Summary
Vi beskriver nye, enkle metoder for syntese og karakterisering av biokompatible lignin mikro- og submikronpartikler. Disse formuleringene gir en lettvint tilnærming for utnyttelse av heteropolymeren, samt et alternativ for rasjonell utforming av multifunksjonelle bærermatriser med potensiell anvendelighet i biomedisin, farmasøytisk teknologi og næringsmiddelindustrien.
Abstract
Anvendeligheten av biopolymer mikro-/nanoteknologi i human, veterinærmedisin, farmasøytisk og matteknologi vokser raskt på grunn av det store potensialet for biopolymerbaserte partikler som effektive bæresystemer. Bruken av lignin som en basisk heteropolymerbiomatrise for utforming av innovative mikro-/submikronformuleringer gjør det mulig å oppnå økt biokompatibilitet og tilbyr ulike aktive funksjonelle grupper som gir muligheter for tilpasning av de fysisk-kjemiske egenskapene og bioaktivitetene til formuleringene for ulike anvendelser. Målet med denne studien var å utvikle en enkel og miljøvennlig metodikk for syntese av ligninpartikler med mikro- og submikronstørrelse; å evaluere deres fysisk-kjemiske, spektrale og strukturelle egenskaper; og å undersøke deres evne til innkapsling av biologisk aktive molekyler og potensial for in vitro frigjøring av bioflavonoider i simulerte gastrointestinale medier. De presenterte metodene bruker billige og grønne løsningsmidler; enkle, enkle, raske og følsomme prosesser som krever lite utstyr, giftfrie stoffer og enkle metoder for karakterisering av dem, bestemmelse av innkapslingskapasitet mot de dårlig vannløselige bioaktive forbindelsene morin og quercetin, og in vitro-frigjøringspotensialet til ligninmatrisene.
Introduction
I dag har tilbøyelighet til biopolymerer som cellulose, kitosan, kollagen, dextran, gelatin og lignin som forløpere for utforming av mikro- / submikronbærere med tilpassbar størrelse, fysisk-kjemiske egenskaper og biofunksjonaliteter økt i biomedisinsk, farmasøytisk og næringsmiddelteknologisk industri på grunn av deres anvendelighet innen vevsteknikk, 3D-bioprinting, in vitro sykdomsmodelleringsplattformer, emballasjeindustri, emulsjonsforberedelse og næringsmiddellevering blant annet 1,2,3.
Nye studier fremhever aspektene ved ligninbaserte hydrogeler samt mikro- og nanoformuleringer4 som fordelaktige kjøretøy som brukes til matemballasje5, energilagring6, kosmetikk7, termiske / lysstabilisatorer, forsterkede materialer og stoffbærermatriser8 for levering av hydrofobe molekyler, forbedring av UV-barrierer9, som forsterkende midler i nanokompositter, og som et alternativ til uorganiske nanopartikler på grunn av noen nylige sikkerhetsproblemer 10,11,12. Årsaken bak denne tendensen er biokompatibilitet, biologisk nedbrytbarhet og ikke-toksisitet av den naturlige heterobiopolymeren, samt dens påviste bioaktiviteter av lignin-antioksidantpotensial og radikal rensing, anti-proliferativ, og antimikrobiell aktivitet 13,14,15,16,17.
Vitenskapelig litteratur rapporterer ulike metoder for syntese (selvmontering, anti-løsningsmiddelutfelling, syreutfelling og løsningsmiddelskifting)18 og karakterisering av ligninbaserte mikro-/nanoskalerte formuleringer, inkludert anvendelse av dyre eller skadelige løsningsmidler som tetrahydrofuran (THF), dimetylsulfoksid (DMSO), N,N-dimetylformamid (DMF) og aceton, og kompliserte, indirekte og kjedelige prosesser som bruker mye utstyr og giftigestoffer12,19,20.
For å overvinne de sistnevnte ulempene, presenterer følgende protokoller nye metoder for syntese av ligninbaserte mikro-/submikronpartikler ved bruk av billige og grønne løsningsmidler; enkle, enkle, raske og følsomme prosesser som krever lite utstyr, giftfrie stoffer og enkle metoder for karakterisering og bestemmelse av innkapslingskapasitet mot dårlig vannløselige bioaktive forbindelser og in vitro-frigjøringspotensialet til ligninmatrisene. De presenterte laboratorieskala produksjonsmetodene er fordelaktige for fremstilling av funksjonelle ligninbærere med justerbare størrelser, høy innkapslingskapasitet og bærekraftig in vitro-frigjøringsadferd ved hjelp av enkle karakteriseringsprosedyrer og miljøvennlige kjemikalier som kan finne anvendelse på ulike områder av biomedisinsk vitenskap og matteknologi. To flavonoider ble påført som målmolekyler innkapslet i ligninpartiklene: morin i mikropartiklene og quercetin i submikronpartiklene. Forskjellen i strukturene til begge flavonoider er bare posisjonen til den andre -OH-gruppen i den B-aromatiske ringen: -OH-gruppen er på 2'-posisjonen i morin og på 3'-posisjonen i quercetin, og dermed er begge organiske forbindelser posisjonelle isomerer. Sistnevnte faktum forutsetter lignende oppførsel av begge bioaktive naturlige forbindelser i prosessene for innkapsling og / eller frigjøring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese av ligninmikropartikler
- Tilbered en 50 mg / ml alkali lignin vandig oppløsning ved å oppløse 2,5 g alkalilignin i 50 ml ultrarent vann på en magnetomrører.
- Klargjør 1 % Tween 80-oppløsning ved å løse opp 1 ml Tween 80 i 100 ml ultrarent vann.
- Tilbered en 2 M oppløsning av HNO3 ved å fortynne 6,65 ml 67 % HNO3 (tetthet = 1,413 g/ml) med ultrarent vann til et endelig volum på 50 ml.
- Tilsett langsomt 15 ml av 1 % Tween 80 oppløsning til 50 ml av 50 mg/ml alkaliligninoppløsningen.
- Agiter blandingen på en magnetisk omrører ved 500 o / min i 10 minutter slik at overflateaktivt middel blir godt spredt.
- Tilsett 20 ml 2 M HNO3 dråpevis med en sprøyte med en strømningshastighet på ca. 150 μL/s til blandingen.
- Fortsett å røre blandingen i 30 minutter når den mørkebrune løsningen omdannes til en lysebrun suspensjon av mikropartikler.
- Overfør suspensjonen til 1,5-2 ml reagensrør og sentrifuge i 30 minutter ved 15 000 × g i en ultrasentrifuge ved 10 °C.
- Samle supernatanten for videre analyser og skyll mikropartiklene med ultrarent vann.
- Gjenta prosedyrene for skylling/ultrasentrifugering 3x.
- Dypp beholderen med mikropartiklene i et isbad før ultralydhomogeniseringen.
- Homogeniser mikropartiklene i 4 minutter med en intensitet på 93% på en ultralydhomogenisator.
- Lyofiliser mikropartiklene ved en temperatur på -64 °C i en frysetørker og oppbevar dem i en eksicator for videre bruk.
2. Syntese av lignin submikron partikler
- Tilbered en 5 mg/ml alkalilignin vandig oppløsning ved å oppløse 125 mg alkalilignin i 25 ml ultrarent vann på en magnetomrører.
- Tilsett sakte 1 ml 96% EtOH til alkaliligninoppløsningen.
- Agiter blandingen på en magnetisk omrører ved 500 o / min i 3 minutter.
- Forbered 50 ml av en 1% løsning av sitronsyre ved å oppløse 0,5 g sitronsyre i ultrarent vann til et endelig volum på 50 ml.
- Tilsett 7 ml 1 % sitronsyre dråpevis med en sprøyte med en strømningshastighet på ca. 4 ml/min til blandingen.
- Fortsett å røre blandingen i 10 minutter når den brune klare løsningen vil forvandle seg til en overskyet lysebrun suspensjon av submikronpartikler.
- Overfør suspensjonen til reagensrør og sentrifuge i 30 minutter ved 15 000 × g i en ultrasentrifuge ved 10 °C.
- Samle supernatanten for videre analyser og skyll mikropartiklene med ultrarent vann.
- Gjenta prosedyrene for skylling/ultrasentrifugering 3x.
- Dypp beholderen med mikropartiklene i et isbad før ultralydhomogeniseringen.
- Homogeniser mikropartiklene ultralyd i to sykluser på 4 minutter hver med en intensitet på 96% i en ultralydshomogenisator.
- Avkjøl beholderne i 1 min etter den første syklusen.
- Lyofiliser mikropartiklene ved en temperatur på -64 °C i en frysetørker og oppbevar dem i en eksicator for videre bruk.
3. Syntese av naturlige flavonoid-innkapslede lignin mikro-/submikronpartikler
- Gjenta trinn 1.1-1.5 for mikropartiklene.
- Vei 0,08 g morin, oppløs det i 1 ml EtOH, og tilsett denne etanoliske oppløsningen til blandingen.
- Agiter blandingen på en magnetisk omrører ved 500 o / min i 20 minutter.
- Tilsett 20 ml 2 N HNO3 dråpevis med en sprøyte med en strømningshastighet på ca. 150 μL/s til blandingen.
- Fortsett å røre blandingen i 60 minutter.
- Gjenta trinn 1.8-1.13.
- Gjenta trinn 2.1 for submikronpartiklene.
- Vekt 0,04 g quercetin, oppløs den i 1 ml EtOH og tilsett denne etanoliske løsningen til alkaliligninoppløsningen.
- Agiter blandingen på en magnetisk omrører ved 500 o / min i 10 minutter.
- Gjenta trinn 2.4–2.13.
4. Bestemmelse av innkapslingseffektiviteten til lignin mikro-/sumikropartikler
- Beregn innholdet av det tilsatte bioaktive stoffet under prosedyren for syntese av begge typer flavonoidinnkapslede ligninpartikler.
- Bestem spektrofotometrisk absorpsjonen av flavonoid i supernatanten oppnådd i trinn 1,9 og 2,8 etter fortynning med 96 % EtOH.
- Beregn konsentrasjonen av ikke-innkapslet morin / quercetin ved hjelp av kalibreringskurvene til flavonoider.
- Beregn innkapslingseffektiviteten (EE, %) av ligninmikropartiklene mot de naturlige flavonoidene ved hjelp av ligning (1):
(1)
Hvor wo er den totale mengden av det bioaktive stoffet tilsatt (mg) og wf er mengden av det frie ikke-innkapslede flavonoidet (mg). - Beregn stoffets lastekapasitet (DLC, %) - en viktig parameter som representerer mengden medikament i partiklene per vektenhet av bæresystemet - ved å bruke eq. (2):
(2)
Hvor wp er den totale mengden (utbyttet) av lignin mikro-/submikronpartikler oppnådd etter lyofilisering (mg).
(1)
(2)5. Karakterisering av lignin mikro- og submikronpartikler
- Bestemmelse av partikkelantall, størrelse og størrelsesfordeling
- Vurdere partikkelstørrelsen og partikkelstørrelsesfordelingen av prøvene ved hjelp av en automatisk celleteller med mulighet for dråpetelling. Tilsett med en mikropipette 1 μL av lignin/flavonoid mikro-/submikronpartiklene suspensjon i ultrarent vann i brønnen på tellesklien som kreves for operasjonen.
- Vent til antall partikler i 1 ml av suspensjonen, samt antall og fordeling etter størrelse skal vises i displayet til den automatiske celletelleren.
MERK: Apparatet tillater lagring av dataene på en USB-blits. Den automatiske cellen telleren spesiell programvare tillater videre behandling av de lagrede digitale og fotofiler.
- Bestemmelse av innholdet i overflate sure/basiske grupper av ligninpartikler ved potensiometrisk titrering
- Vekt 0,04 g ulede/flavonoidinnkapslede ligninpartikler.
- Overfør dem til en Erlenmeyer-kolbe, tilsett 10 ml 0,1 M HCl, og legg kolben på en magnetomrører ved 250 o / min.
- Fyll en 50 ml burette med en 0,1 M standard løsning av NaOH for titrant.
- Mål den opprinnelige pH-verdien til oppløsningen i Erlenmeyer-kolben med en pH-måler på benken før titreringen startes.
- Start titreringen og mål pH i den analyserte oppløsningen etter hver 0,5 ml tilsatte del av titranten.
- Lagre eksperimentelle data i en tabell som inneholder volumet av titranten som er påført og den tilsvarende verdien av pH.
- Stopp titreringen når en omtrent konstant verdi av pH nås ved å øke volumet av titrantoppløsningen.
- Plotte de eksperimentelle dataene i form av null-, første- og andrederiverte differensialtitreringskurver.
- Bestem ekvivalente punkter og tilsvarende ekvivalente volumer av titrantene som brukes.
- Beregne innholdet av de sure A, aog Abbasiske gruppene på overflaten av ubelastede og flavonoidbelastede ligninpartikler ved hjelp av ligninger (3) og (4):
, mgeq/g (3)
mgeq/g (4)
Hvor Veqi er det ekvivalente volumet (ml); NT normaliteten til titranten (mgeqv/ml); VT volumet av titranten som brukes til bestemmelsesprosedyren (ml); m vekten av den analyserte prøven (g).
- Bestemmelse av pH-punktet for nullladning (pHPZC) av ligninbaserte partikler ved den faste addisjonsmetoden.
- Tilbered 60 ml 0,1 M vandig oppløsning av NaCl.
- Tilsett 9 ml av 0,1 M NaCl-løsningen i hver av fem stoppede koniske kolber og juster pH til pHi = 2, 4, 7, 10 og 12 (hvor i = 1-5 angir antallet av den tilsvarende løsningen), henholdsvis ved tilsetning av enten 0,1 M HCl eller 0,1 M NaOH. Juster det totale volumet av løsningen i hver kolbe til 10 ml nøyaktig ved å tilsette NaCl-oppløsning med samme styrke.
- Tilsett 40 mg tørre ligninpartikler (losset, flavonoidbelastet mikro-/submikron) til hver kolbe og dekk kolbene sikkert.
- Fest kolbene oppreist på en orbital shaker og hold dem ristende i 24 timer.
- Tillat likevekt i 30 minutter og mål deretter den endelige pH (pHf) til supernatantene i hver kolbe.
- Plott pHf-verdier mot de tilsvarende innledende pH-verdiene (pHi).
- Punktet med nullladning (pHPZC) er definert som pH-verdien der kurven ΔpH versus pHi skjærer den rette linjen med koordinater (pHi; pHi).
- Bestemmelse av totalt fenolinnhold (TPC) av ligninpartikler
MERK: Det totale fenolinnholdet (TPC) av mikro-/submikron ligninpartiklene bestemmes ved hjelp av en modifisert Folin-Ciocalteu kolorimetrisk metode.- Bland 200 mikrol vandig suspensjon av partikler med en konsentrasjon på 500 μg/ml med 600 mikroliter ultrarent vann og 200 mikrol Folin-Ciocalteu-reagens (1:1, v/v).
- Etter 5 minutter, tilsett 1,0 ml 8% Na2CO3 og 1,0 ml Milli-Q vann til blandingen og inkuber den i mørket ved 40 ° C i 30 minutter i et vannbad med intermitterende omrøring.
- Sentrifuger suspensjonen ved 5 300 × g i 2 minutter.
- Forbered et emne som ikke inneholder partikler.
- Overfør 3,5 ml av supernatanten i en 10 mm kvartskuvette og mål absorbansen på et UV/Vis-spektrofotometer i det synlige området ved 760 nm mot emnet.
- Forbered en kalibreringskurve for standard gallinsyre ved å følge trinn 5.3.1-5.3.5; bare i stedet for 200 μL av ligninpartikkelsuspensjonen, bruk den etanoliske løsningen av gallinsyre med innledende konsentrasjoner på 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 og 200 μg / ml.
- Uttrykke eksperimentelle data for mikropartiklene som mg gallinsyreekvivalenter i milligram per gram tørrprøve (mg GAE / g).
- Beregn TPC ved hjelp av ligning (5):
mg GAE/g (5)
Hvor CGA er konsentrasjonen av prøven ekvivalent med konsentrasjonen av standard gallinsyre oppnådd fra kalibreringsplottet av syren (μg GA/ml); Cs er konsentrasjonen av prøven, som er lik den tørre prøvemassen dividert med volumet av løsningsmidlet (μg / ml).
, mgeq/g (3)
mgeq/g (4)
mg GAE/g (5)6. Bestemmelse av in vitro frigjøringskapasitet for ligninpartikler
- Klargjør 250 ml simulert enzymfritt magemedium ved å justere pH i standard PBS-oppløsning med 0,1 M HCl til pH = 1,2.
- Klargjør 250 ml av hver av de to simulerte tarmvæskeoppløsningene ved å justere pH i standard PBS-oppløsning med 0,1 M NaOH/0,1 M HCl til pH = henholdsvis 6,8 og 7,4.
- Tilsett 25 mg flavonoid-innkapslede mikro-/submikronpartikler til 50 ml av det simulerte enzymfrie magemediet i en glassbatchreaktor forsynt med en mekanisk omrører og plasser den i et termisk vannbad ved en konstant temperatur på T = 37 ± 0,2 oC.
- Dypp omrøreren til en dybde på 2/3 av væskevolumet for å sikre full blanding av de faste og flytende fasene og sikre maksimal masseoverføring uten stillestående soner.
- Ta ut 1 ml prøve fra reaktoren hvert 10. minutt opptil 90 . minutt og pipetter umiddelbart 1 ml fersk simulert væskeoppløsning inn i reaktoren for å forhindre endring av totalvolumet og for å sikre synkeforhold.
- Gjenta samme prosedyre inkludert trinn 6,3-6,6 med begge simulerte tarmvæskeoppløsninger med pH = henholdsvis 6,8 og 7,4 i 200 minutter.
- Utfør analoge eksperimenter med ubelastede ligninpartikler i de tre simulerte mediene og bruk prøvene som emner for nullstilling av spektrofotometeret.
- Bestem absorpsjonen av prøvene spektrofotometrisk etter filtrering av prøvene og fortynning av dem med 96% EtOH mot de tomme prøvene fra trinn 6.7 og beregne den tilsvarende flavonoidkonsentrasjonen ved å bruke de tilsvarende kalibreringskurvene for morin oppnådd ved pH = henholdsvis 1,2, 6,8 og 7,4.
- Beregn kumulativ frigjøring (CR) av bioflavonoider ved hjelp av ligning (6) i μg / ml og kumulativ frigjøringsprosent (CRP) ved ligning (7):
(6)
Hvor Ci og Ci + 1 er konsentrasjonene av morin / quercetin i ith og (i + 1) th prøver (μg / ml); Vs prøvevolumet tatt fra batchreaktoren (ml); V det totale volumet av det simulerte mediet (ml).
(7)
HvorCmax er den maksimale konsentrasjonen av den biologisk aktive forbindelsen i bæreren (μg/ml).
(6)
(7)7. Statistiske analyser
- Uttrykke eksperimentelle data som midler ± standardavvik (SD) av tre uavhengige målinger.
- Bestem den statistiske signifikansen av de eksperimentelle resultatene ved å utføre ANOVA-testen som post hoc-test. Vurder en verdi på p < 0,05 statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En anti-løsningsmiddel utfellingsteknikk ble utført for å produsere alkali lignin mikro-/submikronpartikler. En vandig oppløsning av fortynnet uorganisk syre-salpetersyre / organisk syre-sitronsyre ble dispergert i en alkalilignin vandig løsning, beriket med et miljøvennlig overflateaktivt middel / etanol, noe som resulterte i gradvis utfelling av biopolymeroppløsningen, og etter sonikering ble det endelig produsert en suspensjon av kompakte mikro- / submikronpartikler (figur 1).
Figur 1: Homogenisering av ligninpartikler. (A) Ultralyd homogenisering av de syntetiserte lignin submikron partikler; (B) Homogeniserte morinbelastede og lossede ligninmikropartikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Størrelsen, antallet og størrelsesfordelingen av de ulastede og morininnkapslede ligninmikrobærerne ble bestemt (figur 2). De eksperimentelle dataene viste høyere konsentrasjon, 1 × 107 partikler / ml (2,037 partikler / μL) og høyere gjennomsnittlig størrelse, 6,1 μm, av de bioflavonoidbelastede mikrobærerne (figur 2B) enn de ubelastede med en konsentrasjon på 7,4 × 106 partikler / ml (1,474 partikler / μL) og gjennomsnittlig størrelse på 5,7 μm (figur 2A). Den prosentvise størrelsesfordelingen for begge typer partikler innenfor størrelsesområdet 3-6 μm var 75,2 % for de lossede og 69,3 % for de morininnkapslede mikrobærerne og henholdsvis 20,2 % og 25,2 % innenfor området 7-10 μm. Mengden, konsentrasjonen og strømningshastigheten til antisolmidlet, salpetersyre, er avgjørende for størrelsen på partiklene. Den høyere konsentrasjonen og større mengden av syren fører til større partikler, mens den høyere strømningshastigheten provoserer aggregering av suspensjonen.
Figur 2: Partikkelstørrelsesfordeling. (A) Faktisk størrelsesfordeling avubelastede ligninmikropartikler i 1 μL suspensjonsprogramvare for partikkeltelleren; (B) faktisk størrelsesfordeling av morininnkapslede alkaliligninmikropartikler i 1 μL suspensjonsprogramvare i partikkeltelleren. (C) Partikkelteller mikroskopisk bilde av fordelingen av de ulastede ligninmikropartiklene; (D) partikkelteller mikroskopisk bilde av fordelingen av de morininnkapslede alkaliligninmikropartiklene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 presenterer UV/Vis-absorpsjonsspektrene til etanolmorinløsninger, vandige alkaliligninløsninger og blandingene som inneholder morin og lignin med forskjellige initiale konsentrasjoner. Det er åpenbart at absorpsjonstoppene av rent lignin og bioflavonoid ikke sammenfaller, og heteropolymeren utøver ingen forstyrrende innflytelse under den anvendte spektrofotometriske metoden for bestemmelse av morinkonsentrasjon i væskefasen etter innkapsling av flavonoid i polymermikrobærerne og under in vitro-frigjøringsforsøkene . Maksimal absorpsjon av morin i tokomponentblandingen skiftet til en høyere bølgelengde, fra λmax = 359 nm til λmax = 395 nm, som et resultat av økt pH i mediet på grunn av tilstedeværelsen av alkalilignin. Sistnevnte avvik fra absorpsjonsmaksimumet i det synlige området provoserte nødvendigheten av utforming av kalibreringskurver for morin ved forskjellige pH-verdier av mediet (figur 4A). De tre standardkurvene karakterisert ved svært sterke lineære korrelasjoner ble påvist av de høye verdiene av regresjonskoeffisientene (R2 > 0,99) innenfor morinkonsentrasjonsområdet Co = 2,5-100 μg / ml. Tilsvarende viste de tre standardkurvene for quercetin i de tre simulerte fysiologiske rommene, presentert i figur 4B, høy linearitet innenfor samme konsentrasjonsområde.
Figur 3: Sammenligning av UV/Vis-spektra av etanoliske løsninger av morin, vandige alkaliligninløsninger og blandinger som inneholder morin og lignin med ulike initiale konsentrasjoner. Spektrene av rent lignin og morin faller ikke sammen, og heteropolymeren utøver ingen forstyrrende innflytelse. Tilsetningen av lignin til morin fører til forskyvning av maksimal absorpsjon av morin til en høyere bølgelengde, fra λmax = 359 nm til λmax = 395 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kalibreringskurver for etanoliske flavonoidløsninger. (A) Morin og (B) quercetin innenfor konsentrasjonsområdet Co = 2,5-100 μg/ml ved pH = 1,2 (i blått) (tilsvarende simulert magevæske), pH = 6,8 (i rødt) (tilsvarende simulert liten tarmvæske) og pH = 7,4 (i grønt) (tilsvarende simulert tykktarmsvæske). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Den relative konsentrasjonen av sure og basiske aktive steder/funksjonelle grupper på overflaten av de ubelastede og belastede alkaliligninpartiklene ble bestemt ved potensiometrisk titrering. Beregningene var basert på ekvivalente titrantvolumer bestemt av de andre deriverte differensialtitreringskurvene (figur 5). Verdiene av de bestemte pKa, konsentrasjoner av sure (sterke, svake, totale) funksjonelle grupper og pH og pHpzc av mikro- og submikronpartiklene er presentert i tabell 1.
Figur 5: Andre deriverte differensialpotensiometriske titreringskurver for de ubelastede og lastede ligninmikro-/submikronpartiklene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Parameter | lignin mikropartikler | morininnkapslede ligninmikropartikler | lignin submikron partikler | quercetin-innkapslede lignin submikron partikler |
| Veq., ml | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| pKa | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa (sterk), mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa (svak), mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa (totalt), mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH (vandig suspensjon) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| pHpzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
Tabell 1: Verdier av det ekvivalente volumet av titrant (Veq), den negative basen -10 logaritmen til syredissosiasjonskonstanten (pKa), konsentrasjoner av sure (sterke, svake, totale) funksjonelle grupper (Aa, mgeq/g), pH og nullpunkt (pHpzc) av de ubelastede og lastede lignin-mikro- og submikronpartiklene. Mikro- og submikron, lossede og flavonoidbelastede ligninpartikler er negativt ladet fordi deres pH > pHpzc.
Det totale fenolinnholdet (TPC), bestemt ved en modifisert Folin-Ciocalteu kolorimetrisk metode og beregnet som gallinsyreekvivalenter, var 78,2 mg GAE/g av de ulastede ligninpartiklene, mens verdien av TPC av de morininnkapslede mikrobærerne med samme konsentrasjon var 2,3 ganger høyere (183,43 mg GAE/g). Sistnevnte indikerer at heterobiopolymerpartiklene er beriket med ytterligere fenolgrupper på grunn av inkorporering av flavonoidmolekylene. Flavonoidinnkapslingseffektiviteten var: 98,1% for morin og 97,6% for quercetin. Innkapslingskapasiteten var 28,2 % for de morinbelastede mikropartiklene og 39,0 % for de quercetin-innkapslede submikronpartiklene.
Den in vitro kumulative frisettingen av morin og quercetin ble undersøkt i simulerte gastrointestinale enzymfrie medier: mage-, tarm- og tykktarmsvæsker ved pH = henholdsvis 1,2, 6,8 og 7,4 (figur 6). Den høyeste frigjøringseffektiviteten på ca. 24 % ble oppnådd etter 30-40 minutter ved pH = 6,8. Ifølge de eksperimentelle resultatene hersket mengden av det frigjorte flavonoid i det simulerte tynntarmsmediet to ganger dette frigjort i det simulerte kolonmiljøet og tre ganger frigjøringseffektiviteten bestemt i magen. Den høyeste graden av quercetinfrigjøring etablert i SIF ved pH = 7,4 på 70-90th min var 34%, som overgikk den kumulative frigjøringen av flavonoid i SGF (pH = 1,2) og SIF (pH = 6,8) ved 23,5% og 18%, respektfullt.
Figur 6: Komparative analyser av kumulativ in vitro frigjøringseffektivitet av morin og quercetin fra lignin mikro- og submikronpartikler i simulerte fysiologiske medier. Den høyeste graden av morinfrigjøring ble oppnådd i simulert tynntarmsmedium. Den høyeste frigjøringseffekten av quercetin ble registrert i simulert kolonvæske. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blant de viktigste kritiske problemene med moderne syntesemetoder for utforming av legemiddelbærerformuleringer basert på biopolymerer, er anvendelsen av farlige organiske reagenser - flyktige og brannfarlige løsningsmidler, som tetrahydrofuran, aceton, metanol og til og med DMSO i høye konsentrasjoner - som begrenser deres anvendelighet i biomedisin, farmasøytisk industri og matteknologi på grunn av manifestasjonen av mulige toksiske effekter20, 21,22,23,24. Et annet viktig punkt er involvering av kompliserte kjemiske reaksjoner (f.eks. Forestring, polymerisasjon) eller dyrt apparat under synteseprosedyren. Begge teknikkene som presenteres i det nåværende manuskriptet, overvinner de sistnevnte begrensningene ved implikasjonen av alternative løsningsmidler (vann) og ikke-toksiske forbindelser som overflateaktive stoffer (Tween 80) og kryssbindingsmidler (etanol, sitronsyre), og klassifiserer dem som "grønne" syntesemetoder. Videre tilbyr metodene en løsning som tilfredsstiller den kritiske nødvendigheten og trangen til utvikling av billige, miljøvennlige og bærekraftige prosedyrer for utforming av ligninpartikler, som tjener som biologisk nedbrytbare, bioaktive og biokompatible bærermaler av fysiologisk aktive stoffer25.
For å oppnå ligninpartikler med ønsket størrelse ble to produksjonsbetingelser valgt: en med høy ligninkonsentrasjon (50 g/L) og salpetersyre som antiløsningsmiddel og en annen med lavere ligninkonsentrasjon (5 g/L), etanol som antisolvent og sitronsyre som spiller en dobbel rolle som antisolvent og kryssbindingsmiddel samtidig, siden disse var de to variablene som påvirket størrelsen på ligninpartikler. Strømningshastigheten under begge prosedyrene ble holdt lav for å gi mindre partikler og for å forhindre aggregering. Det er noen kritiske punkter som må vurderes angående valget av de uorganiske og organiske syrer for synteseprotokollene.
Salpetersyre ble valgt fordi det er en sterk uorganisk syre, som gir en høy grad av utfelling av alkalilignin, og ved å kontrollere hastigheten av dets tilsetningspartikler innenfor ønsket størrelsesområde kan oppnås. Videre forventes det at tilsetningen av HNO3 kan gi modifikasjon av heteropolymerpartiklene på grunn av sannsynlige kjemiske endringer i ligninstrukturen assosiert med: prosesser av nitrerings-substitusjonsreaksjoner av H-atomer i benzenringene med -NO2-grupper ; forestring av alifatiske -OH-grupper og dannelse av esterfunksjonelle grupper; og/eller oksidasjon av fenoliske -OH- og -OCH3-grupper som resulterer i dannelse av kinonstrukturer. Når det gjelder rollen til bunnfall og ligninkonsentrasjon for størrelsen på de syntetiserte partiklene, førte den høyere innledende ligninkonsentrasjonen kombinert med tilsetningen av den sterke salpetersyren (pKa = -1, 4) og den begrensede oppløseligheten av alkaliheteropolymeren i den uorganiske syren til produksjon av partikler innenfor mikrometerområdet. På den annen side provoserer tilsetningen av etanol til den vandige løsningen av alkalilignin med den lavere konsentrasjonen dannelsen av en fin suspensjon på grunn av den delvise oppløseligheten av alkalilignin i alkoholen. Videre førte den etterfølgende tilsetningen av sitronsyre til produksjon av partikler innenfor nanometerområdet fordi den organiske syren er svakere (pKa1 = 3, 13) enn salpetersyre, og dermed gir lavere nedbørsutvidelse.
Noen grunnleggende egenskaper av nanoserte legemidler er legemiddelsirkulasjon, legemiddelfrigivelse fra doseringsformer på bestemte steder og absorpsjon gjennom biologiske membraner. Disse egenskapene er betydelig påvirket av noen fysiske og kjemiske egenskaper av nanopartikkelbærerne og av de innkapslede legemiddelmolekylene.
De fysisk-kjemiske egenskapene til biopolymerbærere: konsentrasjon av overflateaktive sure og basiske grupper, punkt med nullladning (pHPZC), størrelse, partikkelstørrelsesfordeling, samt partiklenes spektrale egenskaper før og etter inkorporering av det bioaktive stoffet, er essensielle parametere som må tas i betraktning ved evaluering av funksjonelle grupper, reaktivitet, stabilitet og homogenitet av partikler10.
Partikkelstørrelse, partikkelstørrelsesfordeling, ladning og morfologi er blant de viktigste faktorene som påvirker disse evalueringene. Partikkelstørrelse påvirker deres stabilitet, reaktivitet og legemiddelfrigjøringsadferd26. Mindre partikler gir et større masseoverføringsområde, noe som fører til en høyere legemiddelfrigivelseshastighet. I motsetning til dette resulterer det mindre masseoverføringsarealet av større partikler i en lavere spredningshastighet inne i disse partiklene.
Anvendelsen av titrimetrisk metode som grunnleggende teknikker for bestemmelse av sure og basiske steder og funksjonelle grupper som er tilstede på faste overflater, utvides stadig. De viktigste fordelene med potensiometrisk titrering inkluderer tids- og arbeidsbesparende, høy presisjon og eliminering av referansestandarder og dyre apparater. Metoden ble brukt i denne studien, da den tillater karakterisering av biopolymerpartikler ved kvalitativ og semikvantitativ bestemmelse av arten og antall aktive steder som er tilstede på overflaten av lastede og ubelastede biopolymerbærere27.
Overflateladningen til biologiske og medisinske mikro-/nanobærere spiller en viktig rolle i celleopptak28. pHPZC tilsvarer null overflateladningstetthet, det vil si ekvivalente mengder negative og positive ladninger utviklet av protonlikevekter. Bestemmelsen av disse verdiene gir informasjon om spesifisiteten til adsorpsjon29. Imidlertid, da parameterisoelektrisk punkt bare representerer de eksterne overflateladningene av partikler i suspensjon, mens nullladningspunktet varierer som respons på den totale netto overflateladningen (ekstern og intern) av partiklene, blepH-pzc-protokollen anvendt for første gang i denne studien som en enkel og effektiv metode for karakterisering av biopolymermedikamentbærere. I henhold til begrepet pHpzc, ved pH over pHpzc, er overflaten av biopolymerpartiklene overveiende negativt ladet, mens en netto positiv ladning observeres når suspensjonens pH er under pHpzc. Fra eksperimentelle data presentert i tabell 1, kan det konkluderes med at mikro- og submikron, lossede og flavonoidbelastede ligninpartikler er negativt ladet fordi deres pH > pHpzc.
Effektiviteten av flavonoidbelastning påvirkes av innkapslingseffektivitet og stoffbelastningskapasitet. Innkapslingseffektivitet (E, %) er definert som forholdet mellom mengden av legemidlet inkorporert i partiklene og den totale mengden i formuleringen. Innkapslingseffektiviteten påvirkes av stoffets egenskaper, løsningsmidlet og bæreren30.
Effektiv levering av et fysiologisk aktivt stoff avhenger imidlertid av måten og i hvilken grad dets molekyler frigjøres fra bærermatrisen. Det er derfor svært viktig å vurdere frigivelsesmekanismen og frigjøringshastigheten 31,32,33. Ved å belyse in vitro-frigjøringsmekanismen til bioflavonoider fra deres biopolymere mikro-/nanobærere, kan man simulere og forutsi oppførselen til flavonoid og bæreren i et ekte fysiologisk medium og optimalisere utformingen av farmasøytiske formuleringer med forbedret biotilgjengelighet. De eksperimentelle in vitro-resultatene oppnådd i denne studien er nyttige for klinisk praksis, da de viser at på grunn av det lavere omfanget av morin / quercetinfrigjøring fra ligninsubmikron og mikropartikler i magemiljøet, er de innovative biopolymerpartiklene egnet for oral administrering på grunn av lavere risiko for gastrisk irritasjon sammenlignet med direkte oral administrering av de bioaktive stoffene. De innovative biopolymermikropartiklene er egnet for oral administrering på grunn av lavere risiko for gastrisk irritasjon sammenlignet med direkte oral administrering av de bioaktive stoffene. Videre kan submikronpartiklene, på grunn av deres lille størrelse og betydelige frigjøringspotensial, anvendes som injiserbare formuleringer. I tillegg gir de nye ligninmikro- og submikronbærerne en mulighet til å overvinne begrensningene rapportert av andre forskere relatert til vanskeligheter forbundet med oral administrering av høye doser av visse bioflavonoider, som skyldes deres tendens til å danne mettede løsninger i tarmkanalen, noe som igjen hindrer oppløsningsprosessen og deres effektive resorpsjon.
Den enkle syntesen, biokompatibiliteten til de resulterende partiklene, samt muligheten for tilpasning av den nåværende protokollen, representerer de viktigste fordelene ved den presenterte metodikken. Størrelsen på partiklene er optimal for deres tiltenkte applikasjoner, og gir nok overflateareal tilgjengelig for vedlegg av terapeutiske midler og målretting av deler, noe som igjen ikke krever at flere partikler administreres for å oppnå måldoseringskrav. Bruken av lignin som den grunnleggende heteropolymermatrisen for syntese av innovative partikler muliggjør økt biokompatibilitet og tilbyr ulike aktive funksjonelle grupper som gir muligheter for tilpasning av partiklene for ulike applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Bulgarian Scientific Fund under Contract No KΠ-06 H59/3 og av Scientific Project No. 07/2023 FVM, Trakia University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
References
- Yu, X., et al. Lignin nanoparticles with high phenolic content as efficient antioxidant and sun-blocker for food and cosmetics. ACS Sustainable Chem. Eng. 11 (10), 4082-4092 (2023).
- Boarino, A., Klok, H. -A. Opportunities and challenges for lignin valorization in food packaging, antimicrobial, and agricultural applications. Biomacromolecules. 24 (3), 1065-1077 (2023).
- Aadil, K., Barapatre, A., Jha, H. Synthesis and characterization of Acacia lignin-gelatin film for its possible application in food packaging. Bioresour. Bioprocess. 3 (27), 1-11 (2016).
- Sharma, S., et al. Valorization of lignin into nanoparticles and nanogel: characterization and application. Bioresour. Technol. Reports. 18, 101041 (2022).
- Zadeh, E. M., O'Keefe, S. F., Kim, Y. -T.
- Beaucamp, A., et al. Lignin for energy applications - state of the art, life cycle, technoeconomic analysis and future trends (Critical Review). Green Chem. 24, 8193-8226 (2022).
- Antunes, F., et al. From sugarcane to skin: Lignin as a multifunctional ingredient for cosmetic application. Int J Biol Macromol. 234, 123592 (2023).
- Garg, J., et al. Applications of lignin nanoparticles for cancer drug delivery: An update. Materials Letters. 311, 131573 (2022).
- Anushikha, K. K. Lignin as a UV blocking, antioxidant, and antimicrobial agent for food packaging applications. Biomass Conv. Bioref. , 1-14 (2023).
- Freitas, F. M. C., et al. synthesis of lignin nano- and micro-particles: Physicochemical characterization, bioactive properties and cytotoxicity assessment. Int J Biol Macromol. 163, 1798-1809 (2020).
- Rismawati, R., Nurdin, I. A., Pradiptha, M. N., Maulidiyah, A., Mubarakati, N. J. Preparation and characterization of lignin nanoparticles from rice straw after biosynthesis using Lactobacillus bulgaricus. Journal of Physics: Conference Series. 9th International Seminar on New Paradigm and Innovation of Natural Sciences and its Application. 1524, 012070 (2020).
- Worku, L. A., et al. Synthesis of lignin nanoparticles from Oxytenanthera abyssinica by nanoprecipitation method followed by ultrasonication for the nanocomposite application. Journal of King Saud University - Science. 35 (7), 102793 (2023).
- Gala Morena, A., Tzanov, T. z Antibacterial lignin-based nanoparticles and their use in composite materials. Nanoscale Adv. 4, 4447-4469 (2022).
- Ivanova, D., Nikolova, G., Karamalakova, Y., Marutsova, V., Yaneva, Z. Water-soluble alkali lignin as a natural radical scavenger and anticancer alternative. Int J Mol Sci. 24 (16), 12705 (2023).
- Ivanova, D., Toneva, M., Simeonov, E., Antov, G., Yaneva, Z. Newly synthesized lignin microparticles as bioinspired oral drug-delivery vehicles: Flavonoid-carrier potential and in vitro radical-scavenging activity. Pharmaceutics. 15 (4), 1067 (2023).
- Yaneva, Z., et al. Antimicrobial potential of conjugated lignin/morin/chitosan combinations as a function of system complexity. Antibiotics. 11, 650 (2022).
- Handral, H. K., Wyrobnik, T. A., Lam, A. T. -L. Emerging trends in biodegradable microcarriers for therapeutic applications. Polymers. 15 (6), 1487 (2023).
- Figueiredo, P., Lintinen, K., Hirvonen, J. T., Kostiainen, M. A., Santos, H. A. Properties and chemical modifications of lignin: Towards lignin-based nanomaterials for biomedical applications. Prog. Mater. Sci. 93, 233-269 (2018).
- Tang, Q., et al. Lignin-based nanoparticles: a review on their preparations and applications. Polymers. 12 (11), Basel. 2471 (2020).
- Zhao, W., Simmons, B., Singh, S., Ragauskas, A., Cheng, G. From lignin association to nano-/micro-particle preparation: extracting higher value of lignin. Green Chemistry. 18 (21), 5693-5700 (2016).
- Stewart, H., Golding, M., Matia-Merino, L., Archer, R., Davies, C. Manufacture of lignin microparticles by anti-solvent precipitation: Effect of preparation temperature and presence of sodium dodecyl sulfate. Food Res Int. 66, 93-99 (2014).
- Beisl, S., Friedl, A., Miltner, A. Lignin from micro- to nanosize: Applications. Int. J. Mol. Sci. 18, 2367 (2017).
- Mishra, P. K., Ekielski, A. A simple method to synthesize lignin nanoparticles. Colloids Interfaces. 3, 52 (2019).
- Qian, Y., Deng, Y., Qiu, X., Li, H., Yang, D. Formation of uniform colloidal spheres from lignin, a renewable resource recovered from pulping spent liquor. Green Chem. 16, 2156-2163 (2014).
- Tardy, B. L., et al. Lignin nano- and microparticles as template for nanostructured materials: formation of hollow metal-phenolic capsules. Green Chem. 20, 1335-1344 (2018).
- Silva, M., et al. Paraquat-loaded alginate/chitosan nanoparticles: preparation, characterization and soil sorption studies. J Haz Mat. 190 (1-3), 366-374 (2011).
- Georgieva, N., Yaneva, Z. Comparative evaluation of natural and acid-modified layered mineral materials as rimifon-carriers using UV/VIS, FTIR, and equilibrium sorption study. Cogent Chem. 1 (1), 1-16 (2015).
- Zhang, P., Chen, D., Li, L., Sun, K. Charge reversal nano-systems for tumor therapy. J Nanobiotechnol. 20, 31 (2022).
- Yaneva, Z. L., Georgieva, N. V. Removal of diazo dye from the aqueous phase by biosorption onto ball-milled maize cob (BMMC) biomass of Zea mays. Maced. J. Chem. Chem. Eng. 32 (1), 133-149 (2013).
- Zatorska, M., et al. Drug-loading capacity of polylactide-based micro- and nanoparticles - Experimental and molecular modeling study. Int J Pharmaceutics. 591, 120031 (2020).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Chapter 5 - Physicochemical and morphological characterization of pharmaceutical nanocarriers and mathematical modeling of drug encapsulation/release mass transfer processes. Nanoscale Fabrication, Optimization, Scale-Up and Biological Aspects of Pharmaceutical Nanotechnology. Grumezescu, A. M. , William Andrew Publishing. 173-218 (2018).
- Yaneva, Z., Georgieva, N., Staleva, M. Development of d,l-α-tocopherol acetate/zeolite carrier system: equilibrium study. Monatshefte fur Chemie Chemical Monthly. 147 (7), 1167-1175 (2016).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Study on the physical chemistry, equilibrium, and kinetic mechanism of Azure A biosorption by Zea mays biomass. Journal of Dispersion Science and Technology. 35 (2), 193-204 (2014).
