Summary
Nous décrivons des méthodologies nouvelles et simples de synthèse et de caractérisation de particules micro- et submicroniques de lignine biocompatibles. Ces formulations offrent une approche facile pour l’utilisation de l’hétéropolymère, ainsi qu’une alternative pour la conception rationnelle de matrices de support multifonctionnelles avec une applicabilité potentielle en biomédecine, en technologie pharmaceutique et dans l’industrie alimentaire.
Abstract
L’applicabilité de la micro/nanotechnologie des biopolymères dans la médecine humaine, vétérinaire, pharmaceutique et alimentaire augmente rapidement en raison du grand potentiel des particules à base de biopolymères en tant que systèmes porteurs efficaces. L’utilisation de la lignine en tant que biomatrice hétéropolymère de base pour la conception de formulations micro- / submicroniques innovantes permet d’obtenir une biocompatibilité accrue et offre divers groupes fonctionnels actifs présentant des possibilités de personnalisation des propriétés physicochimiques et des bioactivités des formulations pour diverses applications. L’objectif de la présente étude était de développer une méthodologie simple et respectueuse de l’environnement pour la synthèse de particules de lignine de taille micro- et submicronique ; évaluer leurs caractéristiques physico-chimiques, spectrales et structurales ; et d’examiner leur capacité d’encapsulation de molécules biologiquement actives et leur potentiel de libération in vitro de bioflavonoïdes dans des milieux gastro-intestinaux simulés. Les méthodologies présentées utilisent des solvants bon marché et verts ; Procédés simples, directs, rapides et sensibles nécessitant peu d’équipement, des substances non toxiques et des méthodes simples pour leur caractérisation, la détermination de la capacité d’encapsulation envers les composés bioactifs peu solubles dans l’eau Morin et Quercetin, et le potentiel de libération in vitro des matrices de lignine.
Introduction
De nos jours, l’inclination vers les biopolymères tels que la cellulose, le chitosane, le collagène, le dextran, la gélatine et la lignine en tant que précurseurs pour la conception de supports micro-/submicroniques avec une taille, des propriétés physicochimiques et des biofonctionnalités personnalisables a augmenté dans les industries biomédicales, pharmaceutiques et de la technologie alimentaire en raison de leur applicabilité en ingénierie tissulaire, en bio-impression 3D, in vitro les plateformes de modélisation des maladies, l’industrie de l’emballage, la préparation d’émulsions et l’administration de nutriments, entre autres, 1,2,3.
De nouvelles études mettent en évidence les aspects des hydrogels à base de lignine ainsi que des micro- et nanoformulations4 en tant que véhicules avantageux utilisés pour les matériaux d’emballage alimentaire5, le stockage d’énergie6, les cosmétiques7, les stabilisants thermiques/légers, les matériaux renforcés et les matrices de support de médicament8 pour l’administration de molécules hydrophobes, l’amélioration des barrières UV9, en tant qu’agents de renforcement dans les nanocomposites et en tant qu’alternative aux nanoparticules inorganiques en raison de certains problèmes de sécurité récents 10,11,12. La raison de cette tendance est la biocompatibilité, la biodégradabilité et la non-toxicité de l’hétéropolymère naturel, ainsi que ses bioactivités prouvées de potentiel antioxydant de lignine et de piégeage radicalaire, anti-proliférative et antimicrobienne 13,14,15,16,17.
La littérature scientifique fait état de diverses méthodes de synthèse (auto-assemblage, précipitation anti-solvant, précipitation acide et déplacement de solvant)18 et de caractérisation de formulations à base de lignine à l’échelle micro/nanométrique, y compris l’application de solvants coûteux ou nocifs tels que le tétrahydrofurane (THF), le diméthylsulfoxyde (DMSO), le N,N-diméthylformamide (DMF) et l’acétone, ainsi que des processus compliqués, indirects et fastidieux qui utilisent beaucoup d’équipements et de substances toxiques 12,19,20.
Pour pallier ces derniers inconvénients, les protocoles suivants présentent de nouvelles méthodologies pour la synthèse de particules micro-/submicroniques à base de lignine à l’aide de solvants bon marché et verts ; Des procédés simples, directs, rapides et sensibles nécessitant peu d’équipement, des substances non toxiques et des méthodes simples pour leur caractérisation et la détermination de la capacité d’encapsulation vers des composés bioactifs peu solubles dans l’eau et du potentiel de libération in vitro des matrices de lignine. Les méthodes de production à l’échelle du laboratoire présentées sont avantageuses pour la fabrication de supports de lignine fonctionnels avec des tailles réglables, une capacité d’encapsulation élevée et un comportement de libération in vitro durable en utilisant des procédures de caractérisation simples et des produits chimiques respectueux de l’environnement qui peuvent trouver des applications dans divers domaines des sciences biomédicales et de la technologie alimentaire. Deux flavonoïdes ont été appliqués comme molécules cibles encapsulées dans les particules de lignine : la morine dans les microparticules et la quercétine dans les particules submicroniques. La différence dans les structures des deux flavonoïdes n’est que la position du deuxième groupe -OH dans le cycle aromatique B : le groupe -OH est sur la position 2' dans Morin et sur la position 3' dans la quercétine, donc les deux composés organiques sont des isomères de position. Ce dernier fait suppose un comportement similaire des deux composés naturels bioactifs dans les processus d’encapsulation et/ou de libération.
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Protocol
1. Synthèse de microparticules de lignine
- Préparez une solution aqueuse de lignine alcaline à 50 mg/mL en dissolvant 2,5 g de lignine alcaline dans 50 mL d’eau ultrapure à l’aide d’un agitateur magnétique.
- Préparez une solution à 1 % de Tween 80 en dissolvant 1 mL de Tween 80 dans 100 mL d’eau ultrapure.
- Préparez une solution de 2 M de HNO3 en diluant 6,65 mL de HNO3 à 67 % (densité = 1,413 g/mL) avec de l’eau ultrapure jusqu’à ce qu’il atteigne un volume final de 50 mL.
- Ajouter lentement 15 mL de la solution à 1 % de Tween 80 à 50 mL de solution de lignine alcaline à 50 mg/mL.
- Agitez le mélange sur un agitateur magnétique à 500 tr/min pendant 10 min afin que le tensioactif se disperse bien.
- Ajouter 20 mL de 2 M HNO3 goutte à goutte à l’aide d’une seringue à un débit d’environ 150 μL/s au mélange.
- Continuez à remuer le mélange pendant 30 minutes lorsque la solution brun foncé se transforme en une suspension brun clair de microparticules.
- Transférez la suspension dans des tubes à essai de 1,5 à 2 ml et centrifugez-les pendant 30 minutes à 15 000 × g dans une ultracentrifugeuse à 10 °C.
- Récupérez le surnageant pour des analyses plus approfondies et rincez les microparticules avec de l’eau ultra-pure.
- Répétez les procédures de rinçage/ultracentrifugation 3 fois.
- Trempez le récipient avec les microparticules dans un bain de glace avant l’homogénéisation par ultrasons.
- Homogénéiser les microparticules pendant 4 min à une intensité de 93% sur un homogénéisateur à ultrasons.
- Lyophilisez les microparticules à une température de -64 °C dans un lyophilisateur et stockez-les dans un exicateur pour une utilisation ultérieure.
2. Synthèse de particules submicroniques de lignine
- Préparez une solution aqueuse de lignine alcaline à 5 mg/mL en dissolvant 125 mg de lignine alcaline dans 25 mL d’eau ultrapure sur un agitateur magnétique.
- Ajouter lentement 1 ml d’EtOH à 96 % à la solution de lignine alcaline.
- Agitez le mélange sur un agitateur magnétique à 500 tr/min pendant 3 min.
- Préparez 50 ml d’une solution à 1 % d’acide citrique en dissolvant 0,5 g d’acide citrique dans de l’eau ultrapure jusqu’à un volume final de 50 mL.
- Ajouter 7 mL d’acide citrique à 1 % goutte à goutte à l’aide d’une seringue à un débit d’environ 4 mL/min au mélange.
- Continuez à remuer le mélange pendant 10 minutes lorsque la solution brune claire se transformera en une suspension trouble brun clair de particules submicroniques.
- Transvaser la suspension dans des tubes à essai et centrifuger pendant 30 min à 15 000 × g dans une ultracentrifugeuse à 10 °C.
- Récupérez le surnageant pour des analyses plus approfondies et rincez les microparticules avec de l’eau ultra-pure.
- Répétez les procédures de rinçage/ultracentrifugation 3 fois.
- Trempez le récipient avec les microparticules dans un bain de glace avant l’homogénéisation par ultrasons.
- Homogénéiser les microparticules par ultrasons pendant deux cycles de 4 min chacun à une intensité de 96% dans un homogénéisateur à ultrasons.
- Refroidissez les récipients pendant 1 min après le premier cycle.
- Lyophilisez les microparticules à une température de -64 °C dans un lyophilisateur et stockez-les dans un exicateur pour une utilisation ultérieure.
3. Synthèse de particules micro-/submicroniques de lignine encapsulées dans des flavonoïdes naturels
- Répétez les étapes 1.1 à 1.5 pour les microparticules.
- Peser 0,08 g de morin, le dissoudre dans 1 mL d’EtOH et ajouter cette solution éthanolique au mélange.
- Agitez le mélange sur un agitateur magnétique à 500 tr/min pendant 20 min.
- Ajouter 20 mL de 2 N HNO3 goutte à goutte à l’aide d’une seringue à un débit d’environ 150 μL/s au mélange.
- Continuez à remuer le mélange pendant 60 min.
- Répétez les étapes 1.8-1.13.
- Répétez l’étape 2.1 pour les particules submicroniques.
- Poids 0,04 g de quercétine, dissoudre dans 1 mL d’EtOH et ajouter cette solution éthanolique à la solution aqueuse de lignine alcaline.
- Agiter le mélange sur un agitateur magnétique à 500 tr/min pendant 10 min.
- Répétez les étapes 2.4 à 2.13.
4. Détermination de l’efficacité d’encapsulation des microparticules de lignine
- Calculer la teneur de la substance bioactive ajoutée au cours de la procédure de synthèse des deux types de particules de lignine encapsulées dans des flavonoïdes.
- Déterminer spectrophotométriquement l’absorption du flavonoïde dans le surnageant obtenu lors des étapes 1.9 et 2.8 après l’avoir dilué avec 96% d’EtOH.
- Calculer la concentration de morin/quercétine non piégée à l’aide des courbes d’étalonnage des flavonoïdes.
- Calculer l’efficacité d’encapsulation (EE, %) des microparticules de lignine vis-à-vis des flavonoïdes naturels à l’aide de l’équation (1) :
(1)
Où wo est la quantité totale de substance bioactive ajoutée (mg) et wf est la quantité de flavonoïde libre non piégé (mg). - Calculez la capacité de charge du médicament (DLC, %) - un paramètre important représentant la quantité de médicament dans les particules par unité de poids du système porteur - en utilisant l’équation (2) :
(2)
Où wp est la quantité totale (rendement) de particules micro-/submicroniques de lignine obtenues après lyophilisation (mg).
(1)
(2)5. Caractérisation des particules micro- et submicroniques de lignine
- Détermination du nombre, de la taille et de la distribution granulométrique des particules
- Évaluez la taille et la distribution granulométrique des échantillons à l’aide d’un compteur automatique de cellules avec l’option de comptage des billes. Ajouter à l’aide d’une micropipette 1 μL de particules micro-/submicroniques de lignine/flavonoïde en suspension dans de l’eau ultrapure dans le puits de la lame de comptage nécessaire à l’opération.
- Attendez que le nombre de particules dans 1 mL de la suspension, ainsi que leur nombre et leur répartition par taille soient affichés sur l’écran du compteur automatique de cellules.
REMARQUE : L’appareil permet le stockage des données sur une clé USB. Le logiciel spécial de comptage automatique de cellules permet un traitement ultérieur des fichiers numériques et photo enregistrés.
- Détermination de la teneur en groupes acides/basiques de surface des particules de lignine par titrage potentiométrique
- Poids 0,04 g de particules de lignine non chargées/encapsulées dans des flavonoïdes.
- Transférez-les dans un erlenmeyer, ajoutez 10 ml de HCl 0,1 M et placez le ballon sur un agitateur magnétique à 250 tr/min.
- Remplissez une burette de 50 mL avec une solution étalon de 0,1 M de titrant NaOH.
- Mesurez le pH initial de la solution dans l’erlenmeyer à l’aide d’un pH-mètre de paillasse avant de commencer le titrage.
- Démarrez le titrage et mesurez le pH de la solution analysée après chaque portion ajoutée de 0,5 mL du titrant.
- Stockez les données expérimentales dans un tableau contenant le volume du titrant appliqué et la valeur correspondante du pH.
- Arrêtez le titrage lorsqu’une valeur approximativement constante du pH est atteinte en augmentant le volume de la solution titrante.
- Tracez les données expérimentales sous la forme de courbes de titrage différentielles de dérivée zéro, première et dérivée seconde.
- Déterminer les points équivalents et les volumes équivalents correspondants des titrants utilisés.
- Calculer le contenu des groupes basiques acides Aaet Abà la surface des particules de lignine déchargées et chargées en flavonoïdes à l’aide des équations (3) et (4) :
, mgeq/g (3)
mgeq/g (4)
où Veqi est le volume équivalent (mL) ; NT la normalité du titrant (mgeqv/mL) ; VT le volume du titrant utilisé pour la procédure de détermination (mL) ; m le poids de l’échantillon analysé (g).
- Détermination du point de charge zéro (pHPZC) des particules à base de lignine par la méthode de l’addition solide.
- Préparez 60 mL de solution aqueuse de NaCl à 0,1 M.
- Ajouter 9 mL de la solution de NaCl 0,1 M dans chacun des cinq fioles coniques bouchées et ajuster le pHà pH i = 2, 4, 7, 10 et 12 (où i = 1-5 désigne le numéro de la solution correspondante), respectivement par l’ajout de 0,1 M de HCl ou de 0,1 M de NaOH. Ajuster le volume total de la solution dans chaque fiole à 10 mL exactement en ajoutant une solution de NaCl de même concentration.
- Ajouter 40 mg de particules de lignine sèches (micro/submicroniques non chargées en flavonoïdes) dans chaque fiole et boucher les flacons en toute sécurité.
- Fixer les flacons à la verticale sur un agitateur orbital et les maintenir en mouvement pendant 24 h.
- Laisser l’équilibre pendant 30 minutes et mesurer ensuite le pH final (pHf) des surnageants dans chaque flacon.
- Tracer les valeurs de pHf par rapport aux valeurs de pH initiales correspondantes (pHi).
- Le point de charge nulle (pHPZC) est défini comme la valeur du pH à laquelle la courbe ΔpH en fonction du pHi coupe la droite avec les coordonnées (pHi ; pHi).
- Détermination de la teneur phénolique totale (TPC) des particules de lignine
REMARQUE : La teneur phénolique totale (TPC) des particules de lignine micro-/submicroniques est déterminée par une méthode colorimétrique Folin-Ciocalteu modifiée.- Mélanger 200 μL d’une suspension aqueuse de particules d’une concentration de 500 μg/mL avec 600 μL d’eau ultrapure et 200 μL de réactif Folin-Ciocalteu (1:1, v/v).
- Après 5 min, ajoutez 1,0 mL de Na2CO3 à 8 % et 1,0 mL d’eau Milli-Q au mélange et incubez-le dans l’obscurité à 40 °C pendant 30 min dans un bain-marie à agitation intermittente.
- Centrifuger la suspension à 5 300 × g pendant 2 min.
- Préparez un blanc sans particules.
- Transférez 3,5 mL du surnageant dans une cuvette en quartz de 10 mm et mesurez l’absorbance sur un spectrophotomètre UV/Vis dans la région visible à 760 nm contre le blanc.
- Préparer une courbe d’étalonnage de l’acide gallique étalon en suivant les étapes 5.3.1 à 5.3.5 ; seulement, au lieu de 200 μL de suspension de particules de lignine, utilisez la solution éthanolique d’acide gallique avec des concentrations initiales de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 et 200 μg/mL.
- Exprimer les données expérimentales des microparticules en mg d’équivalents d’acide gallique en milligrammes par gramme d’échantillon sec (mg GAE/g).
- Calculer le TPC à l’aide de l’équation (5) :
mg GAE/g (5)
où CGA est la concentration de l’échantillon équivalente à la concentration d’acide gallique étalon obtenue à partir de la courbe d’étalonnage de l’acide (μg GA/mL) ; Cs est la concentration de l’échantillon, qui est égale à la masse de l’échantillon sec divisée par le volume du solvant (μg/mL).
, mgeq/g (3)
mgeq/g (4)
mg GAE/g (5)6. Détermination de la capacité de libération in vitro des particules de lignine
- Préparez 250 mL de milieu gastrique exempt d’enzymes simulé en ajustant le pH d’une solution étalon de PBS avec 0,1 M HCl à pH = 1,2.
- Préparez 250 mL de chacune des deux solutions de liquide intestinal simulé en ajustant le pH de la solution étalon de PBS avec 0,1 M de NaOH/0,1 M HCl à pH = 6,8 et 7,4, respectivement.
- Ajouter 25 mg de particules microscopiques ou submicroniques encapsulées dans des flavonoïdes à 50 ml de milieu gastrique exempt d’enzymes simulé dans un réacteur discontinu en verre équipé d’un agitateur mécanique et le placer dans un bain d’eau thermale à une température constante de T = 37 ± 0,2 °C.
- Trempez l’agitateur à une profondeur de 2/3 du volume de liquide pour assurer un mélange complet des phases solide et liquide et assurer un transfert de masse maximal sans zones stagnantes.
- Prélever 1 mL d’échantillon du réacteur toutes les 10 min jusqu’à la 90e minute et pipeter immédiatement 1 mL de solution de fluide simulé fraîche dans le réacteur pour éviter toute modification du volume total et pour assurer les conditions de l’évier.
- Répétez la même procédure, y compris les étapes 6.3 à 6.6 avec les deux solutions de liquide intestinal simulé avec un pH = 6,8 et 7,4, respectivement, pendant 200 min.
- Effectuez des expériences analogues avec des particules de lignine déchargées dans les trois milieux simulés et utilisez les échantillons comme blancs pour la mise à zéro du spectrophotomètre.
- Déterminer l’absorption des échantillons par spectrophotométrie après les avoir filtrés et dilués avec de l’EtOH à 96 % contre les échantillons blancs de l’étape 6.7 et calculer la concentration correspondante de flavonoïdes à l’aide des courbes d’étalonnage correspondantes de morin obtenues à pH = 1,2, 6,8 et 7,4, respectivement.
- Calculer le rejet cumulatif (CR) des bioflavonoïdes à l’aide de l’équation (6) en μg/mL et le pourcentage de rejet cumulatif (CRP) à l’aide de l’équation (7) :
(6)
où Ci et Ci+1 sont les concentrations de morin/quercétine dans les ième et (i+1) ème échantillons (μg/mL) ; Vs le volume de l’échantillon prélevé dans le réacteur discontinu (mL) ; V : le volume total du support simulé (mL).
(7)
où Cmax est la concentration maximale du composé biologiquement actif dans le support (μg/mL).
(6)
(7)7. Analyses statistiques
- Exprimer les données expérimentales en moyennes ±écarts-types (ET) de trois mesures indépendantes.
- Déterminez la signification statistique des résultats expérimentaux en effectuant le test ANOVA comme test post-hoc. Considérons une valeur de p < 0,05 statistiquement significative.
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Representative Results
Une technique de précipitation anti-solvant a été exécutée pour produire des particules de lignine alcaline micro-/submicroniques. Une solution aqueuse d’acide inorganique dilué-acide nitrique/acide organique-acide citrique a été dispersée dans une solution aqueuse de lignine alcaline, enrichie d’un tensioactif/éthanol écologique, ce qui a entraîné la précipitation progressive du soluté biopolymère et, après sonication, une suspension de particules compactes micro/submicroniques a finalement été produite (Figure 1).
Figure 1 : Homogénéisation des particules de lignine. (A) Homogénéisation par ultrasons des particules submicroniques de lignine synthétisées ; (B) Microparticules de lignine homogénéisées chargées de morin et déchargées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La taille, le nombre et la distribution granulométrique des microtransporteurs de lignine déchargés et encapsulés dans du morin ont été déterminés (figure 2). Les données expérimentales ont révélé une concentration plus élevée, 1 × 107 particules/mL (2 037 particules/μL), et une taille moyenne plus élevée, 6,1 μm, des microporteurs chargés en bioflavonoïdes (figure 2B) que des microporteurs non chargés avec une concentration de 7,4 × 106 particules/mL (1 474 particules/μL) et une taille moyenne de 5,7 μm (figure 2A). La distribution granulométrique en pourcentage des deux types de particules dans la gamme de tailles de 3 à 6 μm était de 75,2 % pour les microporteurs non chargés et de 69,3 % pour les microporteurs encapsulés dans le morin, et de 20,2 % et 25,2 %, respectivement, dans la plage de 7 à 10 μm. La quantité, la concentration et le débit de l’antisolvant, l’acide nitrique, sont essentiels pour la taille des particules. La concentration plus élevée et la plus grande quantité d’acide conduisent à des particules plus grosses, tandis que le débit plus élevé provoque l’agrégation de la suspension.
Figure 2 : Distribution granulométrique des particules. (A) Distribution granulométrique réelle des microparticules de lignine déchargées dans 1 μL de suspension - logiciel du compteur de particules ; (B) distribution granulométrique réelle des microparticules de lignine alcaline encapsulées dans Morin dans 1 μL de logiciel de suspension du compteur de particules. (C) Photo microscopique du compteur de particules de la distribution des microparticules de lignine déchargées ; (D) photo microscopique du compteur de particules de la distribution des microparticules de lignine alcaline encapsulées dans le morin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La figure 3 présente les spectres d’absorption UV/Vis des solutions aqueuses de morin d’éthanol, de lignine alcaline et des mélanges contenant de la morine et de la lignine avec des concentrations initiales différentes. De toute évidence, les pics d’absorption de la lignine pure et du bioflavonoïde ne coïncident pas et l’hétéropolymère n’exerce aucune influence perturbatrice au cours de la méthode spectrophotométrique appliquée pour la détermination de la concentration de morine dans la phase liquide après encapsulation du flavonoïde dans les microsupports polymères et lors des expériences de libération in vitro . L’absorption maximale de morin dans le mélange à deux composants s’est déplacée vers une longueur d’onde plus élevée, de λmax = 359 nm à λmax = 395 nm, en raison de l’augmentation du pH du milieu due à la présence de lignine alcaline. Cette dernière déviation du maximum d’absorption dans la zone visible a provoqué la nécessité de concevoir des courbes d’étalonnage de morin à différentes valeurs de pH du milieu (Figure 4A). Les trois courbes standard caractérisées par de très fortes corrélations linéaires ont été prouvées par les valeurs élevées des coefficients de régression (R2 > 0,99) dans la plage de concentration de Morin Co = 2,5-100 μg/mL. De même, les trois courbes standard de la quercétine dans les trois compartiments physiologiques simulés, présentées à la figure 4B, ont montré une linéarité élevée dans la même plage de concentration.
Figure 3 : Comparaison des spectres UV/Vis des solutions éthanoliques de morin, des solutions aqueuses de lignine alcaline et des mélanges contenant de la morine et de la lignine avec des concentrations initiales différentes. Les spectres de lignine pure et de morin ne coïncident pas et l’hétéropolymère n’exerce aucune influence perturbatrice. L’ajout de lignine à morin entraîne un décalage de l’absorption maximale de morin vers une longueur d’onde plus élevée, de λmax = 359 nm à λmax = 395 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Courbes d’étalonnage des solutions de flavonoïdes éthanoliques (A) Morin et (B) quercétine dans la plage de concentration Co = 2,5-100 μg/mL à pH = 1,2 (en bleu) (correspondant au liquide gastrique simulé), pH = 6,8 (en rouge) (correspondant au liquide intestinal grêle simulé) et pH = 7,4 (en vert) (correspondant au liquide du côlon simulé). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La concentration relative des sites actifs acides et basiques/groupes fonctionnels à la surface des particules de lignine alcaline déchargées et chargées a été déterminée par titrage potentiométrique. Les calculs ont été basés sur les volumes équivalents de titrant déterminés par les courbes de titrage différentielles de la dérivée seconde (figure 5). Les valeurs du pKa déterminé, des concentrations des groupes fonctionnels acides (fort, faible, total) et du pH et du pHpzc des particules micro- et submicroniques sont présentées dans le tableau 1.
Figure 5 : Courbes de titrage potentiométrique différentielle de la dérivée seconde des particules de lignine micro/submicroniques chargées et chargées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Paramètre | Microparticules de lignine | Microparticules de lignine encapsulées dans Morin | particules submicroniques de lignine | Particules submicroniques de lignine encapsulées dans de la quercétine |
| Véq., mL | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| pKa | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa (fort), mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa (faible), mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa (total), mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH (suspension aqueuse) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| pHpzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
Tableau 1 : Valeurs du volume équivalent de titrant (Veq), du logarithme négatif de base -10 de la constante de dissociation acide (pKa), des concentrations de groupes fonctionnels acides (fort, faible, total) (Aa, mgeq/g), du pH et du point de charge zéro (pHpzc) des particules de lignine micro- et submicroniques chargées et chargées. Les particules de lignine micro- et submicroniques, déchargées et chargées en flavonoïdes, sont chargées négativement parce que leur pH > pHpzc.
La teneur totale en phénols (TPC), déterminée par une méthode colorimétrique Folin-Ciocalteu modifiée et calculée en équivalents d’acide gallique, était de 78,2 mg GAE/g des particules de lignine déchargées, tandis que la valeur de la TPC des microtransporteurs encapsulés dans le morin avec la même concentration était 2,3 fois plus élevée (183,43 mg GAE/g). Ce dernier indique que les particules d’hétérobiopolymère sont enrichies de groupes phénoliques supplémentaires en raison de l’incorporation des molécules de flavonoïdes. L’efficacité d’encapsulation des flavonoïdes était de 98,1 % pour le morin et de 97,6 % pour la quercétine. Les capacités d’encapsulation du médicament étaient de 28,2 % pour les microparticules chargées de morin et de 39,0 % pour les particules submicroniques encapsulées dans la quercétine.
La libération cumulative in vitro de morin et de quercétine a été étudiée dans des milieux gastro-intestinaux exempts d’enzymes simulés : liquides gastriques, intestins grêles et du côlon à un pH = 1,2, 6,8 et 7,4, respectivement (figure 6). L’efficacité de libération la plus élevée d’environ 24 % a été obtenue après 30 à 40 minutes à un pH = 6,8. Selon les résultats expérimentaux, la quantité de flavonoïde libérée dans le milieu simulé de l’intestin grêle prévalait deux fois plus que celle libérée dans l’environnement simulé du côlon et trois fois l’efficacité de libération déterminée dans l’estomac. L’étendue la plus élevée de libération de quercétine établie dans le SIF à pH = 7,4 sur la 70th - 90th min était de 34 %, ce qui dépassait la libération cumulative du flavonoïde dans le SGF (pH = 1,2) et le SIF (pH = 6,8) à 23,5 % et 18 %, respectivement.
Figure 6 : Analyses comparatives de l’efficacité cumulative de libération in vitro de morine et de quercétine à partir de particules micro- et submicroniques de lignine dans des milieux physiologiques simulés. La plus grande quantité de libération de morin a été obtenue dans un milieu simulé de l’intestin grêle. L’efficacité de libération la plus élevée de quercétine a été enregistrée dans le liquide du côlon simulé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Parmi les principaux problèmes critiques des méthodologies de synthèse modernes pour la conception de formulations de supports de médicaments à base de biopolymères figure l’application de réactifs organiques dangereux - solvants volatils et inflammables, tels que le tétrahydrofurane, l’acétone, le méthanol et même le DMSO à des concentrations élevées - ce qui limite leur applicabilité dans la biomédecine, l’industrie pharmaceutique et la technologie alimentaire en raison de la manifestation d’effets toxiques possibles20, 21,22,23,24. Un autre point crucial est l’implication de réactions chimiques compliquées (par exemple, l’estérification, la polymérisation) ou d’appareils coûteux pendant la procédure de synthèse. Les deux techniques présentées dans le présent manuscrit surmontent ces dernières limites par l’implication de solvants alternatifs (eau) et de composés non toxiques tels que les tensioactifs (Tween 80) et les agents de réticulation (éthanol, acide citrique), les classant comme méthodes de synthèse « vertes ». De plus, les méthodologies offrent une solution satisfaisant la nécessité critique et l’urgence de développer des procédures peu coûteuses, écologiques et durables pour la conception de particules de lignine, servant de modèles porteurs biodégradables, bioactifs et biocompatibles de substances physiologiquement actives25.
Pour obtenir des particules de lignine de la taille souhaitée, deux conditions de production ont été choisies : l’une avec une concentration élevée en lignine (50 g/L) et de l’acide nitrique comme agent antisolvant et une autre avec une concentration en lignine plus faible (5 g/L), l’éthanol comme antisolvant et l’acide citrique jouant simultanément un double rôle d’antisolvant et d’agent de réticulation, car ce sont les deux variables influençant la taille des particules de lignine. Le débit au cours des deux procédures a été maintenu à un faible niveau afin d’obtenir des particules plus petites et d’éviter leur agrégation. Il y a quelques points critiques qui doivent être pris en compte concernant le choix des acides inorganiques et organiques pour les protocoles de synthèse.
L’acide nitrique a été choisi parce qu’il s’agit d’un acide inorganique fort, qui offre une grande quantité de précipitation de lignine alcaline et, en contrôlant le taux de son ajout, les particules dans la plage de taille souhaitée peuvent être obtenues. De plus, on s’attend à ce que l’ajout de HNO3 puisse entraîner une modification des particules d’hétéropolymère en raison de changements chimiques probables de la structure de la lignine associés à : les processus de réactions de nitration-substitution des atomes H dans les cycles benzéniques avec des groupes -NO2 ; estérification des groupes -OH aliphatiques et formation de groupes fonctionnels esters ; et/ou l’oxydation des groupes phénoliques -OH et -OCH3 entraînant la formation de structures de quinone. En ce qui concerne le rôle du précipitant et de la concentration en lignine pour la taille des particules synthétisées, d’une part, la concentration initiale plus élevée en lignine combinée à l’ajout de l’acide nitrique fort (pKa = -1,4) et à la solubilité limitée de l’hétéropolymère alcalin dans l’acide inorganique a conduit à la production de particules dans la gamme micrométrique. D’autre part, l’ajout d’éthanol à la solution aqueuse de lignine alcaline à la concentration la plus faible provoque la formation d’une suspension fine en raison de la solubilité partielle de la lignine alcaline dans l’alcool. De plus, l’ajout ultérieur d’acide citrique a conduit à la production de particules dans la gamme nanométrique car l’acide organique est plus faible (pKa1 = 3,13) que l’acide nitrique, offrant par conséquent une extension des précipitations plus faible.
Certaines propriétés de base des produits pharmaceutiques de taille nanométrique sont la circulation des médicaments, la libération de médicaments à partir de formes posologiques à des sites spécifiques et l’absorption à travers des membranes biologiques. Ces propriétés sont considérablement influencées par certaines caractéristiques physiques et chimiques des porteurs de nanoparticules et par les molécules médicamenteuses encapsulées.
Les caractéristiques physico-chimiques des supports de biopolymères : concentration des groupes acides et basiques tensioactifs, point de charge zéro (pHPZC), taille, distribution granulométrique, ainsi que les caractéristiques spectrales des particules avant et après l’incorporation de la substance bioactive, sont des paramètres essentiels qui doivent être pris en compte lors de l’évaluation des groupes fonctionnels, de la réactivité, de la réactivité, de la stabilité et homogénéité des particules10.
La taille des particules, la distribution de la taille des particules, la charge et la morphologie sont parmi les principaux facteurs qui ont un impact sur ces évaluations. La taille des particules a un impact sur leur stabilité, leur réactivité et leur comportement de libération de médicaments26. Les particules plus petites offrent une plus grande surface de transfert de masse, ce qui entraîne un taux de libération de médicament plus élevé. En revanche, la plus petite surface de transfert de masse des particules plus grosses entraîne un taux de diffusion du médicament plus faible à l’intérieur de ces particules.
L’application des méthodes titrimétriques en tant que techniques de base pour la détermination des sites acides et basiques et des groupes fonctionnels présents sur les surfaces solides est en constante expansion. Les principaux avantages du titrage potentiométrique comprennent le gain de temps et de main-d’œuvre, la haute précision et l’élimination des étalons de référence et des appareils coûteux. La méthode a été appliquée dans la présente étude car elle permet de caractériser les particules de biopolymères par détermination qualitative et semi-quantitative de la nature et du nombre de sites actifs présents à la surface des supports de biopolymères chargés et déchargés27.
La charge superficielle des micro-/nano-transporteurs biologiques et médicaux joue un rôle important dans l’absorption cellulaire28. Le pHPZC correspond à une densité de charge de surface nulle, c’est-à-dire à des quantités équivalentes de charges négatives et positives développées par les équilibres de protons. La détermination de ces valeurs fournit des informations sur la spécificité de l’adsorption29. Cependant, comme le paramètre point isoélectrique ne représente que les charges de surface externes des particules en suspension, tandis que le point de charge zéro varie en réponse à la charge de surface nette totale (externe et interne) des particules, le protocole pHpzc a été appliqué pour la première fois dans la présente étude en tant que méthode simple et efficace pour la caractérisation des supports de médicaments biopolymères. Selon le concept de pHpzc, à un pH supérieur au pHpzc, la surface des particules de biopolymère est principalement chargée négativement, tandis qu’une charge positive nette est observée lorsque le pH de la suspension est inférieur au pHpzc. D’après les données expérimentales présentées dans le tableau 1, on a pu conclure que les particules de lignine micro- et submicroniques, déchargées et chargées en flavonoïdes sont chargées négativement parce que leur pH > pHpzc.
L’efficacité de la charge en flavonoïdes est influencée par l’efficacité de l’encapsulation et la capacité de charge du médicament. L’efficacité d’encapsulation (E, %) est définie comme le rapport entre la quantité de médicament incorporée dans les particules et la quantité globale dans la formulation. L’efficacité de l’encapsulation est influencée par les caractéristiques du médicament, le solvant et le support30.
L’administration efficace d’une substance physiologiquement active dépend toutefois de la manière et de la mesure dans lesquelles ses molécules sont libérées de la matrice porteuse. Ainsi, il est très important de considérer le mécanisme de libération du médicament et le taux de libération 31,32,33. En élucidant le mécanisme de libération in vitro des bioflavonoïdes à partir de leurs micro-/nano-porteurs biopolymères, on peut simuler et prédire le comportement du flavonoïde et du porteur dans un milieu physiologique réel et optimiser la conception de formulations pharmaceutiques avec une biodisponibilité améliorée. Les résultats expérimentaux in vitro obtenus dans cette étude sont utiles pour la pratique clinique car ils prouvent qu’en raison de la plus faible quantité de libération de morin/quercétine à partir de lignine submicronique et de microparticules dans l’environnement gastrique, les particules biopolymères innovantes conviennent à l’administration orale en raison du risque plus faible d’irritation gastrique par rapport à l’administration orale directe des substances bioactives. Les microparticules biopolymères innovantes conviennent à l’administration orale en raison du risque plus faible d’irritation gastrique par rapport à l’administration orale directe des substances bioactives. De plus, les particules submicroniques, en raison de leur petite taille et de leur potentiel de libération important, pourraient être appliquées sous forme de formulations injectables. De plus, les nouveaux porteurs de lignine micro- et submicroniques offrent la possibilité de surmonter les limites signalées par d’autres scientifiques liées aux difficultés associées à l’administration orale de fortes doses de certains bioflavonoïdes, résultant de leur tendance à former des solutions saturées dans le tractus intestinal, ce qui entrave à son tour le processus de dissolution et leur résorption efficace.
La facilité de synthèse, la biocompatibilité des particules résultantes, ainsi que la possibilité de personnalisation du protocole actuel, représentent les avantages majeurs de la méthodologie présentée. La taille des particules est optimale pour leurs applications prévues, offrant une surface suffisante disponible pour les accessoires de produits thérapeutiques et de fractions ciblées, ce qui ne nécessite pas l’administration de plus de particules pour atteindre les exigences de dosage cibles. L’utilisation de la lignine comme matrice hétéropolymère de base pour la synthèse de particules innovantes permet une biocompatibilité accrue et offre divers groupes fonctionnels actifs, offrant des possibilités de personnalisation des particules pour diverses applications.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le Fonds scientifique bulgare dans le cadre du contrat n° KΠ-06 H59/3 et par le projet scientifique n° 07/2023 FVM, Université Trakia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
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