Summary
우리는 생체 적합성 리그닌 마이크로 및 서브미크론 입자의 합성 및 특성 분석을 위한 새롭고 간단한 방법론을 설명합니다. 이러한 제형은 헤테로폴리머의 활용을 위한 용이한 접근 방식을 제공할 뿐만 아니라 생물 의학, 제약 기술 및 식품 산업에서 잠재적으로 적용 가능한 다기능 캐리어 매트릭스의 합리적인 설계를 위한 대안을 제공합니다.
Abstract
인간, 수의학, 제약 및 식품 기술에서 생체 고분자 마이크로/나노 기술의 적용 가능성은 효과적인 운반 시스템으로서 생체 고분자 기반 입자의 큰 잠재력으로 인해 빠르게 성장하고 있습니다. 리그닌을 혁신적인 마이크로/서브미크론 제형의 설계를 위한 기본 헤테로폴리머 생체 매트릭스로 사용하면 생체 적합성을 높일 수 있으며 다양한 활성 작용기를 제공하여 다양한 응용 분야에 대한 제형의 물리화학적 특성 및 생체 활성을 맞춤화할 수 있는 기회를 제공합니다. 본 연구의 목적은 마이크로 및 서브미크론 크기의 리그닌 입자를 합성하기 위한 간단하고 친환경적인 방법론을 개발하는 것이었습니다. 그들의 물리화학적, 스펙트럼적, 구조적 특성을 평가하기 위해; 그리고 생물학적으로 활성 분자를 캡슐화할 수 있는 능력과 시뮬레이션된 위장 매체에서 바이오플라보노이드의 체외 방출 가능성을 조사합니다. 제시된 방법론은 저렴하고 친환경적인 용매를 적용합니다. 적은 장비, 무독성 물질, 간단한 특성 분석 방법, 수용성이 낮은 생체 활성 화합물인 모린 및 퀘르세틴에 대한 캡슐화 용량 측정, 리그닌 매트릭스의 체외 방출 잠재력이 필요한 쉽고 간단하며 빠르고 민감한 공정.
Introduction
오늘날 셀룰로오스, 키토산, 콜라겐, 덱스트란, 젤라틴 및 리그닌과 같은 바이오 폴리머에 대한 경향은 조직 공학, 3D 바이오프린팅, 체외에서의 적용 가능성으로 인해 생물 의학, 제약 및 식품 기술 산업에서 맞춤형 크기, 물리화학적 특성 및 생체 기능을 갖춘 마이크로/서브미크론 캐리어 설계의 전구체로 증가하고 있습니다 질병 모델링 플랫폼, 포장 산업, 에멀젼 준비 및 영양소 전달 등 1,2,3.
새로운 연구에서는 리그닌 기반 하이드로겔과 마이크로 및 나노 제형4이 식품포장재5, 에너지 저장6, 화장품7, 열/광 안정제, 강화 재료 및 소수성 분자 전달, UV 장벽개선9을 위한 약물 전달 매트릭스8에 사용되는 유리한 수단으로서의 측면을 강조합니다, 나노 복합 재료의 강화제로, 그리고 최근의 안전 문제로 인해 무기 나노 입자의 대안으로 사용됩니다 10,11,12. 이러한 경향의 원인은 천연 헤테로 바이오 폴리머의 생체 적합성, 생분해성 및 무독성뿐만 아니라 리그닌 항산화 잠재력 및 라디칼 소거, 항증식 및 항균 활성의 입증 된 생체 활성입니다 13,14,15,16,17.
과학 문헌에 따르면 테트라하이드로푸란(THF), 디메틸 설폭사이드(DMSO), N,N-디메틸포름아미드(DMF) 및 아세톤과 같은 비싸거나 유해한 용매의 적용을 포함하여 리그닌 기반 마이크로/나노 스케일 제형의 다양한 합성 방법(자체 조립, 반용매 침전, 산 침전 및 용매 이동)18 및 특성 분석, 많은 장비와 독성 물질을 사용하는 복잡하고 간접적이며 지루한 공정을 포함합니다12,19,20.
후자의 단점을 극복하기 위해 다음 프로토콜은 저렴하고 친환경적인 용매를 사용하여 리그닌 기반 마이크로/서브미크론 입자를 합성하기 위한 새로운 방법론을 제시합니다. 쉽고 간단하며 빠르고 민감한 공정으로 적은 장비, 무독성 물질, 특성 분석 및 수용성이 낮은 생체 활성 화합물에 대한 캡슐화 용량 및 리그닌 매트릭스의 체외 방출 가능성 측정을 위한 간단한 방법을 필요로 합니다. 제시된 실험실 규모의 생산 방법은 생물 의학 및 식품 기술의 다양한 분야에서 응용할 수 있는 간단한 특성 분석 절차와 친환경 화학 물질을 활용하여 조정 가능한 크기, 높은 캡슐화 용량 및 지속 가능한 체외 방출 거동을 가진 기능성 리그닌 운반체의 제조에 유리합니다. 두 개의 플라보노이드를 리그닌 입자에 캡슐화된 표적 분자로 적용했습니다: 모린-미립자로, 퀘르세틴-서브미크론 입자로. 두 플라보노이드의 구조에 있는 다름은 B 방향족 반지에 있는 두번째 -OH 그룹의 위치만 입니다: -OH 그룹은 모린에 있는 2' 위치와 퀘르세틴에 있는 3' 위치에 있습니다, 따라서 두 유기 화합물 다 위치 이성질체입니다. 후자의 사실은 캡슐화 및/또는 방출 과정에서 두 생체 활성 천연 화합물의 유사한 행동을 가정합니다.
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Protocol
1. 리그닌 미세입자의 합성
- 자기 교반기에 50mL의 초순수에 알칼리 리그닌 2.5g을 용해시켜 50mg/mL 알칼리 리그닌 수용액을 준비합니다.
- 1mL의 Tween 80을 1mL의 초순수에 100mL를 용해시켜 80% Tween 80 용액을 준비합니다.
- 6.65mL의 67% HNO3(밀도 = 1.413g/mL) 6.65mL를 초순수로 희석하여 최종 부피 50mL로 HNO3 2M 용액을 준비합니다.
- 1% Tween 80 용액 15mL를 50mg/mL 알칼리 리그닌 용액 50mL에 천천히 추가합니다.
- 계면활성제가 잘 분산되도록 500rpm에서 자성 교반기에서 혼합물을 10분 동안 교반합니다.
- 약 150 μL/s의 유속으로 주사기로 20 mL의 2 M HNO3 를 적가합니다.
- 짙은 갈색 용액이 미립자의 밝은 갈색 현탁액으로 변할 때 혼합물을 30분 동안 계속 저어줍니다.
- 현탁액을 1.5-2mL 시험관으로 옮기고 10°C의 초원심분리기에서 15,000× g 으로 30분 동안 원심분리합니다.
- 추가 분석을 위해 상층액을 수집하고 초순수로 미세입자를 헹굽니다.
- 헹굼/초원심분리 절차를 3번 반복합니다.
- 초음파 균질화 전에 미세 입자가 담긴 용기를 얼음 욕조에 담그십시오.
- 초음파 균질화기에서 93% 강도로 4분 동안 미세입자를 균질화합니다.
- 동결 건조기에서 -64 °C의 온도에서 미세 입자를 동결 건조하고 나중에 사용할 수 있도록 엑시케이터에 보관합니다.
2. 리그닌 서브미크론 입자의 합성
- 자기 교반기에 25mL의 초순수에 125mg의 알칼리 리그닌을 용해시켜 5mg/mL 알칼리 리그닌 수용액을 준비합니다.
- 알칼리 리그닌 용액에 96% EtOH 1mL를 천천히 첨가합니다.
- 500rpm의 자기 교반기에서 혼합물을 3분 동안 교반합니다.
- 구연산 0.5g을 초순수에 50mL의 최종 부피로 녹여 50mL의 구연산 1% 용액 50mL를 준비합니다.
- 약 4mL/분의 유속으로 주사기로 7mL의 1% 구연산을 적가합니다.
- 갈색의 맑은 용액이 미크론 이하의 입자의 흐린 밝은 갈색 현탁액으로 변할 때 혼합물을 10분 동안 계속 저어줍니다.
- 현탁액을 시험관과 원심분리기로 옮기고 10°C의 초원심분리기에서 15,000× g 에서 30분 동안 원심분리합니다.
- 추가 분석을 위해 상층액을 수집하고 초순수로 미세입자를 헹굽니다.
- 헹굼/초원심분리 절차를 3번 반복합니다.
- 초음파 균질화 전에 미세 입자가 담긴 용기를 얼음 욕조에 담그십시오.
- 초음파 균질화기에서 96%의 강도로 각각 4분씩 두 주기 동안 미세입자를 초음파로 균질화합니다.
- 첫 번째 주기 후 1분 동안 용기를 식힙니다.
- 동결 건조기에서 -64 °C의 온도에서 미세 입자를 동결 건조하고 나중에 사용할 수 있도록 엑시케이터에 보관합니다.
3. 천연 플라보노이드 캡슐화 리그닌 마이크로/서브미크론 입자의 합성
- 미세 입자에 대해 1.1-1.5단계를 반복합니다.
- 0.08g의 모린을 칭량하고 EtOH 1mL에 용해시킨 다음 이 에탄올 용액을 혼합물에 첨가합니다.
- 500rpm의 자기 교반기에서 혼합물을 20분 동안 교반합니다.
- 약 150 μL/s의 유속으로 주사기로 2 N HNO3 20 mL를 적가시킵니다.
- 혼합물을 60분 동안 계속 저어줍니다.
- 1.8-1.13단계를 반복합니다.
- 서브미크론 입자에 대해 2.1단계를 반복합니다.
- 퀘르세틴 0.04g을 무게화하고 1mL EtOH에 용해시키고 이 에탄올 용액을 알칼리 리그닌 수용액에 첨가합니다.
- 500rpm의 자기 교반기에서 혼합물을 10분 동안 교반합니다.
- 2.4-2.13단계를 반복합니다.
4. 리그닌 마이크로/수마이크로 입자의 캡슐화 효율 측정
- 두 가지 유형의 플라보노이드 캡슐화된 리그닌 입자의 합성 절차 중에 첨가된 생체 활성 물질의 함량을 계산합니다.
- 96% EtOH로 희석한 후 1.9 및 2.8단계에서 얻은 상층액에서 플라보노이드의 흡수를 분광 광도계로 결정합니다.
- 플라보노이드의 보정 곡선을 사용하여 포획되지 않은 모린/퀘르세틴의 농도를 계산합니다.
- 방정식 (1)을 사용하여 천연 플라보노이드에 대한 리그닌 미세입자의 캡슐화 효율(EE, %)을 계산합니다.
(1)
여기서 w는 첨가된 생리활성물질의 총량(mg)이고,wf 는 유리, 비포획 플라보노이드(mg)의 양이다. - 식 (2)를 사용하여 운반체 시스템의 단위 중량당 입자 내 약물의 양을 나타내는 중요한 매개변수인 약물 적재 용량(DLC, %)을 계산합니다.
(2)
여기서wp 는 동결건조(mg) 후 얻어진 리그닌 마이크로/서브미크론 입자의 총량(수율)입니다.
(1)
(2)5. 리그닌 미세론 및 서브미크론 입자의 특성 분석
- 입자 수, 크기 및 크기 분포 결정
- 비드 계수 옵션이 있는 자동 셀 카운터를 사용하여 시료의 입자 크기 및 입자 크기 분포를 평가합니다. 마이크로피펫으로 리그닌/플라보노이드 마이크로/서브미크론 입자 현탁액 1μL를 작업에 필요한 계수 슬라이드의 웰에 있는 초순수에 추가합니다.
- 현탁액 1mL에 있는 입자의 수와 입자의 수 및 크기별 분포가 자동 셀 카운터의 디스플레이에 표시될 때까지 기다립니다.
알림: 이 장치를 사용하면 USB 플래시에 데이터를 저장할 수 있습니다. 자동 셀 카운터 특수 소프트웨어를 사용하면 저장된 디지털 및 사진 파일을 추가로 처리할 수 있습니다.
- 전위차 적정에 의한 리그닌 입자의 표면 산성/염기성 그룹의 함량 측정
- 무게: 0.04g의 언로드/플라보노이드 캡슐화된 리그닌 입자.
- 삼각 플라스크에 옮기고 0.1M HCl 10mL를 넣은 다음 플라스크를 250rpm의 자석 교반기에 놓습니다.
- 50mL 뷰렛에 적정제 NaOH 0.1M 표준 용액을 채웁니다.
- 적정을 시작하기 전에 벤치 pH 측정기로 Erlenmeyer 플라스크에 있는 용액의 초기 pH를 측정하십시오.
- 적정을 시작하고 적정제의 각 0.5mL 첨가 부분 후에 분석된 용액의 pH를 측정합니다.
- 적용된 적정제의 부피와 해당 pH 값이 포함된 표에 실험 데이터를 저장합니다.
- 적정제 용액의 부피를 증가시켜 pH의 대략 일정한 값에 도달하면 적정을 중지하십시오.
- 실험 데이터를 0, 1차 및 2차 미분 차이 적정 곡선의 형태로 플로팅합니다.
- 사용된 적정제의 등가점과 해당 등가량을 측정합니다.
- 방정식 (3) 및 (4)를 사용하여 무부하 및 플라보노이드 부하 리그닌 입자의 표면에 있는 산성 Aa및 Ab염기성의 함량을 계산합니다.
, MGEQ/G (3)
엠게크/지 (4)
여기서 Veqi 는 당량 부피(mL)이고; NT 적정제의 정규성(mgeqv/mL); VT: 측정 절차에 사용되는 적정제의 부피(mL); m 분석된 샘플(g)의 무게입니다.
- 고체 첨가법에 의한 리그닌 기반 입자의 pHPZC(pH Point of Zero Charge) 측정.
- NaCl 0.1M 수용액 60mL를 준비합니다.
- 5개의 마개가 있는 원추형 플라스크 각각에 9mL의 0.1M NaCl 용액을 첨가하고 pH를 pHi = 2, 4, 7, 10 및 12(여기서 i = 1-5는 해당 용액의 수를 나타냄)로 각각 0.1M HCl 또는 0.1M NaOH를 첨가합니다. 동일한 강도의 NaCl 용액을 첨가하여 각 플라스크에 있는 용액의 총 부피를 정확히 10mL로 조정합니다.
- 각 플라스크에 40mg의 건조 리그닌 입자(무부하, 플라보노이드 로딩 마이크로/서브미크론)를 추가하고 플라스크 뚜껑을 단단히 닫습니다.
- 플라스크를 오비탈 셰이커에 똑바로 세우고 24시간 동안 흔들어 둡니다.
- 30분 동안 평형을 유지한 후 각 플라스크에 있는 상층액의 최종 pH(pHf)를 측정합니다.
- 해당 초기 pH 값(pHi)에 대해 pHf 값을 플로팅합니다.
- 제로 충전 지점(pHPZC)은 곡선 ΔpH 대 pHi 가 좌표(pHi, pHi)와 직선을 교차하는 pH 값으로 정의됩니다.
- 리그닌 입자의 총 페놀 함량(TPC) 측정
참고: 마이크로/서브미크론 리그닌 입자의 총 페놀 함량(TPC)은 수정된 Folin-Ciocalteu 비색법을 통해 측정됩니다.- 농도가 500μg/mL인 입자 수성 현탁액 200μL를 초순수 600μL 및 Folin-Ciocalteu 시약 200μL(1:1, v/v)와 혼합합니다.
- 5분 후 혼합물에 8% Na2CO3 1.0mL와 Milli-Q 물 1.0mL를 넣고 40°C의 어두운 곳에서 간헐적 교반으로 수조에서 30분 동안 배양합니다.
- 5,300× g 에서 2분 동안 현탁액을 원심분리합니다.
- 입자가 없는 블랭크를 준비합니다.
- 10mm 석영 큐벳에서 3.5mL의 상층액을 전사하고 블랭크에 대해 760nm의 가시 영역에서 UV/Vis 분광광도계에서 흡광도를 측정합니다.
- 5.3.1-5.3.5 단계에 따라 표준 갈산의 보정 곡선을 준비합니다. 리그닌 입자 현탁액 200μL 대신 초기 농도가 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 및 200μg/mL인 갈산의 에탄올 용액을 사용하십시오.
- 미세 입자의 실험 데이터를 건조 시료 그램당 밀리그램 단위의 갈산 등가물 mg(mg GAE/g)으로 표현합니다.
- 방정식 (5)를 사용하여 TPC를 계산합니다.
mg GAE/g (5)
여기서, C, GA 는 산의 보정 플롯으로부터 수득된 표준 갈산의 농도와 동등한 샘플의 농도이고(μg, GA/mL); CSS 는 샘플의 농도로, 건조 샘플 질량을 용매의 부피(μg/mL)로 나눈 값과 같습니다.
, MGEQ/G (3)
엠게크/지 (4)
mg GAE/g (5)6. 리그닌 입자의 시험관 내 방출 능력 측정
- 0.1M HCl을 사용한 표준 PBS 용액의 pH를 pH = 1.2로 조정하여 시뮬레이션된 무효소 위 배지 250mL를 준비합니다.
- 0.1M NaOH/0.1M HCl인 표준 PBS 용액의 pH를 각각 pH = 6.8 및 7.4로 조정하여 시뮬레이션된 두 개의 장액 용액 각각을 250mL를 준비합니다.
- 기계식 교반기가 함께 제공되는 유리 배치 반응기에서 시뮬레이션된 효소가 없는 위 배지 50mL에 플라보노이드 캡슐화된 마이크로/서브미크론 입자 25mg을 추가하고 T = 37 ± 0.2 oC의 일정한 온도에서 열수조에 넣습니다.
- 교반기를 액체 부피의 2/3 깊이로 담궈 고체상과 액체상의 완전한 혼합을 보장하고 정체 영역 없이 최대 질량 전달을 보장합니다.
- 반응기에서 10분마다 최대 90분까지 1mL의 샘플을 꺼내고 즉시 1mL의 신선한 시뮬레이션 유체 용액을 반응기에 피펫팅하여 총 부피의 변화를 방지하고 싱크 상태를 확인합니다.
- pH = 6.3 및 6.4인 시뮬레이션된 두 장액 용액을 각각 6.3분 동안 6.8-7.4단계로 포함하여 동일한 절차를 반복합니다.
- 3개의 시뮬레이션된 미디어에서 로드되지 않은 리그닌 입자에 대해 유사한 실험을 수행하고 샘플을 분광 광도계를 영점 조정하기 위한 블랭크로 사용합니다.
- 샘플을 여과하고 단계 6.7의 블랭크 샘플에 대해 96% EtOH로 희석한 후 샘플의 흡수를 분광광도계로 측정하고 pH = 1.2, 6.8 및 7.4에서 각각 얻은 모린의 해당 보정 곡선을 사용하여 해당 플라보노이드 농도를 계산합니다.
- 식 (6)을 사용하여 바이오플라보노이드의 누적 방출량(CR)을 μg/mL 단위로 계산하고 식 (7)으로 누적 방출률(CRP)을 계산합니다.
(6)
여기서, C, i 및 C, i+1 은 i번째 및 (i+1)번째 샘플(μg/mL)의 모린/퀘르세틴 농도입니다. VS배치 반응기(mL)에서 취한 샘플 부피; V 시뮬레이션된 미디어(mL)의 총 부피입니다.
(7)
여기서 Cmax 는 담체 내 생물학적 활성 화합물의 최대 농도(μg/mL)입니다.
(6)
(7)7. 통계 분석
- 실험 데이터를 세 개의 독립적인 측정± 표준 편차(SD)의 평균으로 표현합니다.
- 사후 검정으로 ANOVA 검정을 수행하여 실험 결과의 통계적 유의성을 결정합니다. p < 0.05의 값을 통계적으로 유의하다고 가정합니다.
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Representative Results
알칼리 리그닌 마이크로/서브미크론 입자를 생성하기 위해 용매 방지 침전 기법이 실행되었습니다. 희석 된 무기산-질산 / 유기산-구연산의 수용액을 친환경 계면 활성제 / 에탄올이 풍부한 알칼리 리그닌 수용액에 분산시켜 생체 고분자 용질의 점진적인 침전을 초래했으며, 초음파 처리 후 최종적으로 소형 마이크로 / 서브 미크론 입자의 현탁액이 생성되었습니다 (그림 1).
그림 1: 리그닌 입자의 균질화. (A) 합성된 리그닌 서브미크론 입자의 초음파 균질화; (B) 균질화된 모린-로딩 및 언로딩된 리그닌 미립자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
언로드된 및 모린 캡슐화된 리그닌 마이크로캐리어의 크기, 수 및 크기 분포를 측정했습니다(그림 2). 실험 데이터는 농도가 7.4 ×× 10 6 입자/mL(1,474입자/μL)이고 평균 크기가 5.7μm인 비로딩 마이크로캐리어(그림 2B)가 비로드된 마이크로캐리어보다 1 107 입자/mL(2,037 입자/μL)와 평균 크기(6.1μm)가 더 높은 것으로 입증되었습니다(그림 2A). 크기 범위 3-6 μm 내에서 두 유형의 입자 모두의 퍼센트 크기 분포는 7-10 μm 범위 내에서 언로드된 경우 75.2%, 모린 캡슐화된 마이크로캐리어의 경우 69.3%, 각각 20.2% 및 25.2%였습니다. 반용매인 질산의 양, 농도 및 유속은 입자의 크기에 필수적입니다. 농도가 높고 산의 양이 많을수록 입자가 커지고, 유속이 높을수록 현탁액의 응집을 유발합니다.
그림 2: 입자 크기 분포. (A) 입자 계수기의 현탁액 소프트웨어 1μL에서 무부하 리그닌 미립자의 실제 크기 분포; (B) 입자 계수기의 현탁액 소프트웨어 1μL에서 모린 캡슐화 알칼리 리그닌 미립자의 실제 크기 분포. (C) 입자 계수기: 언로드된 리그닌 미립자의 분포에 대한 현미경 사진; (D) 입자 계수기: 모린 캡슐화된 알칼리 리그닌 미립자의 분포에 대한 현미경 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3은 에탄올 모린 용액, 알칼리 리그닌 수용액, 초기 농도가 다른 모린과 리그닌을 함유한 혼합물의 UV/Vis 흡수 스펙트럼을 보여줍니다. 분명히, 순수 리그닌과 바이오플라보노이드의 흡수 피크는 일치하지 않으며, 헤테로폴리머는 플라보노이드를 폴리머 마이크로캐리어에 캡슐화한 후 액상의 모린 농도를 측정하기 위해 적용된 분광광도법 동안과 시험관 내 방출 실험 중에 어떠한 파괴적인 영향도 미치지 않습니다. 2성분 혼합물에서 모린의 최대 흡수는 알칼리 리그닌의 존재로 인해 매체의 pH가 증가했기 때문에 λmax = 359nm에서 λmax = 395nm로 더 높은 파장으로 이동했습니다. 가시 영역에서 최대 흡수의 후자 편차는 매체의 다양한 pH 값에서 모린의 보정 곡선 설계의 필요성을 유발했습니다(그림 4A). 매우 강한 선형 상관 관계를 특징으로하는 3 개의 표준 곡선은 모린 농도 범위 Co = 2.5-100 μg / mL 내에서 회귀 계수 (R2 > 0.99)의 높은 값에 의해 입증되었습니다. 마찬가지로, 그림 4B에 제시된 3개의 시뮬레이션된 생리학적 구획에서 퀘르세틴의 3가지 표준 곡선은 동일한 농도 범위 내에서 높은 선형성을 보여주었습니다.
그림 3: 모린, 알칼리 리그닌 수용액, 초기 농도가 다른 모린과 리그닌을 함유한 혼합물의 에탄올 용액의 UV/Vis 스펙트럼 비교. 순수 리그닌과 모린의 스펙트럼은 일치하지 않으며 헤테로폴리머는 파괴적인 영향을 미치지 않습니다. 모린에 리그닌을 첨가하면 모린의 최대 흡수율이 λmax = 359nm에서 λmax = 395nm로 더 높은 파장으로 이동합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 에탄올 플라보노이드 용액의 보정 곡선. pH = 1.2(파란색)에서 농도 범위 Co = 2.5-100μg/mL 내의 (A) 모린 및 (B) 퀘르세틴(시뮬레이션된 위액에 해당), pH = 6.8(빨간색)(시뮬레이션된 소장액에 해당) 및 pH = 7.4(녹색)(시뮬레이션된 결장액에 해당). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
무부하 및 부하된 알칼리 리그닌 입자의 표면에 있는 산성 및 염기성 활성 부위/작용기의 상대적 농도는 전위차 적정에 의해 측정되었습니다. 계산은 2차 미분 차이 적정 곡선에 의해 결정된 등가 적분 부피를 기반으로 했습니다(그림 5). 측정된 pKa의 값, 산성(강, 약, 총) 작용기의 농도, 마이크로 및 서브미크론 입자의 pH 및 pHpzc 는 표 1에 나와 있습니다.
그림 5: 무부하 및 로딩된 리그닌 마이크로/서브미크론 입자의 2차 미분 전위차 적정 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 매개 변수 | 리그닌 미세입자 | Morin-encapsulated 리그닌 미세입자 | 리그닌 서브미크론 입자 | 퀘르세틴 캡슐화된 리그닌 서브미크론 입자 |
| Veq., mL | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| 피카 | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa(강), mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa (약), mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa(총), mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH(수성 현탁액) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| 산도pzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
표 1: 적정제의 등가 부피(Veq), 산 해리 상수(pKa)의 음의 염기 -10 로그, 산성(강, 약, 총) 작용기(A, a, mgeq/g)의 농도, 무부하 및 부하 및 로딩된 리그닌 미세 및 서브미크론 입자의 pH 및 제로 전하점(pHpzc). 마이크로 및 서브미크론, 무부하 및 플라보노이드 부하 리그닌 입자는 pH가 pHpzc>하기 때문에 음전하를 띱니다.
변형된 Folin-Ciocalteu 비색법으로 측정하고 갈산 당량으로 계산한 총 페놀 함량(TPC)은 언로드된 리그닌 입자의 78.2mg GAE/g인 반면, 동일한 농도의 모린 캡슐화된 마이크로캐리어의 TPC 값은 2.3배(183.43mg GAE/g) 더 높았습니다. 후자는 헤테로 생체 고분자 입자가 플라보노이드 분자의 통합으로 인해 추가적인 페놀 그룹으로 농축되었음을 나타냅니다. 플라보노이드 캡슐화 효율은 모린의 경우 98.1%, 퀘르세틴의 경우 97.6%였다. 약물 캡슐화 용량은 모린 부하 미세입자의 경우 28.2%, 퀘르세틴 캡슐화된 미크론 이하 입자의 경우 39.0%였습니다.
모린과 퀘르세틴의 체외 누적 방출은 위, 소장 및 결장액이 각각 pH = 1.2, 6.8 및 7.4인 시뮬레이션된 위장관 효소가 없는 매체에서 조사되었습니다(그림 6). 대략 24%의 가장 높은 방출 효율은 pH = 6.8에서 30-40분 후에 달성되었다. 실험 결과에 따르면, 시뮬레이션된 소장 배지에서 방출된 플라보노이드의 양은 시뮬레이션된 결장 환경에서 방출된 것보다 2배 더 많았고, 위에서 측정된 방출 효율의 3배였습니다. 70-90 분에 pH = 7.4에서 SIF에서 확립 된 퀘르세틴 방출의 가장 높은 범위는 34 %였으며, 이는 SGF (pH = 1.2) 및 SIF (pH = 6.8)에서 플라보노이드의 누적 방출량을 23.5 % 및 18 %로 능가했습니다.
그림 6: 시뮬레이션된 생리학적 매질에서 리그닌 미세입자 및 서브미크론 입자의 모린과 퀘르세틴의 누적 체외 방출 효율의 비교 분석. 모린 방출의 가장 높은 정도는 시뮬레이션된 소장 배지에서 달성되었습니다. 퀘르세틴의 가장 높은 방출 효율은 시뮬레이션된 결장액에서 기록되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
생체 고분자를 기반으로 한 약물 전달체 제형의 설계를 위한 현대 합성 방법론의 주요 중요한 문제 중 하나는 테트라하이드로푸란, 아세톤, 메탄올 및 심지어 고농도의 DMSO와 같은 휘발성 및 가연성 용매와 같은 유해 유기 시약의 적용이며, 이는 가능한 독성 효과의 징후로 인해 생물 의학, 제약 산업 및 식품 기술에서의 적용을 제한합니다20, 21,22,23,24. 또 다른 중요한 점은 합성 과정에서 복잡한 화학 반응(예: 에스테르화, 중합) 또는 고가의 장치가 관여한다는 것입니다. 본 논문에 제시된 두 기술 모두 대체 용매(물)와 계면활성제(Tween 80) 및 가교제(에탄올, 구연산)와 같은 무독성 화합물을 함축하여 후자의 한계를 극복하고 이를 "녹색" 합성 방법으로 분류합니다. 또한, 이 방법론은 리그닌 입자의 설계를 위한 저렴하고 친환경적이며 지속 가능한 절차의 개발에 대한 중요한 필요성과 충동을 충족하는 솔루션을 제공하며, 생분해성, 생체 활성 및 생체적합성 담체 템플릿 역할을 합니다25.
원하는 크기의 리그닌 입자를 얻기 위해 두 가지 생산 조건을 선택했습니다: 리그닌 농도가 높고(50g/L) 질산이 반용매제로 사용되고, 리그닌 농도가 낮은 리그닌 농도(5g/L)가 있는 에탄올과 반용매로서의 에탄올, 그리고 리그닌 입자의 크기에 영향을 미치는 두 가지 변수가 항용매와 가교제의 이중 역할을 동시에 수행하는 구연산이 선택되었습니다. 두 절차 중 유속은 더 작은 입자를 제공하고 응집을 방지하기 위해 낮게 유지되었습니다. 합성 프로토콜을 위한 무기산 및 유기산의 선택과 관련하여 고려해야 할 몇 가지 중요한 사항이 있습니다.
질산은 강한 무기산으로 알칼리 리그닌의 침전력이 높고, 이의 첨가 속도를 조절함으로써 원하는 크기 범위 내의 입자를 얻을 수 있기 때문에 선택되었다. 더욱이, HNO3 의 첨가는 다음과 관련된 리그닌 구조의 가능한 화학적 변화로 인해 헤테로 폴리머 입자의 변형을 제공 할 수 있을 것으로 예상됩니다: -NO2 그룹을 가진 벤젠 고리 내 H-원자의 질화-치환 반응 과정; 지방족 -OH 그룹의 에스테르화 및 에스테르 작용기의 형성; 및/또는 페놀 -OH 및 -OCH3 그룹의 산화로 인해 퀴논 구조가 형성됩니다. 합성된 입자의 크기에 대한 침전제와 리그닌 농도의 역할과 관련하여, 한편으로는 강한 질산(pKa = -1.4)의 첨가와 결합된 더 높은 초기 리그닌 농도 및 무기산에서 알칼리 헤테로폴리머의 제한된 용해도로 인해 마이크로미터 범위 내의 입자가 생성되었습니다. 반면에, 농도가 낮은 알칼리 리그닌의 수용액에 에탄올을 첨가하면 알코올에서 알칼리 리그닌의 부분 용해성으로 인해 미세한 현탁액의 형성을 유발합니다. 더욱이, 구연산의 후속 첨가는 유기산이 질산보다 약하기 때문에(pKa1 = 3.13) 결과적으로 더 낮은 강수량 확장을 제공하기 때문에 나노미터 범위 내의 입자를 생성했습니다.
나노 크기의 의약품의 일부 기본 특성은 약물 순환, 특정 부위의 제형에서 약물 방출 및 생체 막을 통한 흡수입니다. 이러한 특성은 나노입자 담체의 일부 물리적, 화학적 특성과 캡슐화된 약물 분자에 의해 상당한 영향을 받습니다.
생체 고분자 담체의 물리화학적 특성: 표면 활성 산성 및 염기성 그룹의 농도, pHPZC(Point of Zero Charge), 크기, 입자 크기 분포 및 생체 활성 물질의 혼입 전후 입자의 스펙트럼 특성은 작용기, 반응성, 작용기를 평가할 때 고려해야 하는 필수 매개변수입니다. 입자의 안정성 및 균질성10.
입자 크기, 입자 크기 분포, 전하 및 형태는 이러한 평가에 영향을 미치는 주요 요인 중 하나입니다. 입자 크기는 안정성, 반응성 및 약물 방출 거동에 영향을 미칩니다26. 입자가 작을수록 질량 전달 영역이 더 넓어지므로 약물 방출률이 높아집니다. 대조적으로, 더 큰 입자의 더 작은 질량 전달 표면적은 이러한 입자 내부의 약물 확산 속도를 낮춥니다.
고체 표면에 존재하는 산성 및 염기성 부위와 작용기를 결정하기 위한 기본 기법으로 적정법의 적용은 지속적으로 확장되고 있습니다. 전위차 적정의 주요 장점에는 시간 및 노동력 절약, 높은 정밀도, 참조 표준 및 고가의 장치 제거가 포함됩니다. 이 방법은 적재 및 무부하 생체 고분자 담체27의 표면에 존재하는 활성 부위의 특성 및 수에 대한 질적 및 반정량적 결정에 의해 생체 고분자 입자의 특성 분석을 가능하게 하기 때문에 본 연구에 적용되었습니다.
생물학적, 의료용 마이크로/나노 담체의 표면 전하는 세포 흡수에 중요한 역할을 한다28. pHPZC 는 제로 표면 전하 밀도, 즉 양성자 평형에 의해 생성된 음전하와 양전하의 등가량에 해당합니다. 이러한 값의 결정은 흡착(29)의 특이성에 대한 정보를 제공한다. 그러나 매개변수 등전점은 현탁액에 있는 입자의 외부 표면 전하만을 나타내는 반면 0 전하점은 입자의 총 순 표면 전하(외부 및 내부)에 대한 반응으로 달라지기 때문에 pHpzc 프로토콜은 생체 고분자 약물 전달체의 특성 분석을 위한 간단하고 효과적인 방법으로 본 연구에서 처음으로 적용되었습니다. pHpzc의 개념에 따르면, pHpzc 이상의 pH에서 생체 고분자 입자의 표면은 주로 음전하를 띠는 반면, 현탁액의 pH가 pHpzc 미만일 때 순 양전하가 관찰됩니다. 표 1에 제시된 실험 데이터로부터, 마이크로 및 서브미크론, 언로드 및 플라보노이드 로딩 리그닌 입자는 pH가 pHpzc>하기 때문에 음전하를 띤다는 결론을 내릴 수 있습니다.
플라보노이드 로딩의 효율성은 캡슐화 효율과 약물 로딩 용량에 의해 영향을 받습니다. 캡슐화 효율(E, %)은 제형의 전체 양에 대한 입자에 포함된 약물의 양의 비율로 정의됩니다. 캡슐화 효율은 약물 특성, 용매, 및 담체(30)에 의해 영향을 받는다.
그러나 생리학적으로 활성 물질의 효율적인 전달은 분자가 캐리어 매트릭스에서 방출되는 방식과 정도에 따라 달라집니다. 따라서, 약물 방출 메커니즘과 방출 속도 31,32,33을 고려하는 것이 매우 중요하다. 생체 고분자 마이크로/나노 담체에서 바이오플라보노이드의 체외 방출 메커니즘을 규명함으로써 실제 생리학적 매체에서 플라보노이드와 담체의 거동을 시뮬레이션 및 예측하고 생체이용률이 향상된 제약 제형의 설계를 최적화할 수 있습니다. 본 연구에서 얻어진 실험적 in vitro 결과는 위환경에서의 리그닌 서브미크론 및 미세입자에서 모린/퀘르세틴 방출 정도가 낮기 때문에 혁신적인 생체고분자 입자가 생리활성물질의 직접 경구투여에 비해 위장 자극의 위험이 낮아 경구투여에 적합하다는 것을 입증함으로써 임상실습에 유용하다. 혁신적인 생체 고분자 미세입자는 생체 활성 물질의 직접 경구 투여에 비해 위 자극의 위험이 낮기 때문에 경구 투여에 적합합니다. 또한, 서브미크론 입자는 크기가 작고 방출 가능성이 크기 때문에 주사 가능한 제형으로 적용할 수 있습니다. 또한, 새로운 리그닌 마이크로 및 서브미크론 담체는 특정 바이오플라보노이드의 고용량 경구 투여와 관련된 어려움과 관련하여 다른 과학자들이 보고한 한계를 극복할 수 있는 기회를 제공하며, 이는 장관에서 포화 용액을 형성하는 경향으로 인해 발생하며, 이는 차례로 용해 과정과 효율적인 흡수를 방해합니다.
합성의 용이성, 생성된 입자의 생체 적합성 및 현재 프로토콜의 사용자 정의 가능성은 제시된 방법론의 주요 이점을 나타냅니다. 입자의 크기는 의도된 응용 분야에 최적이며, 치료제의 부착 및 표적 부분에 사용할 수 있는 충분한 표면적을 제공하며, 이는 목표 투여량 요구 사항을 달성하기 위해 더 많은 입자를 투여할 필요가 없습니다. 리그닌을 혁신적인 입자 합성을 위한 기본 헤테로폴리머 매트릭스로 사용하면 생체 적합성이 향상되고 다양한 활성 작용기를 제공하여 다양한 응용 분야에 맞게 입자를 맞춤화할 수 있는 기회를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 계약 번호 KΠ-06 H59/3에 따라 불가리아 과학 기금(Bulgarian Scientific Fund)과 트라키아 대학교(Trakia University)의 과학 프로젝트 번호 07/2023 FVM의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
References
- Yu, X., et al. Lignin nanoparticles with high phenolic content as efficient antioxidant and sun-blocker for food and cosmetics. ACS Sustainable Chem. Eng. 11 (10), 4082-4092 (2023).
- Boarino, A., Klok, H. -A. Opportunities and challenges for lignin valorization in food packaging, antimicrobial, and agricultural applications. Biomacromolecules. 24 (3), 1065-1077 (2023).
- Aadil, K., Barapatre, A., Jha, H. Synthesis and characterization of Acacia lignin-gelatin film for its possible application in food packaging. Bioresour. Bioprocess. 3 (27), 1-11 (2016).
- Sharma, S., et al. Valorization of lignin into nanoparticles and nanogel: characterization and application. Bioresour. Technol. Reports. 18, 101041 (2022).
- Zadeh, E. M., O'Keefe, S. F., Kim, Y. -T.
- Beaucamp, A., et al. Lignin for energy applications - state of the art, life cycle, technoeconomic analysis and future trends (Critical Review). Green Chem. 24, 8193-8226 (2022).
- Antunes, F., et al. From sugarcane to skin: Lignin as a multifunctional ingredient for cosmetic application. Int J Biol Macromol. 234, 123592 (2023).
- Garg, J., et al. Applications of lignin nanoparticles for cancer drug delivery: An update. Materials Letters. 311, 131573 (2022).
- Anushikha, K. K. Lignin as a UV blocking, antioxidant, and antimicrobial agent for food packaging applications. Biomass Conv. Bioref. , 1-14 (2023).
- Freitas, F. M. C., et al. synthesis of lignin nano- and micro-particles: Physicochemical characterization, bioactive properties and cytotoxicity assessment. Int J Biol Macromol. 163, 1798-1809 (2020).
- Rismawati, R., Nurdin, I. A., Pradiptha, M. N., Maulidiyah, A., Mubarakati, N. J. Preparation and characterization of lignin nanoparticles from rice straw after biosynthesis using Lactobacillus bulgaricus. Journal of Physics: Conference Series. 9th International Seminar on New Paradigm and Innovation of Natural Sciences and its Application. 1524, 012070 (2020).
- Worku, L. A., et al. Synthesis of lignin nanoparticles from Oxytenanthera abyssinica by nanoprecipitation method followed by ultrasonication for the nanocomposite application. Journal of King Saud University - Science. 35 (7), 102793 (2023).
- Gala Morena, A., Tzanov, T. z Antibacterial lignin-based nanoparticles and their use in composite materials. Nanoscale Adv. 4, 4447-4469 (2022).
- Ivanova, D., Nikolova, G., Karamalakova, Y., Marutsova, V., Yaneva, Z. Water-soluble alkali lignin as a natural radical scavenger and anticancer alternative. Int J Mol Sci. 24 (16), 12705 (2023).
- Ivanova, D., Toneva, M., Simeonov, E., Antov, G., Yaneva, Z. Newly synthesized lignin microparticles as bioinspired oral drug-delivery vehicles: Flavonoid-carrier potential and in vitro radical-scavenging activity. Pharmaceutics. 15 (4), 1067 (2023).
- Yaneva, Z., et al. Antimicrobial potential of conjugated lignin/morin/chitosan combinations as a function of system complexity. Antibiotics. 11, 650 (2022).
- Handral, H. K., Wyrobnik, T. A., Lam, A. T. -L. Emerging trends in biodegradable microcarriers for therapeutic applications. Polymers. 15 (6), 1487 (2023).
- Figueiredo, P., Lintinen, K., Hirvonen, J. T., Kostiainen, M. A., Santos, H. A. Properties and chemical modifications of lignin: Towards lignin-based nanomaterials for biomedical applications. Prog. Mater. Sci. 93, 233-269 (2018).
- Tang, Q., et al. Lignin-based nanoparticles: a review on their preparations and applications. Polymers. 12 (11), Basel. 2471 (2020).
- Zhao, W., Simmons, B., Singh, S., Ragauskas, A., Cheng, G. From lignin association to nano-/micro-particle preparation: extracting higher value of lignin. Green Chemistry. 18 (21), 5693-5700 (2016).
- Stewart, H., Golding, M., Matia-Merino, L., Archer, R., Davies, C. Manufacture of lignin microparticles by anti-solvent precipitation: Effect of preparation temperature and presence of sodium dodecyl sulfate. Food Res Int. 66, 93-99 (2014).
- Beisl, S., Friedl, A., Miltner, A. Lignin from micro- to nanosize: Applications. Int. J. Mol. Sci. 18, 2367 (2017).
- Mishra, P. K., Ekielski, A. A simple method to synthesize lignin nanoparticles. Colloids Interfaces. 3, 52 (2019).
- Qian, Y., Deng, Y., Qiu, X., Li, H., Yang, D. Formation of uniform colloidal spheres from lignin, a renewable resource recovered from pulping spent liquor. Green Chem. 16, 2156-2163 (2014).
- Tardy, B. L., et al. Lignin nano- and microparticles as template for nanostructured materials: formation of hollow metal-phenolic capsules. Green Chem. 20, 1335-1344 (2018).
- Silva, M., et al. Paraquat-loaded alginate/chitosan nanoparticles: preparation, characterization and soil sorption studies. J Haz Mat. 190 (1-3), 366-374 (2011).
- Georgieva, N., Yaneva, Z. Comparative evaluation of natural and acid-modified layered mineral materials as rimifon-carriers using UV/VIS, FTIR, and equilibrium sorption study. Cogent Chem. 1 (1), 1-16 (2015).
- Zhang, P., Chen, D., Li, L., Sun, K. Charge reversal nano-systems for tumor therapy. J Nanobiotechnol. 20, 31 (2022).
- Yaneva, Z. L., Georgieva, N. V. Removal of diazo dye from the aqueous phase by biosorption onto ball-milled maize cob (BMMC) biomass of Zea mays. Maced. J. Chem. Chem. Eng. 32 (1), 133-149 (2013).
- Zatorska, M., et al. Drug-loading capacity of polylactide-based micro- and nanoparticles - Experimental and molecular modeling study. Int J Pharmaceutics. 591, 120031 (2020).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Chapter 5 - Physicochemical and morphological characterization of pharmaceutical nanocarriers and mathematical modeling of drug encapsulation/release mass transfer processes. Nanoscale Fabrication, Optimization, Scale-Up and Biological Aspects of Pharmaceutical Nanotechnology. Grumezescu, A. M. , William Andrew Publishing. 173-218 (2018).
- Yaneva, Z., Georgieva, N., Staleva, M. Development of d,l-α-tocopherol acetate/zeolite carrier system: equilibrium study. Monatshefte fur Chemie Chemical Monthly. 147 (7), 1167-1175 (2016).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Study on the physical chemistry, equilibrium, and kinetic mechanism of Azure A biosorption by Zea mays biomass. Journal of Dispersion Science and Technology. 35 (2), 193-204 (2014).
