Summary
Descrevemos novas metodologias simples de síntese e caracterização de partículas micro e submicrônicas de lignina biocompatíveis. Essas formulações fornecem uma abordagem fácil para a utilização do heteropolímero, bem como uma alternativa para o projeto racional de matrizes carreadoras multifuncionais com potencial aplicabilidade em biomedicina, tecnologia farmacêutica e indústria alimentícia.
Abstract
A aplicabilidade da micro/nanotecnologia de biopolímeros em medicina humana, veterinária, farmacêutica e alimentícia está crescendo rapidamente devido ao grande potencial das partículas baseadas em biopolímeros como sistemas de transporte eficazes. O uso da lignina como biomatriz heteropolimérica básica para o projeto de formulações micro/submicrométricas inovadoras permite a obtenção de maior biocompatibilidade e oferece vários grupos funcionais ativos apresentando oportunidades para personalização das propriedades físico-químicas e bioatividades das formulações para diversas aplicações. O objetivo do presente estudo foi desenvolver uma metodologia simples e ecologicamente correta para a síntese de partículas de lignina com tamanho micro e submicrométrico; avaliar suas características físico-químicas, espectrais e estruturais; e examinar sua capacidade de encapsulamento de moléculas biologicamente ativas e potencial de liberação in vitro de bioflavonóides em meios gastrointestinais simulados. As metodologias apresentadas aplicam solventes baratos e verdes; processos fáceis, diretos, rápidos e sensíveis que requerem pouco equipamento, substâncias não tóxicas e métodos simples para sua caracterização, a determinação da capacidade de encapsulação dos compostos bioativos pouco solúveis em água morin e quercetina, e o potencial de liberação in vitro das matrizes de lignina.
Introduction
Atualmente, a inclinação para biopolímeros como celulose, quitosana, colágeno, dextrana, gelatina e lignina como precursores para o projeto de transportadores micro/submicrométricos com tamanho, propriedades físico-químicas e biofuncionalidades personalizáveis aumentou nas indústrias biomédica, farmacêutica e de tecnologia de alimentos devido à sua aplicabilidade em engenharia de tecidos, bioimpressão 3D, in vitro plataformas de modelagem de doenças, indústria de embalagens, preparação de emulsões e entrega de nutrientes, entre outros 1,2,3.
Novos estudos destacam os aspectos dos hidrogéis à base de lignina, bem como das micro e nanoformulações4 como veículos vantajosos usados para materiais de embalagem de alimentos5, armazenamento de energia6, cosméticos7, estabilizadores térmicos/leves, materiais reforçados e matrizes transportadoras de medicamentos8 para a entrega de moléculas hidrofóbicas, melhoria das barreiras UV9, como agentes de reforço em nanocompósitos, e como alternativa às nanopartículas inorgânicas devido a alguns problemas de segurança recentes 10,11,12. A razão por trás dessa tendência é a biocompatibilidade, biodegradabilidade e não toxicidade do heterobiopolímero natural, bem como suas bioatividades comprovadas de potencial antioxidante de lignina e atividades antiproliferativas e antimicrobianas 13,14,15,16,17.
A literatura científica relata vários métodos de síntese (automontagem, precipitação anti-solvente, precipitação ácida e deslocamento de solvente)18 e caracterização de formulações à base de lignina em escala micro/nano, incluindo a aplicação de solventes caros ou prejudiciais, como tetrahidrofurano (THF), dimetilsulfóxido (DMSO), N,N-dimetilformamida (DMF) e acetona, e processos complicados, indiretos e tediosos que usam muitos equipamentos e substâncias tóxicas 12,19,20.
Para superar as últimas desvantagens, os seguintes protocolos apresentam novas metodologias para a síntese de partículas micro/submicrônicas à base de lignina usando solventes baratos e verdes; Processos fáceis, diretos, rápidos e sensíveis, exigindo poucos equipamentos, substâncias não tóxicas e métodos simples para sua caracterização e determinação da capacidade de encapsulação de compostos bioativos pouco solúveis em água e potencial de liberação in vitro das matrizes de lignina. Os métodos de produção em escala laboratorial apresentados são vantajosos para a fabricação de carreadores de lignina funcionais com tamanhos ajustáveis, alta capacidade de encapsulação e comportamento de liberação in vitro sustentável, utilizando procedimentos simples de caracterização e produtos químicos ecologicamente corretos que podem encontrar aplicação em várias áreas das ciências biomédicas e tecnologia de alimentos. Dois flavonóides foram aplicados como moléculas-alvo encapsuladas nas partículas de lignina: morina-nas micropartículas e quercetina-nas partículas submicrônicas. A diferença nas estruturas de ambos os flavonóides é apenas a posição do segundo grupo -OH no anel B-aromático: o grupo -OH está na posição 2' na morina e na posição 3' na quercetina, portanto, ambos os compostos orgânicos são isômeros posicionais. Este último fato pressupõe comportamento semelhante de ambos os compostos naturais bioativos nos processos de encapsulamento e/ou liberação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Síntese de micropartículas de lignina
- Preparar uma solução aquosa de lignina alcalina a 50 mg/ml dissolvendo 2,5 g de lignina alcalina em 50 ml de água ultrapura num agitador magnético.
- Prepare a solução de Tween 80 a 1% dissolvendo 1 mL de Tween 80 em 100 mL de água ultrapura.
- Prepare uma solução 2 M de HNO3 diluindo 6,65 mL de 67% de HNO3 (densidade = 1,413 g / mL) com água ultrapura até um volume final de 50 mL.
- Adicione lentamente 15 mL da solução Tween 80 a 1% a 50 mL da solução alcalina de lignina a 50 mg / mL.
- Agitar a mistura num agitador magnético a 500 rpm durante 10 min para que o tensioactivo fique bem disperso.
- Adicione 20 mL de 2 M HNO3 gota a gota com uma seringa a uma taxa de fluxo de aproximadamente 150 μL / s à mistura.
- Continue mexendo a mistura por 30 min quando a solução marrom escura for transformada em uma suspensão marrom clara de micropartículas.
- Transfira a suspensão para tubos de ensaio de 1,5-2 mL e centrifugue por 30 min a 15.000 × g em uma ultracentrífuga a 10 °C.
- Recolha o sobrenadante para análises posteriores e lave as micropartículas com água ultrapura.
- Repita os procedimentos de enxágue/ultracentrifugação 3x.
- Mergulhe o recipiente com as micropartículas em um banho de gelo antes da homogeneização ultrassônica.
- Homogeneizar as micropartículas por 4 min a uma intensidade de 93% em um homogeneizador de ultrassom.
- Liofilize as micropartículas a uma temperatura de -64 °C em um liofilizador e armazene-as em um exicador para uso posterior.
2. Síntese de partículas submicrônicas de lignina
- Preparar uma solução aquosa de lignina alcalina a 5 mg/ml dissolvendo 125 mg de lignina alcalina em 25 ml de água ultrapura num agitador magnético.
- Adicione lentamente 1 mL de EtOH a 96% à solução alcalina de lignina.
- Agite a mistura em um agitador magnético a 500 rpm por 3 min.
- Prepare 50 mL de uma solução de ácido cítrico a 1% dissolvendo 0,5 g de ácido cítrico em água ultrapura até um volume final de 50 mL.
- Adicione 7 mL de ácido cítrico a 1% gota a gota com uma seringa a uma taxa de fluxo de aproximadamente 4 mL / min à mistura.
- Continue mexendo a mistura por 10 minutos quando a solução marrom clara se transformar em uma suspensão marrom clara turva de partículas submicrônicas.
- Transferir a suspensão para tubos de ensaio e centrifugar durante 30 min a 15.000 × g numa ultracentrífuga a 10 °C.
- Recolha o sobrenadante para análises posteriores e lave as micropartículas com água ultrapura.
- Repita os procedimentos de enxágue/ultracentrifugação 3x.
- Mergulhe o recipiente com as micropartículas em um banho de gelo antes da homogeneização ultrassônica.
- Homogeneizar as micropartículas por ultrassom por dois ciclos de 4 min cada a uma intensidade de 96% em um homogeneizador de ultrassom.
- Resfrie os recipientes por 1 min após o primeiro ciclo.
- Liofilize as micropartículas a uma temperatura de -64 °C em um liofilizador e armazene-as em um exicador para uso posterior.
3. Síntese de partículas micro/submicrônicas de lignina encapsuladas em flavonóides naturais
- Repita as etapas 1.1-1.5 para as micropartículas.
- Pesar 0,08 g de morin, dissolver em 1 ml de EtOH e adicionar esta solução etanólica à mistura.
- Agite a mistura em um agitador magnético a 500 rpm por 20 min.
- Adicione 20 mL de 2 N HNO3 gota a gota com uma seringa a uma taxa de fluxo de aproximadamente 150 μL / s à mistura.
- Continue mexendo a mistura por 60 min.
- Repita as etapas 1.8-1.13.
- Repita a etapa 2.1 para as partículas submicrônicas.
- Pesar 0,04 g de quercetina, dissolver em 1 mL de EtOH e adicionar esta solução etanólica à solução aquosa de lignina alcalina.
- Agite a mistura em um agitador magnético a 500 rpm por 10 min.
- Repita as etapas 2.4-2.13.
4. Determinação da eficiência de encapsulação de micro / sumicropartículas de lignina
- Calcular o teor da substância bioactiva adicionada durante o procedimento de síntese de ambos os tipos de partículas de lignina encapsuladas em flavonóides.
- Determinar espectrofotometricamente a absorção do flavonóide no sobrenadante obtido durante as etapas 1.9 e 2.8 após diluição com EtOH a 96%.
- Calcular a concentração da morina/quercetina não aprisionada utilizando as curvas de calibração dos flavonóides.
- Calcular a eficiência de encapsulação (EE, %) das micropartículas de lignina em relação aos flavonóides naturais utilizando a equação (1):
Características (1)
Em que wo é a quantidade total da substância bioativa adicionada (mg) e wf é a quantidade de flavonóide (mg) livre não aprisionado. - Calcule a capacidade de carga de medicamentos (DLC, %) - um parâmetro importante que representa a quantidade de medicamentos nas partículas por unidade de peso do sistema transportador - usando a eq. (2):
(2)
Onde wp é a quantidade total (rendimento) de partículas de lignina micro/submicrônica obtidas após liofilização (mg).
Características (1)
(2)5. Caracterização de partículas micro e submicrônicas de lignina
- Determinação do número de partículas, tamanho e distribuição de tamanho
- Avalie o tamanho das partículas e a distribuição do tamanho das partículas das amostras usando um contador automático de células com a opção de contagem de contas. Adicionar com uma micropipeta 1 μL da suspensão de partículas micro/submicrônicas de lignina/flavonóide em água ultrapura no poço da lâmina de contagem necessária para a operação.
- Aguarde até que o número de partículas em 1 mL da suspensão, bem como seu número e distribuição por tamanho sejam mostrados no display do contador automático de células.
NOTA: O aparelho permite o armazenamento dos dados em um flash USB. O software especial do contador automático de células permite o processamento adicional dos arquivos digitais e fotográficos salvos.
- Determinação do teor de grupos ácidos/básicos de superfície de partículas de lignina por titulação potenciométrica
- Peso 0,04 g de partículas de lignina não carregadas/encapsuladas em flavonóides.
- Transferi-los para um Erlenmeyer, adicionar 10 ml de HCl 0,1 M e colocar o balão num agitador magnético a 250 rpm.
- Encha uma bureta de 50 mL com uma solução-padrão 0,1 M do titulante NaOH.
- Medir o pH inicial da solução no erlenmeyer com um medidor de pH de bancada antes de iniciar a titulação.
- Inicie a titulação e meça o pH da solução analisada após cada porção adicionada de 0,5 mL do titulante.
- Armazene os dados experimentais em uma tabela contendo o volume do titulante aplicado e o valor correspondente de pH.
- Pare a titulação quando um valor aproximadamente constante do pH for atingido aumentando o volume da solução titulante.
- Traçar os dados experimentais sob a forma de curvas de titulação diferenciais zero, primeira e segunda derivadas.
- Determinar os pontos equivalentes e os volumes equivalentes correspondentes dos titulantes utilizados.
- Calcule o conteúdo dos grupos básicos ácidos A, ae Abna superfície de partículas de lignina carregadas e carregadas com flavonóides usando as equações (3) e (4):
, mgeq/g (3)
mgeq/g (4)
Onde Veqi é o volume equivalente (mL); NT a normalidade do titulante (mgeqv/mL); VT o volume do titulante utilizado para o procedimento de determinação (ml); m peso da amostra analisada (g).
- Determinação do ponto de pH de carga zero (pHPZC) de partículas à base de lignina pelo método de adição sólida.
- Prepare 60 mL de solução aquosa 0,1 M de NaCl.
- Adicionar 9 ml da solução de NaCl 0,1 M em cada um dos cinco frascos cónicos tapados e ajustar o pH para pHi = 2, 4, 7, 10 e 12 (em que i = 1-5 indica o número da solução correspondente), respectivamente pela adição de HCl 0,1 M ou NaOH 0,1 M. Ajustar o volume total da solução em cada balão para 10 ml exactamente, adicionando solução de NaCl com a mesma dosagem.
- Adicionar 40 mg de partículas de lignina secas (micro/submicrônicas carregadas de flavonóides sem carga) a cada balão e tampar bem os frascos.
- Fixar os frascos na posição vertical num agitador orbital e mantê-los agitados durante 24 h.
- Deixar o equilíbrio durante 30 minutos e, em seguida, medir o pH final (pHf) dos sobrenadantes em cada balão.
- Representar graficamente os valores de pHf em relação aos valores de pH iniciais correspondentes (pHi).
- O ponto de carga zero (pHPZC) é definido como o valor do pH no qual a curva ΔpH versus pHi cruza a linha reta com coordenadas (pHi; pHi).
- Determinação do teor de fenólicos totais (TPC) de partículas de lignina
NOTA: O conteúdo fenólico total (TPC) das partículas de lignina micro/submicrônica é determinado por meio de um método colorimétrico de Folin-Ciocalteu modificado.- Misturar 200 μL de uma suspensão aquosa de partículas com uma concentração de 500 μg/ml com 600 μL de água ultrapura e 200 μL de reagente Folin-Ciocalteu (1:1, v/v).
- Após 5 min, adicione 1,0 mL de 8% de Na2CO3 e 1,0 mL de água Milli-Q à mistura e incube-a no escuro a 40 °C por 30 min em banho-maria com agitação intermitente.
- Centrifugue a suspensão a 5.300 × g por 2 min.
- Prepare um espaço em branco sem partículas.
- Transferir 3,5 ml do sobrenadante para uma cubeta de quartzo de 10 mm e medir a absorvância num espectrofotómetro UV/Vis na região visível a 760 nm em relação ao branco.
- Preparar uma curva de calibração do ácido gálico padrão seguindo os passos 5.3.1-5.3.5; apenas em vez de 200 μL da suspensão de partículas de lignina, usar a solução etanólica de ácido gálico com concentrações iniciais de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 e 200 μg/mL.
- Expresse os dados experimentais das micropartículas em mg de equivalentes de ácido gálico em miligramas por grama de amostra seca (mg GAE/g).
- Calcular o TPC utilizando a equação (5):
mg GAE/g (5)
Em que CGA é a concentração da amostra equivalente à concentração do ácido gálico padrão obtida a partir do gráfico de calibração do ácido (μg GA/ml); Cs é a concentração da amostra, que é igual à massa da amostra seca dividida pelo volume do solvente (μg/ml).
, mgeq/g (3)
mgeq/g (4)
mg GAE/g (5)6. Determinação da capacidade de libertação in vitro de partículas de lignina
- Prepare 250 mL de meio gástrico livre de enzimas simulado ajustando o pH da solução padrão de PBS com HCl 0,1 M para pH = 1,2.
- Prepare 250 mL de cada uma das duas soluções de fluido intestinal simuladas, ajustando o pH da solução padrão de PBS com 0,1 M NaOH / 0,1 M HCl para pH = 6,8 e 7,4, respectivamente.
- Adicionar 25 mg de partículas micro/submicrônicas encapsuladas em flavonóides a 50 ml do meio gástrico sem enzimas simulado num reator de vidro fornecido com um agitador mecânico e colocá-lo em banho-maria termal a uma temperatura constante de T = 37 ± 0,2 oC.
- Mergulhe o agitador a uma profundidade de 2/3 do volume do líquido para garantir a mistura completa das fases sólida e líquida e garantir a transferência máxima de massa sem zonas estagnadas.
- Retire 1 mL de amostra do reator a cada 10 min até o90º min e pipete imediatamente 1 mL de solução fluida simulada fresca no reator para evitar a alteração do volume total e para garantir as condições de afundamento.
- Repita o mesmo procedimento, incluindo as etapas 6.3-6.6, com ambas as soluções de fluido intestinal simuladas com pH = 6.8 e 7.4, respectivamente, por 200 min.
- Realizar experimentos análogos com partículas de lignina descarregadas nos três meios simulados e usar as amostras como espaços em branco para zerar o espectrofotômetro.
- Determinar espectrofotometricamente a absorção das amostras após filtrá-las e diluí-las com EtOH a 96% em relação às amostras em branco da etapa 6.7 e calcular a concentração de flavonóides correspondente usando as curvas de calibração correspondentes de morin obtidas em pH = 1,2, 6,8 e 7,4, respectivamente.
- Calcular a libertação cumulativa (CR) dos bioflavonóides utilizando a equação (6) em μg/ml e a percentagem de libertação cumulativa (PCR) pela equação (7):
(6)
Em que Ci e Ci+1 são as concentrações de morina/quercetina nasi-ésima e (i+1)ésima amostras (μg/ml); Vs o volume de amostra retirado do reator em batelada (mL); V o volume total do meio simulado (mL).
(7)
Onde Cmax é a concentração máxima do composto biologicamente ativo no transportador (μg/mL).
(6)
(7)7. Análises estatísticas
- Expresse os dados experimentais como médias ± desvios padrão (DP) de três medições independentes.
- Determine a significância estatística dos resultados experimentais realizando o teste ANOVA como teste post hoc. Considere-se um valor de p < 0,05 estatisticamente significativo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uma técnica de precipitação anti-solvente foi executada para produzir partículas alcalinas de lignina micro/submicrônica. Uma solução aquosa de ácido inorgânico diluído-ácido nítrico/ácido orgânico-ácido cítrico foi dispersa em uma solução aquosa de lignina alcalina, enriquecida com um surfactante/etanol ecologicamente correto, o que resultou na precipitação gradual do soluto do biopolímero e, após a sonicação, uma suspensão de partículas compactas de micro/submícron foi finalmente produzida (Figura 1).
Figura 1: Homogeneização das partículas de lignina. (A) Homogeneização ultrassônica das partículas submicrométricas de lignina sintetizadas; (B) Micropartículas de lignina homogeneizadas carregadas e descarregadas de morin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O tamanho, o número e a distribuição de tamanho dos microcarreadores de lignina descarregados e encapsulados em morin foram determinados (Figura 2). Os dados experimentais comprovaram maior concentração, 1 × 107 partículas/mL (2.037 partículas/μL), e maior tamanho médio, 6,1 μm, dos microcarreadores carregados com bioflavonóides (Figura 2B) do que os não carregados com concentração de 7,4 × 106 partículas/mL (1.474 partículas/μL) e tamanho médio de 5,7 μm (Figura 2A). A distribuição percentual de tamanho de ambos os tipos de partículas dentro da faixa de tamanho de 3-6 μm foi de 75,2% para os microtransportadores descarregados e 69,3% para os microtransportadores encapsulados em morin e 20,2% e 25,2%, respectivamente, dentro da faixa de 7-10 μm. A quantidade, concentração e vazão do antissolvente, ácido nítrico, são essenciais para o tamanho das partículas. A maior concentração e maior quantidade do ácido leva a partículas maiores, enquanto a maior vazão provoca agregação da suspensão.
Figura 2: Distribuição do tamanho das partículas. (A) Distribuição do tamanho real das micropartículas de lignina não carregadas em 1 μL de software de suspensão do contador de partículas; (B) distribuição de tamanho real de micropartículas de lignina alcalina encapsuladas em morina em 1 μL de software de suspensão do contador de partículas. (C) Foto microscópica do contador de partículas da distribuição das micropartículas de lignina descarregadas; (D) foto microscópica do contador de partículas da distribuição das micropartículas de lignina alcalina encapsuladas em morina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 3 apresenta os espectros de absorção UV/Vis de soluções de etanol morin, soluções aquosas de lignina alcalina e as misturas contendo morin e lignina com diferentes concentrações iniciais. Obviamente, os picos de absorção da lignina pura e do bioflavonóide não coincidem e o heteropolímero não exerce nenhuma influência disruptiva durante o método espectrofotométrico aplicado para a determinação da concentração de morina na fase líquida após a encapsulação do flavonóide nos microcarreadores poliméricos e durante os experimentos de liberação in vitro . A absorção máxima de morin na mistura de dois componentes mudou para um comprimento de onda mais alto, de λmax = 359 nm para λmax = 395 nm, como resultado do aumento do pH do meio devido à presença de lignina alcalina. Este último desvio do máximo de absorção na área visível provocou a necessidade do desenho de curvas de calibração de morin em vários valores de pH do meio (Figura 4A). As três curvas padrão caracterizadas por correlações lineares muito fortes foram comprovadas pelos altos valores dos coeficientes de regressão (R2 > 0,99) dentro da faixa de concentração de Morin Co = 2,5-100 μg/mL. Da mesma forma, as três curvas padrão de quercetina nos três compartimentos fisiológicos simulados, apresentadas na Figura 4B, mostraram alta linearidade dentro da mesma faixa de concentração.
Figura 3: Comparação dos espectros UV/Vis de soluções etanólicas de morina, soluções aquosas de lignina alcalina e misturas contendo morina e lignina com diferentes concentrações iniciais. Os espectros de lignina pura e morin não coincidem e o heteropolímero não exerce nenhuma influência disruptiva. A adição de lignina à morina leva ao deslocamento da absorção máxima de morin para um comprimento de onda mais alto, de λmax = 359 nm para λmax = 395 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Curvas de calibração de soluções de flavonóides etanólicos. (A) Morin e (B) quercetina dentro da faixa de concentração Co = 2,5-100 μg / mL em pH = 1,2 (em azul) (correspondendo ao fluido gástrico simulado), pH = 6,8 (em vermelho) (correspondendo ao fluido do intestino delgado simulado) e pH = 7,4 (em verde) (correspondendo ao fluido do cólon simulado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A concentração relativa de sítios ativos/grupos funcionais ácidos e básicos na superfície das partículas de lignina alcalina descarregadas e carregadas foi determinada por titulação potenciométrica. Os cálculos foram baseados nos volumes titulantes equivalentes determinados pelas curvas de titulação diferencial da segunda derivada (Figura 5). Os valores do pKa determinado, as concentrações dos grupos funcionais ácidos (forte, fraco, total) e o pH epH pzc das partículas micro e submicrônicas são apresentados na Tabela 1.
Figura 5: Curvas de titulação potenciométrica diferencial da segunda derivada das partículas micro/submicrométricas de lignina carregadas e carregadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetro | micropartículas de lignina | Micropartículas de lignina encapsuladas em morina | partículas submicrométricas de lignina | Partículas submicrométricas de lignina encapsuladas em quercetina |
| Veq., mL | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| pKa | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa (forte), mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa (fraco), mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa (total), mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH (suspensão aquosa) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| pHpzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
Tabela 1: Valores do volume equivalente de titulante (Veq), o logaritmo negativo de base -10 da constante de dissociação ácida (pKa), concentrações de grupos funcionais ácidos (fortes, fracos, totais) (Aa, mgeq/g), pH e ponto de carga zero (pHpzc) das partículas micro e submicrométricas de lignina carregadas e carregadas. As partículas de lignina micro e submicrométricas, descarregadas e carregadas com flavonóides são carregadas negativamente porque seu pH >pH pzc.
O conteúdo fenólico total (TPC), determinado pelo método colorimétrico de Folin-Ciocalteu modificado e calculado como equivalentes de ácido gálico, foi de 78,2 mg GAE/g das partículas de lignina descarregadas, enquanto o valor de TPC dos microcarreadores encapsulados em morina com a mesma concentração foi 2,3 vezes maior (183,43 mg GAE/g). Este último indica que as partículas de heterobiopolímero são enriquecidas com grupos fenólicos adicionais devido à incorporação das moléculas de flavonóides. A eficiência de encapsulação de flavonoides foi: 98,1% para morin e 97,6% para quercetina. As capacidades de encapsulação do fármaco foram de 28,2% para as micropartículas carregadas de morin e 39,0% para as partículas submicrônicas encapsuladas em quercetina.
A liberação cumulativa in vitro de morina e quercetina foi investigada em meios livres de enzimas gastrointestinais simulados: fluidos gástrico, intestinal pequeno e cólon em pH = 1,2, 6,8 e 7,4, respectivamente (Figura 6). A maior eficiência de liberação de aproximadamente 24% foi alcançada após 30-40 min em pH = 6,8. De acordo com os resultados experimentais, a quantidade do flavonoide liberado no meio do intestino delgado simulado prevaleceu o dobro da liberada no ambiente do cólon simulado e três vezes a eficiência de liberação determinada no estômago. A maior extensão de liberação de quercetina estabelecida no SIF em pH = 7,4 no70º ao 90ºmin foi de 34%, o que superou a liberação cumulativa do flavonoide em SGF (pH = 1,2) e SIF (pH = 6,8) em 23,5% e 18%, respectivamente.
Figura 6: Análises comparativas da eficiência cumulativa de liberação in vitro de morin e quercetina a partir de partículas micro e submicrométricas de lignina em meios fisiológicos simulados. A maior extensão de liberação de morin foi alcançada no meio simulado do intestino delgado. A maior eficiência de liberação de quercetina foi registrada no fluido do cólon simulado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Entre as principais questões críticas das modernas metodologias de síntese para o projeto de formulações de carreadores de fármacos à base de biopolímeros está a aplicação de reagentes orgânicos perigosos - solventes voláteis e inflamáveis, como tetrahidrofurano, acetona, metanol e até DMSO em altas concentrações - o que limita sua aplicabilidade na biomedicina, indústria farmacêutica e tecnologia de alimentos devido à manifestação de possíveis efeitos tóxicos20, 21,22,23,24. Outro ponto crucial é o envolvimento de reações químicas complicadas (por exemplo, esterificação, polimerização) ou aparelhos caros durante o procedimento de síntese. Ambas as técnicas apresentadas no presente manuscrito superam as últimas limitações pela implicação de solventes alternativos (água) e compostos não tóxicos, como surfactantes (Tween 80) e agentes de reticulação (etanol, ácido cítrico), classificando-os como métodos de síntese "verdes". Além disso, as metodologias oferecem uma solução que satisfaz a necessidade crítica e o desejo de desenvolver procedimentos baratos, ecologicamente corretos e sustentáveis para o projeto de partículas de lignina, servindo como modelos de transporte biodegradáveis, bioativos e biocompatíveis de substâncias fisiologicamente ativas25.
Para obter partículas de lignina com o tamanho desejado, foram escolhidas duas condições de produção: uma com alta concentração de lignina (50 g/L) e ácido nítrico como agente antissolvente e outra com menor concentração de lignina (5 g/L), etanol como antissolvente e ácido cítrico desempenhando um duplo papel de antissolvente e agente de reticulação simultaneamente, uma vez que essas foram as duas variáveis que influenciaram o tamanho das partículas de lignina. A taxa de fluxo durante ambos os procedimentos foi mantida baixa para fornecer partículas menores e evitar sua agregação. Existem alguns pontos críticos que devem ser considerados em relação à escolha dos ácidos inorgânicos e orgânicos para os protocolos de síntese.
O ácido nítrico foi escolhido por ser um ácido inorgânico forte, que oferece uma alta extensão de precipitação de lignina alcalina e, controlando a taxa de sua adição, pode-se obter partículas dentro da faixa de tamanho desejada. Além disso, espera-se que a adição de HNO3 possa proporcionar modificação das partículas de heteropolímero devido a prováveis alterações químicas da estrutura da lignina associadas a: processos de reações de nitração-substituição de átomos de H nos anéis de benzeno com grupos -NO2 ; esterificação de grupos alifáticos -OH e formação de grupos funcionais éster; e/ou oxidação dos grupos fenólicos -OH e -OCH3 , resultando na formação de estruturas de quinona. Em relação ao papel do precipitante e da concentração de lignina para o tamanho das partículas sintetizadas, por um lado, a maior concentração inicial de lignina combinada com a adição do ácido nítrico forte (pKa = -1,4) e a solubilidade limitada do heteropolímero alcalino no ácido inorgânico levaram à produção de partículas dentro da faixa de micrômetros. Por outro lado, a adição de etanol à solução aquosa de lignina alcalina com a menor concentração provoca a formação de uma suspensão fina devido à solubilidade parcial da lignina alcalina no álcool. Além disso, a adição subsequente de ácido cítrico levou à produção de partículas dentro da faixa nanométrica porque o ácido orgânico é mais fraco (pKa1 = 3,13) que o ácido nítrico, consequentemente oferecendo menor extensão de precipitação.
Algumas propriedades básicas dos produtos farmacêuticos nanométricos são a circulação de medicamentos, a liberação de medicamentos de formas farmacêuticas em locais específicos e a absorção através de membranas biológicas. Essas propriedades são consideravelmente influenciadas por algumas características físicas e químicas dos transportadores de nanopartículas e pelas moléculas encapsuladas do fármaco.
As características físico-químicas dos carreadores de biopolímeros: concentração de grupos ácidos e básicos tensoativos, ponto de carga zero (pHPZC), tamanho, distribuição granulométrica, bem como as características espectrais das partículas antes e após a incorporação da substância bioativa, são parâmetros essenciais que devem ser levados em consideração na avaliação dos grupos funcionais, reatividade, estabilidade e homogeneidade das partículas10.
Tamanho de partícula, distribuição de tamanho de partícula, carga e morfologia estão entre os principais fatores que afetam essas avaliações. O tamanho das partículas afeta sua estabilidade, reatividade e comportamento de liberação de drogas26. Partículas menores oferecem uma área de transferência de massa maior, o que leva a uma maior taxa de liberação do medicamento. Em contraste, a menor área de superfície de transferência de massa de partículas maiores resulta em uma menor taxa de difusão de drogas dentro dessas partículas.
A aplicação de métodos titulométricos como técnicas básicas para a determinação de sítios ácidos e básicos e grupos funcionais presentes em superfícies sólidas está em constante expansão. As principais vantagens da titulação potenciométrica incluem economia de tempo e trabalho, alta precisão e eliminação de padrões de referência e aparelhos caros. O método foi aplicado no presente estudo por permitir a caracterização de partículas de biopolímeros por meio da determinação qualitativa e semiquantitativa da natureza e do número de sítios ativos presentes na superfície de carreadores de biopolímeros carregados e descarregados27.
A carga superficial de micro / nano transportadores biológicos e médicos desempenha um papel importante na absorção celular28. O pHPZC corresponde à densidade de carga superficial zero, ou seja, a quantidades equivalentes de cargas negativas e positivas desenvolvidas pelo equilíbrio de prótons. A determinação destes valores fornece informações sobre a especificidade da adsorção29. No entanto, como o parâmetro ponto isoelétrico representa apenas as cargas superficiais externas das partículas em suspensão, enquanto o ponto de carga zero varia em resposta à carga superficial líquida total (externa e interna) das partículas, o protocolo de pHpzc foi aplicado pela primeira vez no presente estudo como um método simples e eficaz para caracterização de biopolímeros carreadores. De acordo com o conceito de pHpzc, em pH acima do pHpzc, a superfície das partículas do biopolímero é predominantemente carregada negativamente, enquanto uma carga líquida positiva é observada quando o pH da suspensão é inferior ao pHpzc. A partir dos dados experimentais apresentados na Tabela 1, pode-se concluir que as partículas de lignina micro e submicrométricas, não carregadas e carregadas com flavonóides são carregadas negativamente porque seu pH > pHpzc.
A eficiência do carregamento de flavonóides é influenciada pela eficiência de encapsulação e capacidade de carregamento de medicamentos. A eficiência de encapsulação (E, %) é definida como a razão entre a quantidade do medicamento incorporado nas partículas e a quantidade total na formulação. A eficiência de encapsulação é influenciada pelas características do medicamento, do solvente e do transportador30.
A entrega eficiente de uma substância fisiologicamente ativa, no entanto, depende da maneira e extensão em que suas moléculas são liberadas da matriz transportadora. Assim, é muito importante considerar o mecanismo de liberação do fármaco e a taxa de liberação 31,32,33. Ao elucidar o mecanismo de liberação in vitro de bioflavonóides de seus micro/nanocarreadores biopoliméricos, pode-se simular e prever o comportamento do flavonóide e do carreador em um meio fisiológico real e otimizar o design de formulações farmacêuticas com biodisponibilidade aprimorada. Os resultados experimentais in vitro obtidos neste estudo são úteis para a prática clínica, pois comprovam que, devido à menor extensão da liberação de morina/quercetina da lignina submicrônica e micropartículas no ambiente gástrico, as partículas inovadoras de biopolímero são adequadas para administração oral devido ao menor risco de irritação gástrica em comparação com a administração oral direta das substâncias bioativas. As micropartículas de biopolímero inovadoras são adequadas para administração oral devido ao menor risco de irritação gástrica em comparação com a administração oral direta das substâncias bioativas. Além disso, as partículas submicrométricas, devido ao seu pequeno tamanho e potencial de liberação significativo, podem ser aplicadas como formulações injetáveis. Além disso, os novos transportadores micro e submicrométricos de lignina oferecem uma oportunidade para superar as limitações relatadas por outros cientistas relacionadas às dificuldades associadas à administração oral de altas doses de certos bioflavonóides, resultantes de sua tendência a formar soluções saturadas no trato intestinal, o que por sua vez dificulta o processo de dissolução e sua reabsorção eficiente.
A facilidade de síntese, a biocompatibilidade das partículas resultantes, bem como a possibilidade de customização do protocolo atual, representam as principais vantagens da metodologia apresentada. O tamanho das partículas é ideal para as aplicações pretendidas, oferecendo área de superfície suficiente disponível para fixações de porções terapêuticas e direcionadas, o que, por sua vez, não requer que mais partículas sejam administradas para atingir os requisitos de dosagem alvo. O uso da lignina como matriz heteropolimérica básica para a síntese de partículas inovadoras permite o aumento da biocompatibilidade e oferece vários grupos funcionais ativos apresentando oportunidades de customização das partículas para diversas aplicações.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Fundo Científico da Bulgária sob o Contrato nº KΠ-06 H59/3 e pelo Projeto Científico nº 07/2023 FVM, Universidade de Trakia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
References
- Yu, X., et al. Lignin nanoparticles with high phenolic content as efficient antioxidant and sun-blocker for food and cosmetics. ACS Sustainable Chem. Eng. 11 (10), 4082-4092 (2023).
- Boarino, A., Klok, H. -A. Opportunities and challenges for lignin valorization in food packaging, antimicrobial, and agricultural applications. Biomacromolecules. 24 (3), 1065-1077 (2023).
- Aadil, K., Barapatre, A., Jha, H. Synthesis and characterization of Acacia lignin-gelatin film for its possible application in food packaging. Bioresour. Bioprocess. 3 (27), 1-11 (2016).
- Sharma, S., et al. Valorization of lignin into nanoparticles and nanogel: characterization and application. Bioresour. Technol. Reports. 18, 101041 (2022).
- Zadeh, E. M., O'Keefe, S. F., Kim, Y. -T.
- Beaucamp, A., et al. Lignin for energy applications - state of the art, life cycle, technoeconomic analysis and future trends (Critical Review). Green Chem. 24, 8193-8226 (2022).
- Antunes, F., et al. From sugarcane to skin: Lignin as a multifunctional ingredient for cosmetic application. Int J Biol Macromol. 234, 123592 (2023).
- Garg, J., et al. Applications of lignin nanoparticles for cancer drug delivery: An update. Materials Letters. 311, 131573 (2022).
- Anushikha, K. K. Lignin as a UV blocking, antioxidant, and antimicrobial agent for food packaging applications. Biomass Conv. Bioref. , 1-14 (2023).
- Freitas, F. M. C., et al. synthesis of lignin nano- and micro-particles: Physicochemical characterization, bioactive properties and cytotoxicity assessment. Int J Biol Macromol. 163, 1798-1809 (2020).
- Rismawati, R., Nurdin, I. A., Pradiptha, M. N., Maulidiyah, A., Mubarakati, N. J. Preparation and characterization of lignin nanoparticles from rice straw after biosynthesis using Lactobacillus bulgaricus. Journal of Physics: Conference Series. 9th International Seminar on New Paradigm and Innovation of Natural Sciences and its Application. 1524, 012070 (2020).
- Worku, L. A., et al. Synthesis of lignin nanoparticles from Oxytenanthera abyssinica by nanoprecipitation method followed by ultrasonication for the nanocomposite application. Journal of King Saud University - Science. 35 (7), 102793 (2023).
- Gala Morena, A., Tzanov, T. z Antibacterial lignin-based nanoparticles and their use in composite materials. Nanoscale Adv. 4, 4447-4469 (2022).
- Ivanova, D., Nikolova, G., Karamalakova, Y., Marutsova, V., Yaneva, Z. Water-soluble alkali lignin as a natural radical scavenger and anticancer alternative. Int J Mol Sci. 24 (16), 12705 (2023).
- Ivanova, D., Toneva, M., Simeonov, E., Antov, G., Yaneva, Z. Newly synthesized lignin microparticles as bioinspired oral drug-delivery vehicles: Flavonoid-carrier potential and in vitro radical-scavenging activity. Pharmaceutics. 15 (4), 1067 (2023).
- Yaneva, Z., et al. Antimicrobial potential of conjugated lignin/morin/chitosan combinations as a function of system complexity. Antibiotics. 11, 650 (2022).
- Handral, H. K., Wyrobnik, T. A., Lam, A. T. -L. Emerging trends in biodegradable microcarriers for therapeutic applications. Polymers. 15 (6), 1487 (2023).
- Figueiredo, P., Lintinen, K., Hirvonen, J. T., Kostiainen, M. A., Santos, H. A. Properties and chemical modifications of lignin: Towards lignin-based nanomaterials for biomedical applications. Prog. Mater. Sci. 93, 233-269 (2018).
- Tang, Q., et al. Lignin-based nanoparticles: a review on their preparations and applications. Polymers. 12 (11), Basel. 2471 (2020).
- Zhao, W., Simmons, B., Singh, S., Ragauskas, A., Cheng, G. From lignin association to nano-/micro-particle preparation: extracting higher value of lignin. Green Chemistry. 18 (21), 5693-5700 (2016).
- Stewart, H., Golding, M., Matia-Merino, L., Archer, R., Davies, C. Manufacture of lignin microparticles by anti-solvent precipitation: Effect of preparation temperature and presence of sodium dodecyl sulfate. Food Res Int. 66, 93-99 (2014).
- Beisl, S., Friedl, A., Miltner, A. Lignin from micro- to nanosize: Applications. Int. J. Mol. Sci. 18, 2367 (2017).
- Mishra, P. K., Ekielski, A. A simple method to synthesize lignin nanoparticles. Colloids Interfaces. 3, 52 (2019).
- Qian, Y., Deng, Y., Qiu, X., Li, H., Yang, D. Formation of uniform colloidal spheres from lignin, a renewable resource recovered from pulping spent liquor. Green Chem. 16, 2156-2163 (2014).
- Tardy, B. L., et al. Lignin nano- and microparticles as template for nanostructured materials: formation of hollow metal-phenolic capsules. Green Chem. 20, 1335-1344 (2018).
- Silva, M., et al. Paraquat-loaded alginate/chitosan nanoparticles: preparation, characterization and soil sorption studies. J Haz Mat. 190 (1-3), 366-374 (2011).
- Georgieva, N., Yaneva, Z. Comparative evaluation of natural and acid-modified layered mineral materials as rimifon-carriers using UV/VIS, FTIR, and equilibrium sorption study. Cogent Chem. 1 (1), 1-16 (2015).
- Zhang, P., Chen, D., Li, L., Sun, K. Charge reversal nano-systems for tumor therapy. J Nanobiotechnol. 20, 31 (2022).
- Yaneva, Z. L., Georgieva, N. V. Removal of diazo dye from the aqueous phase by biosorption onto ball-milled maize cob (BMMC) biomass of Zea mays. Maced. J. Chem. Chem. Eng. 32 (1), 133-149 (2013).
- Zatorska, M., et al. Drug-loading capacity of polylactide-based micro- and nanoparticles - Experimental and molecular modeling study. Int J Pharmaceutics. 591, 120031 (2020).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Chapter 5 - Physicochemical and morphological characterization of pharmaceutical nanocarriers and mathematical modeling of drug encapsulation/release mass transfer processes. Nanoscale Fabrication, Optimization, Scale-Up and Biological Aspects of Pharmaceutical Nanotechnology. Grumezescu, A. M. , William Andrew Publishing. 173-218 (2018).
- Yaneva, Z., Georgieva, N., Staleva, M. Development of d,l-α-tocopherol acetate/zeolite carrier system: equilibrium study. Monatshefte fur Chemie Chemical Monthly. 147 (7), 1167-1175 (2016).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Study on the physical chemistry, equilibrium, and kinetic mechanism of Azure A biosorption by Zea mays biomass. Journal of Dispersion Science and Technology. 35 (2), 193-204 (2014).
