Summary
Describimos metodologías novedosas y sencillas de síntesis y caracterización de micro y submicrónicas de lignina biocompatibles. Estas formulaciones proporcionan un enfoque fácil para la utilización del heteropolímero, así como una alternativa para el diseño racional de matrices portadoras multifuncionales con potencial aplicabilidad en biomedicina, tecnología farmacéutica e industria alimentaria.
Abstract
La aplicabilidad de la micro y nanotecnología de biopolímeros en la tecnología humana, veterinaria, farmacéutica y alimentaria está creciendo rápidamente debido al gran potencial de las partículas basadas en biopolímeros como sistemas portadores eficaces. El uso de la lignina como biomatriz básica de heteropolímeros para el diseño de formulaciones micro / submicrónicas innovadoras permite el logro de una mayor biocompatibilidad y ofrece varios grupos funcionales activos que presentan oportunidades para la personalización de las propiedades fisicoquímicas y bioactividades de las formulaciones para diversas aplicaciones. El objetivo del presente estudio fue desarrollar una metodología simple y ecológica para la síntesis de partículas de lignina con tamaño micro y submicrónico; evaluar sus características fisicoquímicas, espectrales y estructurales; y examinar su capacidad para la encapsulación de moléculas biológicamente activas y su potencial para la liberación in vitro de bioflavonoides en medios gastrointestinales simulados. Las metodologías presentadas aplican solventes baratos y verdes; Procesos fáciles, sencillos, rápidos y sensibles que requieren poco equipo, sustancias no tóxicas y métodos sencillos para su caracterización, la determinación de la capacidad de encapsulación hacia los compuestos bioactivos poco solubles en agua morina y quercetina, y el potencial de liberación in vitro de las matrices de lignina.
Introduction
Hoy en día, la inclinación hacia biopolímeros como la celulosa, el quitosano, el colágeno, el dextrano, la gelatina y la lignina como precursores para el diseño de portadores micro/submicrónicos con tamaño, propiedades fisicoquímicas y biofuncionalidades personalizables ha aumentado en las industrias biomédica, farmacéutica y de tecnología alimentaria debido a su aplicabilidad en ingeniería de tejidos, bioimpresión 3D, in vitro plataformas de modelado de enfermedades, industria de empaque, preparación de emulsiones y entrega de nutrientes, entre otros 1,2,3.
Los nuevos estudios destacan los aspectos de los hidrogeles a base de lignina, así como de las micro y nanoformulaciones4 como vehículos ventajosos utilizados para los materiales de envasado de alimentos5, el almacenamiento de energía6, los cosméticos7, los estabilizadores térmicos/ligeros, los materiales reforzados y las matrices portadoras de fármacos8 para la administración de moléculas hidrofóbicas, la mejora de las barreras UV9, como agentes de refuerzo en nanocompuestos, y como alternativa a las nanopartículas inorgánicas debido a algunos problemas de seguridad recientes 10,11,12. La razón detrás de esta tendencia es la biocompatibilidad, biodegradabilidad y no toxicidad del heterobiopolímero natural, así como sus bioactividades comprobadas de potencial antioxidante de lignina y actividades antiproliferativas y antimicrobianas 13,14,15,16,17.
La literatura científica reporta varios métodos para la síntesis (autoensamblaje, precipitación anti-solvente, precipitación ácida y cambio de solvente)18 y la caracterización de formulaciones a micro / nano escala basadas en lignina, incluida la aplicación de solventes costosos o dañinos como tetrahidrofurano (THF), dimetilsulfóxido (DMSO), N,N-dimetilformamida (DMF) y acetona, y procesos complicados, indirectos y tediosos que utilizan una gran cantidad de equipos y sustancias tóxicas 12,19,20.
Para superar estas últimas desventajas, los siguientes protocolos presentan metodologías novedosas para la síntesis de partículas micro/submicrónicas basadas en lignina utilizando disolventes baratos y ecológicos; Procesos fáciles, sencillos, rápidos y sensibles que requieren poco equipo, sustancias no tóxicas y métodos sencillos para su caracterización y la determinación de la capacidad de encapsulación hacia compuestos bioactivos poco solubles en agua y el potencial de liberación in vitro de las matrices de lignina. Los métodos de producción a escala de laboratorio presentados son ventajosos para la fabricación de portadores de lignina funcionales con tamaños ajustables, alta capacidad de encapsulación y comportamiento de liberación in vitro sostenible utilizando procedimientos de caracterización simples y productos químicos ecológicos que pueden encontrar aplicación en diversas áreas de las ciencias biomédicas y la tecnología de los alimentos. Se aplicaron dos flavonoides como moléculas diana encapsuladas en las partículas de lignina: morina, en las micropartículas, y quercetina, en las partículas submicrónicas. La diferencia en las estructuras de ambos flavonoides es solo la posición del segundo grupo -OH en el anillo aromático B: el grupo -OH está en la posición 2' en morina y en la posición 3' en quercetina, por lo que ambos compuestos orgánicos son isómeros posicionales. Este último hecho supone un comportamiento similar de ambos compuestos naturales bioactivos en los procesos de encapsulación y/o liberación.
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Protocol
1. Síntesis de micropartículas de lignina
- Prepare una solución acuosa de lignina alcalina de 50 mg/ml disolviendo 2,5 g de lignina alcalina en 50 ml de agua ultrapura en un agitador magnético.
- Prepare la solución de Tween 80 al 1% disolviendo 1 mL de Tween 80 en 100 mL de agua ultrapura.
- Prepare una solución 2 M deHNO3 diluyendo 6,65 mL deHNO3 al 67% (densidad = 1,413 g/mL) con agua ultrapura hasta un volumen final de 50 mL.
- Agregue lentamente 15 mL de la solución de Tween 80 al 1% a 50 mL de la solución de lignina alcalina de 50 mg/mL.
- Agite la mezcla en un agitador magnético a 500 rpm durante 10 minutos para que el tensioactivo se disperse bien.
- Añadir 20 mL de 2 M de HNO3 gota a gota con una jeringa a un caudal de aproximadamente 150 μL/s a la mezcla.
- Continúe revolviendo la mezcla durante 30 minutos cuando la solución de color marrón oscuro se transforme en una suspensión de micropartículas de color marrón claro.
- Transfiera la suspensión a tubos de ensayo de 1,5-2 ml y centrifuga durante 30 minutos a 15.000 × g en una ultracentrífuga a 10 °C.
- Recoja el sobrenadante para posteriores análisis y enjuague las micropartículas con agua ultrapura.
- Repita los procedimientos de enjuague/ultracentrifugación 3 veces.
- Sumerja el recipiente con las micropartículas en un baño de hielo antes de la homogeneización ultrasónica.
- Homogeneizar las micropartículas durante 4 min a una intensidad del 93% en un homogeneizador de ultrasonidos.
- Liofilizar las micropartículas a una temperatura de -64 °C en un liofilizador y almacenarlas en un exicador para su uso posterior.
2. Síntesis de partículas submicrónicas de lignina
- Prepare una solución acuosa de lignina alcalina de 5 mg/ml disolviendo 125 mg de lignina alcalina en 25 ml de agua ultrapura en un agitador magnético.
- Agregue lentamente 1 mL de EtOH al 96% a la solución de lignina alcalina.
- Agite la mezcla en un agitador magnético a 500 rpm durante 3 min.
- Prepare 50 mL de una solución al 1% de ácido cítrico disolviendo 0,5 g de ácido cítrico en agua ultrapura hasta un volumen final de 50 mL.
- Añadir 7 mL de ácido cítrico al 1% gota a gota con una jeringa a un caudal de aproximadamente 4 mL/min a la mezcla.
- Continúe revolviendo la mezcla durante 10 minutos cuando la solución marrón clara se transforme en una suspensión turbia de partículas submicrónicas de color marrón claro.
- Transfiera la suspensión a tubos de ensayo y centrifuga durante 30 min a 15.000 × g en una ultracentrífuga a 10 °C.
- Recoja el sobrenadante para posteriores análisis y enjuague las micropartículas con agua ultrapura.
- Repita los procedimientos de enjuague/ultracentrifugación 3 veces.
- Sumerja el recipiente con las micropartículas en un baño de hielo antes de la homogeneización ultrasónica.
- Homogeneizar las micropartículas por ultrasonidos durante dos ciclos de 4 min cada uno a una intensidad del 96% en un homogeneizador de ultrasonidos.
- Enfríe los recipientes durante 1 minuto después del primer ciclo.
- Liofilizar las micropartículas a una temperatura de -64 °C en un liofilizador y almacenarlas en un exicador para su uso posterior.
3. Síntesis de partículas micro/submicrónicas de lignina encapsuladas en flavonoides naturales
- Repita los pasos 1.1-1.5 para las micropartículas.
- Pesar 0,08 g de morina, disolverlo en 1 mL de EtOH y añadir esta solución etanólica a la mezcla.
- Agite la mezcla en un agitador magnético a 500 rpm durante 20 min.
- Añadir 20 mL de 2 N HNO3 gota a gota con una jeringa a un caudal de aproximadamente 150 μL/s a la mezcla.
- Continúa revolviendo la mezcla durante 60 min.
- Repita los pasos 1.8-1.13.
- Repita el paso 2.1 para las partículas submicrónicas.
- Peso 0,04 g de quercetina, disolverla en 1 mL de EtOH y añadir esta solución etanólica a la solución acuosa de lignina alcalina.
- Agite la mezcla en un agitador magnético a 500 rpm durante 10 min.
- Repita los pasos 2.4-2.13.
4. Determinación de la eficiencia de encapsulación de micro-/sumicro-partículas de lignina
- Calcular el contenido de la sustancia bioactiva añadida durante el procedimiento de síntesis de ambos tipos de partículas de lignina encapsuladas en flavonoides.
- Determinar espectrofotométricamente la absorción del flavonoide en el sobrenadante obtenido durante los pasos 1.9 y 2.8 después de diluirlo con EtOH al 96%.
- Calcular la concentración de la morina/quercetina no atrapada utilizando las curvas de calibración de los flavonoides.
- Calcule la eficiencia de encapsulación (EE, %) de las micropartículas de lignina hacia los flavonoides naturales utilizando la ecuación (1):
(1)
Donde wo es la cantidad total de la sustancia bioactiva añadida (mg) y wf es la cantidad de flavonoide libre no atrapado (mg). - Calcule la capacidad de carga del fármaco (DLC, %), un parámetro importante que representa la cantidad de fármaco en las partículas por unidad de peso del sistema portador, utilizando la ec. (2):
(2)
Donde wp es la cantidad total (rendimiento) de partículas micro/submicrónicas de lignina obtenidas después de la liofilización (mg).
(1)
(2)5. Caracterización de partículas micro y submicrónicas de lignina
- Determinación del número de partículas, tamaño y distribución de tamaño
- Evalúe el tamaño de partícula y la distribución del tamaño de partícula de las muestras utilizando un contador de celdas automático con la opción de recuento de cuentas. Añadir con una micropipeta 1 μL de la suspensión de partículas micro/submicrónicas de lignina/flavonoide en agua ultrapura en el pocillo del portaobjetos de recuento necesario para la operación.
- Espere a que el número de partículas en 1 mL de la suspensión, así como su número y distribución por tamaño se muestren en la pantalla del contador automático de celdas.
NOTA: El aparato permite el almacenamiento de los datos en una memoria flash USB. El software especial de contador automático de células permite el procesamiento posterior de los archivos digitales y fotográficos guardados.
- Determinación del contenido de grupos ácidos/básicos superficiales de partículas de lignina mediante valoración potenciométrica
- Peso: 0,04 g de partículas de lignina descargadas/encapsuladas en flavonoides.
- Transfiéralos a un matraz Erlenmeyer, agregue 10 mL de HCl 0,1 M y coloque el matraz en un agitador magnético a 250 rpm.
- Llene una bureta de 50 mL con una solución estándar de 0,1 M del valorante NaOH.
- Mida el pH inicial de la solución en el matraz Erlenmeyer con un medidor de pH de banco antes de comenzar la valoración.
- Inicie la valoración y mida el pH de la solución analizada después de cada porción añadida de 0,5 mL del valorante.
- Almacene los datos experimentales en una tabla que contenga el volumen del valorante aplicado y el valor correspondiente de pH.
- Detenga la valoración cuando se alcance un valor aproximadamente constante del pH aumentando el volumen de la solución valorante.
- Trace los datos experimentales en forma de curvas de valoración diferencial de cero, primera y segunda derivada.
- Determine los puntos equivalentes y los volúmenes equivalentes correspondientes de los valorantes utilizados.
- Calcule el contenido de los grupos básicos ácidos A,ay A, ben la superficie de las partículas de lignina descargadas y cargadas de flavonoides utilizando las ecuaciones (3) y (4):
, mgeq/g (3)
mgeq/g (4)
Donde Veqi es el volumen equivalente (mL); NT la normalidad del valorante (mgeqv/mL); VT el volumen del valorante utilizado para el procedimiento de determinación (mL); m el peso de la muestra analizada (g).
- Determinación del punto de pH de carga cero (pHPZC) de partículas basadas en lignina por el método de adición de sólidos.
- Prepare 60 mL de solución acuosa 0,1 M de NaCl.
- Añadir 9 mL de la solución de NaCl 0,1 M en cada uno de los cinco matraces cónicos tapados y ajustar el pH a pHi = 2, 4, 7, 10 y 12 (donde i = 1-5 denota el número de la solución correspondiente), respectivamente mediante la adición de 0,1 M de HCl o 0,1 M de NaOH. Ajuste el volumen total de la solución en cada matraz a 10 mL exactamente agregando una solución de NaCl de la misma concentración.
- Añadir 40 mg de partículas secas de lignina (micro/submicrónicas sin carga, cargadas con flavonoides) a cada matraz y tapar los matraces de forma segura.
- Fije los matraces en posición vertical sobre un agitador orbital y manténgalos agitados durante 24 horas.
- Dejar el equilibrio durante 30 min y posteriormente medir el pH final (pHf) de los sobrenadantes de cada matraz.
- Trace los valoresde pH f con los valores de pH iniciales correspondientes (pHi).
- El punto de carga cero (pHPZC) se define como el valor de pH en el que la curva ΔpH frente a pHi cruza la línea recta con coordenadas (pHi; pHi).
- Determinación del contenido fenólico total (TPC) de las partículas de lignina
NOTA: El contenido fenólico total (TPC) de las partículas de lignina micro/submicrónicas se determina mediante un método colorimétrico de Folin-Ciocalteu modificado.- Mezclar 200 μL de una suspensión acuosa de partículas con una concentración de 500 μg/mL con 600 μL de agua ultrapura y 200 μL de reactivo Folin-Ciocalteu (1:1, v/v).
- Después de 5 min, agregue 1,0 mL de 8% Na2CO3 y 1,0 mL de agua Milli-Q a la mezcla e incube en la oscuridad a 40 °C durante 30 min en un baño de agua con agitación intermitente.
- Centrifugar la suspensión a 5.300 × g durante 2 min.
- Prepare un blanco que no contenga partículas.
- Transfiera 3,5 mL del sobrenadante en una cubeta de cuarzo de 10 mm y mida la absorbancia en un espectrofotómetro UV/Vis en la región visible a 760 nm contra el blanco.
- Prepare una curva de calibración del ácido gálico patrón siguiendo los pasos 5.3.1-5.3.5; solo que en lugar de 200 μL de la suspensión de partículas de lignina, utilice la solución etanólica de ácido gálico con concentraciones iniciales de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 y 200 μg/mL.
- Expresar los datos experimentales de las micropartículas como mg de equivalentes de ácido gálico en miligramos por gramo de muestra seca (mg GAE/g).
- Calcule el TPC usando la ecuación (5):
mg GAE/g (5)
Donde CGA es la concentración de la muestra equivalente a la concentración del ácido gálico patrón obtenida de la gráfica de calibración del ácido (μg GA/mL); Cs es la concentración de la muestra, que es igual a la masa de la muestra seca dividida por el volumen del disolvente (μg/mL).
, mgeq/g (3)
mgeq/g (4)
mg GAE/g (5)6. Determinación de la capacidad de liberación in vitro de las partículas de lignina
- Prepare 250 mL de medio gástrico simulado libre de enzimas ajustando el pH de la solución estándar de PBS con 0,1 M de HCl a pH = 1,2.
- Prepare 250 mL de cada una de las dos soluciones de fluido intestinal simuladas ajustando el pH de la solución estándar de PBS con 0,1 M de NaOH/0,1 M de HCl a pH = 6,8 y 7,4, respectivamente.
- Añadir 25 mg de partículas micro/submicrónicas encapsuladas en flavonoides a 50 mL del medio gástrico libre de enzimas simulado en un reactor discontinuo de vidrio provisto de un agitador mecánico y colocarlo en un baño de agua termal a una temperatura constante de T = 37 ± 0,2 oC.
- Sumerja el agitador a una profundidad de 2/3 del volumen de líquido para asegurar una mezcla completa de las fases sólida y líquida y garantizar la máxima transferencia de masa sin zonas estancadas.
- Extraiga 1 mL de muestra del reactor cada 10 min hasta elminuto 90 e inmediatamente pipetee 1 mL de solución de fluido simulado fresco en el reactor para evitar cambios en el volumen total y garantizar las condiciones de hundimiento.
- Repita el mismo procedimiento incluyendo los pasos 6.3-6.6 con ambas soluciones de fluido intestinal simuladas con pH = 6.8 y 7.4, respectivamente, durante 200 min.
- Realice experimentos análogos con partículas de lignina descargadas en los tres medios simulados y utilice las muestras como blancos para poner a cero el espectrofotómetro.
- Determine la absorción de las muestras espectrofotométricamente después de filtrar las muestras y diluirlas con EtOH al 96% frente a las muestras en blanco del paso 6.7 y calcule la concentración de flavonoides correspondiente utilizando las curvas de calibración correspondientes de morin obtenidas a pH = 1.2, 6.8 y 7.4, respectivamente.
- Calcular la liberación acumulada (RC) de los bioflavonoides utilizando la ecuación (6) en μg/mL y el porcentaje de liberación acumulada (PCR) mediante la ecuación (7):
(6)
Donde Ci y Ci+1 son las concentraciones de morina/quercetina en las muestras iésima y (i+1)ésima (μg/mL); Vs el volumen de muestra tomado del reactor discontinuo (mL); V el volumen total de los medios simulados (mL).
(7)
Donde Cmax es la concentración máxima del compuesto biológicamente activo en el portador (μg/mL).
(6)
(7)7. Análisis estadísticos
- Expresar los datos experimentales como medias ± desviaciones estándar (DE) de tres mediciones independientes.
- Determinar la significación estadística de los resultados experimentales mediante la realización de la prueba de ANOVA como prueba post hoc. Considere un valor de p < 0,05 estadísticamente significativo.
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Representative Results
Se ejecutó una técnica de precipitación anti-solvente para producir partículas micro y submicrónicas de lignina alcalina. Una solución acuosa de ácido inorgánico-ácido nítrico/ácido orgánico-ácido cítrico diluido se dispersó en una solución acuosa de lignina alcalina, enriquecida con un tensioactivo/etanol respetuoso con el medio ambiente, lo que dio lugar a la precipitación gradual del soluto biopolímero y, tras la sonicación, se produjo finalmente una suspensión de partículas compactas micro/submicrónicas (Figura 1).
Figura 1: Homogeneización de partículas de lignina. (A) Homogeneización ultrasónica de las partículas submicrónicas de lignina sintetizadas; (B) Micropartículas de lignina homogeneizadas cargadas y descargadas de morina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se determinó el tamaño, el número y la distribución de tamaño de los microportadores de lignina descargados y encapsulados en morina (Figura 2). Los datos experimentales demostraron una mayor concentración, 1 × 107 partículas/mL (2.037 partículas/μL), y un tamaño medio más alto, 6,1 μm, de los microportadores cargados con bioflavonoides (Figura 2B) que los descargados, con una concentración de 7,4 × 106 partículas/mL (1.474 partículas/μL) y un tamaño medio de 5,7 μm (Figura 2A). La distribución porcentual del tamaño de ambos tipos de partículas dentro del rango de tamaño de 3-6 μm fue del 75,2% para los microportadores sin carga y del 69,3% para los microportadores encapsulados con morina y del 20,2% y 25,2%, respectivamente, dentro del rango de 7-10 μm. La cantidad, la concentración y el caudal del antidisolvente, el ácido nítrico, son esenciales para el tamaño de las partículas. La mayor concentración y mayor cantidad de ácido conduce a partículas más grandes, mientras que el mayor caudal provoca la agregación de la suspensión.
Figura 2: Distribución del tamaño de las partículas. (A) Distribución del tamaño real de las micropartículas de lignina descargadas en 1 μL del software de suspensión del contador de partículas; (B) distribución del tamaño real de las micropartículas de lignina alcalina encapsuladas en morina en 1 μL del software de suspensión del contador de partículas. (C) Foto microscópica del contador de partículas de la distribución de las micropartículas de lignina descargadas; (D) foto microscópica del contador de partículas de la distribución de las micropartículas de lignina alcalina encapsuladas en morina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En la Figura 3 se presentan los espectros de absorción UV/Vis de las soluciones de etanol morina, las soluciones acuosas de lignina alcalina y las mezclas que contienen morina y lignina con diferentes concentraciones iniciales. Obviamente, los picos de absorción de la lignina pura y del bioflavonoide no coinciden y el heteropolímero no ejerce ninguna influencia disruptiva durante el método espectrofotométrico aplicado para la determinación de la concentración de morina en la fase líquida después de la encapsulación del flavonoide en los microportadores poliméricos y durante los experimentos de liberación in vitro . La absorción máxima de morina en la mezcla de dos componentes se desplazó a una longitud de onda más alta, de λmax = 359 nm a λmax = 395 nm, como resultado del aumento del pH del medio debido a la presencia de lignina alcalina. Esta última desviación del máximo de absorción en el área visible provocó la necesidad de diseñar curvas de calibración de morina a varios valores de pH del medio (Figura 4A). Las tres curvas estándar caracterizadas por correlaciones lineales muy marcadas fueron comprobadas por los altos valores de los coeficientes de regresión (R2 > 0,99) dentro del rango de concentración de morina Co = 2,5-100 μg/mL. De manera similar, las tres curvas estándar de quercetina en los tres compartimentos fisiológicos simulados, presentados en la Figura 4B, mostraron una alta linealidad dentro del mismo rango de concentración.
Figura 3: Comparación de los espectros UV/Vis de soluciones etanólicas de morina, soluciones acuosas de lignina alcalina y mezclas que contienen morina y lignina con diferentes concentraciones iniciales. Los espectros de lignina pura y morina no coinciden y el heteropolímero no ejerce ninguna influencia disruptiva. La adición de lignina a la morina conduce a un cambio de la absorción máxima de morina a una longitud de onda más alta, de λmax = 359 nm a λmax = 395 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Curvas de calibración de soluciones etanólicas de flavonoides. (A) Morina y (B) quercetina dentro del rango de concentración Co = 2,5-100 μg/mL a pH = 1,2 (en azul) (correspondiente al líquido gástrico simulado), pH = 6,8 (en rojo) (correspondiente al líquido intestinal delgado simulado) y pH = 7,4 (en verde) (correspondiente al líquido de colon simulado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La concentración relativa de ácidos y sitios activos/grupos funcionales básicos en la superficie de las partículas de lignina alcalina descargadas y cargadas se determinó mediante valoración potenciométrica. Los cálculos se basaron en los volúmenes equivalentes del valorante determinados por las curvas de valoración diferencial de la segunda derivada (Figura 5). En la Tabla 1 se presentan los valores del pKa determinado, las concentraciones de grupos funcionales ácidos (fuerte, débil, total) y el pH yel pH pzc de las partículas micro y submicrónicas.
Figura 5: Curvas de valoración potenciométrica diferencial de la segunda derivada de las micro/submicrónicas de lignina descargadas y cargadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetro | Micropartículas de lignina | Micropartículas de lignina encapsuladas en Morin | Partículas submicrónicas de lignina | Partículas submicrónicas de lignina encapsuladas en quercetina |
| Vec., mL | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| pKa | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa (fuerte), mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa (débil), mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa (total), mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH (suspensión acuosa) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| pHpzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
Tabla 1: Valores del volumen equivalente de valorante (Veq), el logaritmo de base negativa -10 de la constante de disociación ácida (pKa), las concentraciones de grupos funcionales ácidos (fuerte, débil, total) (Aa, mgeq/g), el pH y el punto de carga cero (pHpzc) de las micro y submicrónicas de lignina descargadas y cargadas. Las partículas de lignina micro y submicrónicas, descargadas y cargadas con flavonoides están cargadas negativamente porque su pH >pH pzc.
El contenido fenólico total (TPC), determinado por un método colorimétrico de Folin-Ciocalteu modificado y calculado como equivalentes de ácido gálico, fue de 78,2 mg GAE/g de las partículas de lignina descargadas, mientras que el valor de TPC de los microportadores encapsulados en morina con la misma concentración fue 2,3 veces mayor (183,43 mg GAE/g). Esto último indica que las partículas hetero biopoliméricas se enriquecen con grupos fenólicos adicionales debido a la incorporación de las moléculas flavonoides. La eficiencia de encapsulación de flavonoides fue: 98,1% para morin y 97,6% para quercetina. Las capacidades de encapsulación del fármaco fueron del 28,2% para las micropartículas cargadas con morina y del 39,0% para las partículas submicrónicas encapsuladas con quercetina.
Se investigó la liberación acumulativa in vitro de morina y quercetina en medios gastrointestinales simulados libres de enzimas: líquidos gástricos, del intestino delgado y del colon a pH = 1,2, 6,8 y 7,4, respectivamente (Figura 6). La mayor eficiencia de liberación de aproximadamente el 24% se logró después de 30-40 min a pH = 6,8. De acuerdo con los resultados experimentales, la cantidad de flavonoide liberado en el medio del intestino delgado simulado prevaleció dos veces la liberada en el ambiente de colon simulado y tres veces la eficiencia de liberación determinada en el estómago. La mayor extensión de liberación de quercetina establecida en SIF a pH = 7.4 en el minuto 70-90fue del 34%, superando la liberación acumulada del flavonoide en SGF (pH = 1.2) y SIF (pH = 6.8) con 23.5% y 18%, respectivamente.
Figura 6: Análisis comparativos de la eficiencia acumulativa de liberación in vitro de morina y quercetina a partir de partículas micro y submicrónicas de lignina en medios fisiológicos simulados. El mayor grado de liberación de morina se logró en el medio del intestino delgado simulado. La mayor eficiencia de liberación de quercetina se registró en el líquido de colon simulado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Entre los principales aspectos críticos de las metodologías modernas de síntesis para el diseño de formulaciones de fármacos portadores basados en biopolímeros se encuentra la aplicación de reactivos orgánicos peligrosos -disolventes volátiles e inflamables, como el tetrahidrofurano, la acetona, el metanol e incluso el DMSO en altas concentraciones- lo que limita su aplicabilidad en biomedicina, industria farmacéutica y tecnología alimentaria debido a la manifestación de posibles efectos tóxicos20. 21,22,23,24. Otro punto crucial es la participación de reacciones químicas complicadas (por ejemplo, esterificación, polimerización) o aparatos costosos durante el procedimiento de síntesis. Ambas técnicas presentadas en el presente manuscrito superan estas últimas limitaciones por la implicación de disolventes alternativos (agua) y compuestos no tóxicos como tensioactivos (Tween 80) y agentes reticulantes (etanol, ácido cítrico), clasificándolos como métodos de síntesis "verdes". Además, las metodologías ofrecen una solución que satisface la necesidad crítica y el impulso para el desarrollo de procedimientos económicos, ecológicos y sostenibles para el diseño de partículas de lignina, que sirvan como plantillas portadoras biodegradables, bioactivas y biocompatibles de sustancias fisiológicamente activas25.
Para obtener partículas de lignina con el tamaño deseado, se eligieron dos condiciones de producción: una con alta concentración de lignina (50 g/L) y ácido nítrico como agente antisolvente y otra con menor concentración de lignina (5 g/L), etanol como antisolvente y ácido cítrico desempeñando un doble papel de antisolvente y agente de reticulación simultáneamente, ya que estas fueron las dos variables que influyeron en el tamaño de las partículas de lignina. El caudal durante ambos procedimientos se mantuvo bajo para proporcionar partículas más pequeñas y evitar su agregación. Hay algunos puntos críticos que deben tenerse en cuenta con respecto a la elección de los ácidos inorgánicos y orgánicos para los protocolos de síntesis.
Se eligió el ácido nítrico porque es un ácido inorgánico fuerte, que ofrece un alto grado de precipitación de lignina alcalina, y controlando la tasa de su adición se pueden obtener partículas dentro del rango de tamaño deseado. Además, se espera que la adición deHNO3 pueda proporcionar una modificación de las partículas heteropoliméricas debido a probables cambios químicos de la estructura de la lignina asociados con: procesos de reacciones de nitración-sustitución de átomos-H en los anillos de benceno con grupos -NO2 ; esterificación de grupos -OH alifáticos y formación de grupos funcionales éster; y/o oxidación de los grupos fenólicos -OH y -OCH3 , lo que da lugar a la formación de estructuras de quinona. En cuanto al papel del precipitante y la concentración de lignina en el tamaño de las partículas sintetizadas, por un lado, la mayor concentración inicial de lignina combinada con la adición del ácido nítrico fuerte (pKa = -1,4) y la limitada solubilidad del heteropolímero alcalino en el ácido inorgánico condujeron a la producción de partículas dentro del rango micrométrico. Por otro lado, la adición de etanol a la solución acuosa de lignina alcalina con la concentración más baja provoca la formación de una suspensión fina debido a la solubilidad parcial de la lignina alcalina en el alcohol. Además, la adición posterior de ácido cítrico condujo a la producción de partículas dentro del rango nanométrico porque el ácido orgánico es más débil (pKa1 = 3,13) que el ácido nítrico, por lo que ofrece una menor precipitación.
Algunas propiedades básicas de los productos farmacéuticos de tamaño nanométrico son la circulación del fármaco, la liberación del fármaco a partir de formas farmacéuticas en sitios específicos y la absorción a través de membranas biológicas. Estas propiedades están considerablemente influenciadas por algunas características físicas y químicas de los portadores de nanopartículas y por las moléculas de fármaco encapsuladas.
Las características fisicoquímicas de los portadores de biopolímeros: concentración de grupos ácidos y básicos tensioactivos, punto de carga cero (pHPZC), tamaño, distribución del tamaño de partícula, así como las características espectrales de las partículas antes y después de la incorporación de la sustancia bioactiva, son parámetros esenciales que deben tenerse en cuenta a la hora de evaluar los grupos funcionales, la reactividad, estabilidad y homogeneidad de las partículas10.
El tamaño de partícula, la distribución del tamaño de partícula, la carga y la morfología se encuentran entre los principales factores que influyen en estas evaluaciones. El tamaño de partícula influye en su estabilidad, reactividad y comportamiento de liberación del fármaco26. Las partículas más pequeñas ofrecen un área de transferencia de masa más grande, lo que conduce a una mayor tasa de liberación de fármacos. Por el contrario, la menor superficie de transferencia de masa de las partículas más grandes da como resultado una menor tasa de difusión del fármaco dentro de estas partículas.
La aplicación de los métodos de valoración como técnicas básicas para la determinación de sitios ácidos y básicos y grupos funcionales presentes en superficies sólidas está en constante expansión. Las principales ventajas de la valoración potenciométrica incluyen el ahorro de tiempo y mano de obra, la alta precisión y la eliminación de estándares de referencia y aparatos costosos. El método se aplicó en el presente estudio, ya que permite la caracterización de partículas de biopolímeros mediante la determinación cualitativa y semicuantitativa de la naturaleza y el número de sitios activos presentes en la superficie de los portadores de biopolímeros cargados y descargados27.
La carga superficial de los micro y nano portadores biológicos y médicos desempeña un papel importante en la absorción celular28. El pHPZC corresponde a una densidad de carga superficial cero, es decir, a cantidades equivalentes de cargas negativas y positivas desarrolladas por equilibrios de protones. La determinación de estos valores proporciona información sobre la especificidad de la adsorción29. Sin embargo, dado que el parámetro punto isoeléctrico representa solo las cargas superficiales externas de las partículas en suspensión, mientras que el punto de carga cero varía en respuesta a la carga superficial neta total (externa e interna) de las partículas, se aplicó por primera vez en el presente estudio el protocolo de pHpzc como un método simple y efectivo para la caracterización de biopolímeros portadores de fármacos. De acuerdo con el concepto de pHpzc, a un pH superior al pHpzc, la superficie de las partículas de biopolímero está predominantemente cargada negativamente, mientras que se observa una carga positiva neta cuando el pH de la suspensión está por debajo del pHpzc. A partir de los datos experimentales presentados en la Tabla 1, se pudo concluir que las partículas de lignina micro y submicrónicas, descargadas y cargadas con flavonoides están cargadas negativamente debido a que su pH >pH pzc.
La eficiencia de la carga de flavonoides está influenciada por la eficiencia de encapsulación y la capacidad de carga del fármaco. La eficiencia de encapsulación (E, %) se define como la relación entre la cantidad de fármaco incorporada en las partículas y la cantidad total en la formulación. La eficiencia de la encapsulación está influenciada por las características del fármaco, el solvente y el portador30.
Sin embargo, la administración eficiente de una sustancia fisiológicamente activa depende de la forma y el grado en que sus moléculas se liberan de la matriz portadora. Por lo tanto, es muy importante considerar el mecanismo de liberación del fármaco y la tasa de liberación 31,32,33. Al dilucidar el mecanismo de liberación in vitro de bioflavonoides a partir de sus micro-/nano-portadores biopoliméricos, se puede simular y predecir el comportamiento del flavonoide y el portador en un medio fisiológico real y optimizar el diseño de formulaciones farmacéuticas con biodisponibilidad mejorada. Los resultados experimentales in vitro obtenidos en este estudio son útiles para la práctica clínica, ya que demuestran que, debido al menor grado de liberación de morina/quercetina de las partículas submicrónicas y micromicrónicas de lignina en el entorno gástrico, las innovadoras partículas de biopolímero son adecuadas para la administración oral debido al menor riesgo de irritación gástrica en comparación con la administración oral directa de las sustancias bioactivas. Las innovadoras micropartículas de biopolímero son adecuadas para la administración oral debido al menor riesgo de irritación gástrica en comparación con la administración oral directa de las sustancias bioactivas. Además, las partículas submicrónicas, debido a su pequeño tamaño y a su importante potencial de liberación, podrían aplicarse como formulaciones inyectables. Además, los nuevos portadores micro y submicrónicos de lignina ofrecen una oportunidad para superar las limitaciones reportadas por otros científicos relacionadas con las dificultades asociadas con la administración oral de altas dosis de ciertos bioflavonoides, resultantes de su tendencia a formar soluciones saturadas en el tracto intestinal, lo que a su vez dificulta el proceso de disolución y su resorción eficiente.
La facilidad de síntesis, la biocompatibilidad de las partículas resultantes, así como la posibilidad de personalización del protocolo actual, representan las principales ventajas de la metodología presentada. El tamaño de las partículas es óptimo para sus aplicaciones previstas, ya que ofrece suficiente superficie disponible para los accesorios de productos terapéuticos y las fracciones dirigidas, lo que a su vez no requiere que se administren más partículas para cumplir con los requisitos de dosis objetivo. El uso de la lignina como matriz heteropolimérica básica para la síntesis de partículas innovadoras permite una mayor biocompatibilidad y ofrece varios grupos funcionales activos que presentan oportunidades para la personalización de las partículas para diversas aplicaciones.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este estudio contó con el apoyo del Fondo Científico Búlgaro en virtud del contrato n.º KΠ-06 H59/3 y del proyecto científico n.º 07/2023 FVM, Universidad de Trakia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
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