (TPC) delle particelle di lignina micro/submicronica viene determinato mediante un metodo colorimetrico Folin-Ciocalteu modificato.- Miscelare 200 μl di una sospensione acquosa di particelle con una concentrazione di 500 μg/mL con 600 μl di acqua ultrapura e 200 μl di reagente Folin-Ciocalteu (1:1, v/v).
- Dopo 5 minuti, aggiungere 1,0 mL di 8% Na2CO3 e 1,0 mL di acqua Milli-Q alla miscela e incubarla al buio a 40 °C per 30 minuti a bagnomaria con agitazione intermittente.
- Centrifugare la sospensione a 5.300 × g per 2 min.
- Prepara uno spazio vuoto senza particelle.
- Trasferire 3,5 mL di surnatante in una cuvetta di quarzo da 10 mm e misurare l'assorbanza su uno spettrofotometro UV/Vis nella regione visibile a 760 nm rispetto al bianco.
- Preparare una curva di taratura dell'acido gallico standard seguendo i punti 5.3.1-5.3.5; solo invece di 200 μL della sospensione di particelle di lignina, utilizzare la soluzione etanolica di acido gallico con concentrazioni iniziali di 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 e 200 μg/mL.
- Esprimere i dati sperimentali delle microparticelle come mg di equivalenti di acido gallico in milligrammi per grammo di campione secco (mg GAE/g).
- Calcola TPC usando l'equazione (5):
mg di GAE/g (5)
dove CGA è la concentrazione del campione equivalente alla concentrazione dell'acido gallico standard ottenuta dal piano di taratura dell'acido (μg GA/mL); Cs è la concentrazione del campione, che è uguale alla massa del campione secco divisa per il volume del solvente (μg/mL).
, mgeq/g (3)
MGEQ/G (4)
mg di GAE/g (5)6. Determinazione della capacità di rilascio in vitro di particelle di lignina
- Preparare 250 ml di terreno gastrico simulato privo di enzimi regolando il pH della soluzione PBS standard con 0,1 M HCl a pH = 1,2.
- Preparare 250 ml di ciascuna delle due soluzioni fluide intestinali simulate regolando il pH della soluzione PBS standard con 0,1 M NaOH/0,1 M HCl a pH = 6,8 e 7,4, rispettivamente.
- Aggiungere 25 mg di particelle micro/submicroniche incapsulate con flavonoidi a 50 mL di terreno gastrico simulato privo di enzimi in un reattore batch di vetro fornito con un agitatore meccanico e metterlo in un bagno d'acqua termale a una temperatura costante di T = 37 ± 0,2 oC.
- Immergere l'agitatore a una profondità di 2/3 del volume del liquido per garantire la completa miscelazione delle fasi solida e liquida e garantire il massimo trasferimento di massa senza zone stagnanti.
- Prelevare 1 mL di campione dal reattore ogni 10 minuti fino al 90° minuto e pipettare immediatamente 1 mL di soluzione fluida simulata fresca nel reattore per evitare la variazione del volume totale e garantire le condizioni di assorbimento.
- Ripetere la stessa procedura compresi i passaggi 6.3-6.6 con entrambe le soluzioni di fluido intestinale simulate con pH = 6.8 e 7.4, rispettivamente, per 200 minuti.
- Eseguire esperimenti analoghi con particelle di lignina scaricate nei tre mezzi simulati e utilizzare i campioni come spazi vuoti per azzerare lo spettrofotometro.
- Determinare l'assorbimento dei campioni spettrofotometricamente dopo aver filtrato i campioni e averli diluiti con EtOH al 96% rispetto ai campioni bianchi del passaggio 6.7 e calcolare la corrispondente concentrazione di flavonoidi utilizzando le corrispondenti curve di calibrazione della morina ottenute rispettivamente a pH = 1,2, 6,8 e 7,4.
- Calcolare il rilascio cumulativo (CR) dei bioflavonoidi utilizzando l'equazione (6) in μg/mL e la percentuale di rilascio cumulativo (CRP) mediante l'equazione (7):
(6)
dove Ci e Ci+1 sono le concentrazioni di morina/quercetina nell'ie (i+1)esimo campione (μg/mL); Vs il volume di campione prelevato dal reattore discontinuo (mL); V il volume totale del terreno simulato (mL).
(7)
Dove Cmax è la concentrazione massima del composto biologicamente attivo nel vettore (μg/mL).
(6)
(7)7. Analisi statistiche
- Esprimere i dati sperimentali come medie ± deviazioni standard (SD) di tre misurazioni indipendenti.
- Determinare la significatività statistica dei risultati sperimentali eseguendo il test ANOVA come test post hoc. Si consideri un valore di p < 0,05 statisticamente significativo.
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Representative Results
È stata eseguita una tecnica di precipitazione anti-solvente per produrre particelle di micro/submicron di lignina alcalina. Una soluzione acquosa di acido inorganico diluito-acido nitrico/acido organico-acido citrico è stata dispersa in una soluzione acquosa di lignina alcalina, arricchita con un tensioattivo/etanolo ecologico, che ha provocato la graduale precipitazione del soluto biopolimerico e, dopo la sonicazione, è stata infine prodotta una sospensione di particelle micro/submicroniche compatte (Figura 1).
Figura 1: Omogeneizzazione delle particelle di lignina. (A) Omogeneizzazione ad ultrasuoni delle particelle submicroniche di lignina sintetizzate; (B) Microparticelle di lignina caricate e scaricate con morin omogeneizzate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Sono state determinate le dimensioni, il numero e la distribuzione dimensionale dei microvettori di lignina scaricati e incapsulati con morin (Figura 2). I dati sperimentali hanno dimostrato una maggiore concentrazione, 1 × 107 particelle/mL (2.037 particelle/μL), e una dimensione media più elevata, 6,1 μm, dei microcarrier caricati con bioflavonoidi (Figura 2B) rispetto a quelli scaricati con una concentrazione di 7,4 × 106 particelle/mL (1.474 particelle/μL) e una dimensione media di 5,7 μm (Figura 2A). La distribuzione granulometrica percentuale di entrambi i tipi di particelle nell'intervallo di dimensioni 3-6 μm era del 75,2% per i microcarrier incapsulati in versione scarica e del 69,3% per i microcarrier incapsulati con morin e del 20,2% e del 25,2%, rispettivamente, nell'intervallo di 7-10 μm. La quantità, la concentrazione e la portata dell'antisolvente, l'acido nitrico, sono essenziali per la dimensione delle particelle. La maggiore concentrazione e quantità di acido porta a particelle più grandi, mentre la maggiore portata provoca l'aggregazione della sospensione.
Figura 2: Distribuzione granulometrica. (A) Distribuzione dimensionale effettiva delle microparticelle di lignina scaricate in 1 μL di software di sospensione del contatore di particelle; (B) distribuzione dimensionale effettiva delle microparticelle di lignina alcalina incapsulate con morin in 1 μL di software di sospensione del contatore di particelle. (C) Foto al microscopio del contatore di particelle della distribuzione delle microparticelle di lignina scaricate; (D) foto microscopica del contatore di particelle della distribuzione delle microparticelle di lignina alcalina incapsulate dal morin. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La Figura 3 presenta gli spettri di assorbimento UV/Vis delle soluzioni di etanolo morin, delle soluzioni acquose di lignina alcalina e delle miscele contenenti morin e lignina con diverse concentrazioni iniziali. Ovviamente, i picchi di assorbimento della lignina pura e del bioflavonoide non coincidono e l'eteropolimero non esercita alcuna influenza dirompente durante il metodo spettrofotometrico applicato per la determinazione della concentrazione di morina in fase liquida dopo l'incapsulamento del flavonoide nei microcarrier polimerici e durante gli esperimenti di rilascio in vitro . L'assorbimento massimo della morina nella miscela bicomponente si è spostato a una lunghezza d'onda più elevata, da λmax = 359 nm a λmax = 395 nm, a causa dell'aumento del pH del mezzo dovuto alla presenza di lignina alcalina. Quest'ultima deviazione del massimo di assorbimento nell'area visibile ha provocato la necessità di progettare curve di calibrazione del morin a vari valori di pH del mezzo (Figura 4A). Le tre curve standard caratterizzate da correlazioni lineari molto forti sono state dimostrate dagli alti valori dei coefficienti di regressione (R2 > 0,99) all'interno dell'intervallo di concentrazione di morin Co = 2,5-100 μg/mL. Allo stesso modo, le tre curve standard della quercetina nei tre compartimenti fisiologici simulati, presentate nella Figura 4B, hanno mostrato un'elevata linearità all'interno dello stesso intervallo di concentrazione.
Figura 3: Confronto degli spettri UV/Vis di soluzioni etanoliche di morin, soluzioni acquose di lignina alcalina e miscele contenenti morin e lignina con diverse concentrazioni iniziali. Gli spettri della lignina pura e della morina non coincidono e l'eteropolimero non esercita alcuna influenza dirompente. L'aggiunta di lignina alla morina porta allo spostamento del massimo assorbimento della morina a una lunghezza d'onda più alta, da λmax = 359 nm a λmax = 395 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Curve di calibrazione delle soluzioni di flavonoidi etanolici. (A) Morin e (B) quercetina nell'intervallo di concentrazione Co = 2,5-100 μg/mL a pH = 1,2 (in blu) (corrispondente al liquido gastrico simulato), pH = 6,8 (in rosso) (corrispondente al fluido intestinale tenue simulato) e pH = 7,4 (in verde) (corrispondente al liquido del colon simulato). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La concentrazione relativa di siti/gruppi funzionali attivi acidi e basici sulla superficie delle particelle di lignina alcalina scaricate e caricate è stata determinata mediante titolazione potenziometrica. I calcoli si sono basati sui volumi di titolante equivalenti determinati dalle curve di titolazione differenziale della derivata seconda (Figura 5). I valori del pKa determinato, le concentrazioni di gruppi funzionali acidi (forti, deboli, totali) e il pH e il pHpzc delle particelle micro e submicroniche sono presentati nella Tabella 1.
Figura 5: Curve di titolazione potenziometrica differenziale della derivata seconda delle particelle di lignina micro/submicronica scaricate e caricate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Parametro | microparticelle di lignina | microparticelle di lignina incapsulate da morin | particelle submicroniche di lignina | particelle submicroniche di lignina incapsulate con quercetina |
| Veq., mL | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| pKa | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa (forte), mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa (debole), mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa (totale), mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH (sospensione acquosa) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| pHpzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
Tabella 1: Valori del volume equivalente di titolante (Veq), il logaritmo base -10 negativo della costante di dissociazione acida (pKa), le concentrazioni di gruppi funzionali acidi (forti, deboli, totali) (Aa, mgeq/g), pH e punto di carica zero (pHpzc) delle micro e submicroniche di lignina scaricate e caricate. Le particelle di lignina micro e submicron, scaricate e caricate con flavonoidi sono caricate negativamente perché il loro pH > pHpzc.
Il contenuto fenolico totale (TPC), determinato con un metodo colorimetrico modificato di Folin-Ciocalteu e calcolato come equivalenti di acido gallico, è stato di 78,2 mg di GAE/g delle particelle di lignina non caricate, mentre il valore di TPC dei microcarrier incapsulati con morin con la stessa concentrazione è stato 2,3 volte superiore (183,43 mg di GAE/g). Quest'ultimo indica che le particelle di etero biopolimero sono arricchite con ulteriori gruppi fenolici a causa dell'incorporazione delle molecole di flavonoidi. L'efficienza di incapsulamento dei flavonoidi è stata: 98,1% per la morina e 97,6% per la quercetina. Le capacità di incapsulamento del farmaco erano del 28,2% per le microparticelle caricate con morin e del 39,0% per le particelle submicroniche incapsulate con quercetina.
Il rilascio cumulativo in vitro di morina e quercetina è stato studiato in terreni gastrointestinali simulati privi di enzimi: gastrico, piccoli fluidi intestinali e del colon a pH = 1,2, 6,8 e 7,4, rispettivamente (Figura 6). La massima efficienza di rilascio di circa il 24% è stata raggiunta dopo 30-40 minuti a pH = 6,8. Secondo i risultati sperimentali, la quantità di flavonoide rilasciato nel terreno intestinale tenue simulato ha prevalso il doppio di quella rilasciata nell'ambiente del colon simulato e tre volte l'efficienza di rilascio determinata nello stomaco. La massima estensione del rilascio di quercetina stabilita in SIF a pH = 7,4 al 70-90 ° minuto è stata del 34%, che ha superato il rilascio cumulativo del flavonoide in SGF (pH = 1,2) e SIF (pH = 6,8) rispettivamente al 23,5% e al 18%.
Figura 6: Analisi comparative dell'efficienza cumulativa di rilascio in vitro di morina e quercetina da particelle di lignina micro e submicronica in mezzi fisiologici simulati. La massima estensione del rilascio di morina è stata raggiunta nel terreno intestinale tenue simulato. La più alta efficienza di rilascio della quercetina è stata registrata nel liquido del colon simulato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Tra le principali criticità delle moderne metodologie di sintesi per la progettazione di formulazioni di vettori di farmaci a base di biopolimeri c'è l'applicazione di reagenti organici pericolosi - solventi volatili e infiammabili, come tetraidrofurano, acetone, metanolo e persino DMSO in alte concentrazioni - che ne limita l'applicabilità in biomedicina, industria farmaceutica e tecnologia alimentare a causa della manifestazione di possibili effetti tossici20, 21,22,23,24. Un altro punto cruciale è il coinvolgimento di reazioni chimiche complicate (ad esempio, esterificazione, polimerizzazione) o apparecchiature costose durante la procedura di sintesi. Entrambe le tecniche presentate nel presente manoscritto superano queste ultime limitazioni con l'implicazione di solventi alternativi (acqua) e composti non tossici come tensioattivi (Tween 80) e agenti reticolanti (etanolo, acido citrico), classificandoli come metodi di sintesi "verdi". Inoltre, le metodologie offrono una soluzione che soddisfa la necessità critica e l'urgenza di sviluppare procedure economiche, ecologiche e sostenibili per la progettazione di particelle di lignina, che fungono da modelli di trasporto biodegradabili, bioattivi e biocompatibili di sostanze fisiologicamente attive25.
Per ottenere particelle di lignina con la dimensione desiderata, sono state scelte due condizioni di produzione: una con alta concentrazione di lignina (50 g/L) e acido nitrico come agente anti-solvente e un'altra con una concentrazione di lignina inferiore (5 g/L), etanolo come antisolvente e acido citrico che svolgono contemporaneamente un doppio ruolo di antisolvente e agente reticolante, poiché queste erano le due variabili che influenzano la dimensione delle particelle di lignina. La portata durante entrambe le procedure è stata mantenuta bassa per fornire particelle più piccole e per prevenire la loro aggregazione. Ci sono alcuni punti critici che devono essere considerati per quanto riguarda la scelta degli acidi inorganici e organici per i protocolli di sintesi.
L'acido nitrico è stato scelto perché è un acido inorganico forte, che offre un'elevata precipitazione della lignina alcalina e controllando la velocità della sua aggiunta si possono ottenere particelle all'interno dell'intervallo di dimensioni desiderato. Inoltre, ci si aspetta che l'aggiunta di HNO3 possa fornire modificazioni delle particelle eteropolimeriche a causa di probabili cambiamenti chimici della struttura della lignina associati a: processi di reazioni di nitrazione-sostituzione di atomi di H negli anelli benzenici con gruppi -NO2 ; esterificazione dei gruppi -OH alifatici e formazione di gruppi funzionali estere; e/o ossidazione dei gruppi fenolici -OH e -OCH3 con conseguente formazione di strutture chinoniche. Per quanto riguarda il ruolo del precipitante e della concentrazione di lignina per la dimensione delle particelle sintetizzate, da un lato, la maggiore concentrazione iniziale di lignina combinata con l'aggiunta dell'acido nitrico forte (pKa = -1,4) e la limitata solubilità dell'eteropolimero alcalino nell'acido inorganico hanno portato alla produzione di particelle nell'intervallo micrometrico. D'altra parte, l'aggiunta di etanolo alla soluzione acquosa di lignina alcalina con la concentrazione più bassa provoca la formazione di una sospensione fine a causa della parziale solubilità della lignina alcalina nell'alcol. Inoltre, la successiva aggiunta di acido citrico ha portato alla produzione di particelle nell'intervallo nanometrico perché l'acido organico è più debole (pKa1 = 3,13) dell'acido nitrico, offrendo di conseguenza una minore estensione della precipitazione.
Alcune proprietà di base dei farmaci nanometrici sono la circolazione dei farmaci, il rilascio di farmaci da forme di dosaggio in siti specifici e l'assorbimento attraverso le membrane biologiche. Queste proprietà sono notevolmente influenzate da alcune caratteristiche fisiche e chimiche dei trasportatori di nanoparticelle e dalle molecole di farmaco incapsulate.
Le caratteristiche fisico-chimiche dei vettori biopolimerici: concentrazione dei gruppi acidi e basici tensioattivi, punto di carica zero (pHPZC), dimensione, distribuzione granulometrica, nonché le caratteristiche spettrali delle particelle prima e dopo l'incorporazione della sostanza bioattiva, sono parametri essenziali che devono essere presi in considerazione nella valutazione dei gruppi funzionali, reattività, stabilità e omogeneità delle particelle10.
La dimensione delle particelle, la distribuzione delle dimensioni delle particelle, la carica e la morfologia sono tra i principali fattori che influiscono su queste valutazioni. La dimensione delle particelle influisce sulla loro stabilità, reattività e comportamento di rilascio del farmaco26. Le particelle più piccole offrono un'area di trasferimento di massa più ampia, che porta a un tasso di rilascio del farmaco più elevato. Al contrario, la minore superficie di trasferimento di massa delle particelle più grandi si traduce in un tasso inferiore di diffusione del farmaco all'interno di queste particelle.
L'applicazione dei metodi titrimetrici come tecniche di base per la determinazione di siti acidi e basici e gruppi funzionali presenti su superfici solide è in continua espansione. I principali vantaggi della titolazione potenziometrica includono il risparmio di tempo e manodopera, l'elevata precisione e l'eliminazione di standard di riferimento e apparecchiature costose. Il metodo è stato applicato nel presente studio in quanto consente la caratterizzazione di particelle di biopolimero mediante determinazione qualitativa e semiquantitativa della natura e del numero di siti attivi presenti sulla superficie dei vettori di biopolimeri caricati e scaricati27.
La carica superficiale dei micro-/nano- carrier biologici e medici svolge un ruolo importante nell'assorbimento cellulare28. Il pHPZC corrisponde a densità di carica superficiale zero, cioè a quantità equivalenti di cariche negative e positive sviluppate dagli equilibri protonici. La determinazione di questi valori fornisce informazioni sulla specificità dell'adsorbimento29. Tuttavia, poiché il parametro punto isoelettrico rappresenta solo le cariche superficiali esterne delle particelle in sospensione, mentre il punto di carica zero varia in risposta alla carica superficiale netta totale (esterna e interna) delle particelle, il protocollo pHpzc è stato applicato per la prima volta nel presente studio come metodo semplice ed efficace per la caratterizzazione dei vettori di farmaci biopolimerici. Secondo il concetto di pHpzc, a pH superiore al pHpzc, la superficie delle particelle di biopolimero è prevalentemente caricata negativamente, mentre si osserva una carica positiva netta quando il pH della sospensione è inferiore al pHpzc. Dai dati sperimentali presentati nella Tabella 1, si potrebbe concludere che le particelle di lignina micro e submicroniche, scaricate e caricate con flavonoidi sono caricate negativamente perché il loro pH > pHpzc.
L'efficienza del carico di flavonoidi è influenzata dall'efficienza di incapsulamento e dalla capacità di carico del farmaco. L'efficienza di incapsulamento (E, %) è definita come il rapporto tra la quantità di farmaco incorporata nelle particelle e la quantità complessiva nella formulazione. L'efficienza di incapsulamento è influenzata dalle caratteristiche del farmaco, dal solvente e dal vettore30.
La somministrazione efficiente di una sostanza fisiologicamente attiva, tuttavia, dipende dal modo e dalla misura in cui le sue molecole vengono rilasciate dalla matrice di trasporto. Pertanto, è molto importante considerare il meccanismo di rilascio del farmaco e il tasso di rilascio 31,32,33. Chiarendo il meccanismo di rilascio in vitro dei bioflavonoidi dai loro micro-/nano-carrier biopolimerici, è possibile simulare e prevedere il comportamento del flavonoide e del carrier in un mezzo fisiologico reale e ottimizzare la progettazione di formulazioni farmaceutiche con una migliore biodisponibilità. I risultati sperimentali in vitro ottenuti in questo studio sono utili per la pratica clinica in quanto dimostrano che, a causa della minore entità del rilascio di morina/quercetina da parte del submicron di lignina e delle microparticelle nell'ambiente gastrico, le innovative particelle di biopolimero sono adatte alla somministrazione orale a causa del minor rischio di irritazione gastrica rispetto alla somministrazione orale diretta delle sostanze bioattive. Le innovative microparticelle di biopolimero sono adatte alla somministrazione orale grazie al minor rischio di irritazione gastrica rispetto alla somministrazione orale diretta delle sostanze bioattive. Inoltre, le particelle submicroniche, a causa delle loro piccole dimensioni e del significativo potenziale di rilascio, potrebbero essere applicate come formulazioni iniettabili. Inoltre, i nuovi vettori di lignina micro e submicronica offrono l'opportunità di superare i limiti riportati da altri scienziati relativi alle difficoltà associate alla somministrazione orale di alte dosi di alcuni bioflavonoidi, derivanti dalla loro tendenza a formare soluzioni sature nel tratto intestinale, che a sua volta ostacola il processo di dissoluzione e il loro efficiente riassorbimento.
La facilità di sintesi, la biocompatibilità delle particelle risultanti, nonché la possibilità di personalizzazione del protocollo attuale, rappresentano i maggiori vantaggi della metodologia presentata. La dimensione delle particelle è ottimale per le applicazioni previste, offrendo una superficie sufficiente disponibile per attacchi di terapie e gruppi mirati, che a loro volta non richiedono la somministrazione di più particelle per raggiungere i requisiti di dosaggio target. L'uso della lignina come matrice eteropolimerica di base per la sintesi di particelle innovative consente una maggiore biocompatibilità e offre vari gruppi funzionali attivi che presentano opportunità di personalizzazione delle particelle per diverse applicazioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Fondo scientifico bulgaro nell'ambito del contratto n. KΠ-06 H59/3 e dal progetto scientifico n. 07/2023 FVM, Università di Trakia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
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